胡雪郢,薛豐
(重慶市渝中區(qū)疾病預(yù)防控制中心,重慶 400010)
β-受體激動劑(俗稱為瘦肉精),曾被用作牛、羊等畜禽的飼料添加劑,其能夠促進(jìn)動物體蛋白質(zhì)沉積、加快脂肪分解,顯著提高脂肪性動物的高飼料轉(zhuǎn)化率(廋肉率)[1],但是科學(xué)知識缺乏和經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使,導(dǎo)致不規(guī)范、不合理使用瘦肉精的現(xiàn)象普遍存在。藥物濫用會導(dǎo)致藥物在動物體內(nèi)滯留和蓄積,并以殘留的方式進(jìn)入人體以及生態(tài)壞境中。誤食含瘦肉精的肉類后,會出現(xiàn)頭暈、惡心、手腳顫抖、心跳加速甚至心臟驟停,甚致昏迷死亡,對心律失常、高血壓、青光眼、糖尿病和甲狀腺機能亢進(jìn)等患者有極大危害[2]。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和食品貿(mào)易國際化,食品安全已經(jīng)成為一個世界性的公共衛(wèi)生問題,而動物源食品違禁藥物殘留成為全世界關(guān)注的焦點[3–4]。為確保食品安全,我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的193號公告中明確規(guī)定了動物性食品中不得檢出β-受體激動劑類藥物。
目前,β-受體激動劑殘留的檢測方法主要有發(fā)光法[5–7],氣相色譜法[8–10]和質(zhì)譜法[11–22]。發(fā)光法屬于快檢方法,其操作簡單,成本低,但特異性差,靈敏度較低,目前只作為應(yīng)急快檢手段和初篩方法;氣相色譜法測定需要進(jìn)行樣品衍生化處理,操作煩瑣、結(jié)果重現(xiàn)性、可靠性較差,且靈敏度較低,僅能依靠保留時間來進(jìn)行定性和定量分析等;質(zhì)譜法通過測定質(zhì)核比對物質(zhì)進(jìn)行定量分析,其特異性和靈敏度較好,氣相色譜–質(zhì)譜法[11–12]應(yīng)用于瘦肉精殘留的測定,與單純氣相色譜法相比,其特異性有所提高,但仍需要對樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)。液相色譜–質(zhì)譜法(LC–MS/MS)[13–21]因其靈敏度高、分離性好且操作簡便、無需衍生化反應(yīng)等優(yōu)勢,成為獸藥殘留檢測的首選方法。
肉類食品中獸藥殘留的檢測主要面臨兩方面的挑戰(zhàn):(1)獸藥原型進(jìn)入動物體內(nèi)會發(fā)生代謝反應(yīng),生成一系列的代謝產(chǎn)物,導(dǎo)致原藥檢測結(jié)果的假陰性;(2)動物組織以及內(nèi)臟中含有大量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì),它們性質(zhì)、含量各異,尤其是大量飽和與非飽和脂肪酸的存在,使得樣品基質(zhì)效應(yīng)增強;即便通過內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線[13,21]或者基質(zhì)曲線來減輕基質(zhì)效應(yīng),也會對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性產(chǎn)生較大影響,甚至導(dǎo)致方法檢出限無法達(dá)到限量值要求。
因此,建立高效、快捷的肉類樣品中復(fù)雜脂質(zhì)去除前處理方法,是肉類樣品檢測函待解決的問題。目前,肉類食品中瘦肉精殘留檢測的前處理方法主要包括:固相萃取(SPE)法[9–10,14–18]和傳統(tǒng)基質(zhì)分散固相萃?。≦uEChERS)[19–21]法,后者操作簡單、快捷,通用性強,已應(yīng)用于蔬菜、水果、水產(chǎn)品等樣品中農(nóng)殘和獸殘的測定,但是對于肉類基質(zhì)而言,其脂類凈化能力有限,不僅無法有效降低基質(zhì)效應(yīng),且在大量樣本分析過程中,脂質(zhì)還會導(dǎo)致色譜和質(zhì)譜系統(tǒng)發(fā)生污染和堵塞,因此,使用新型脂質(zhì)特異性吸附材料(如免疫親和萃取法),成為解決此類問題有效途徑之一。已有文獻(xiàn)報道,將脂質(zhì)特異性吸附材料用于水產(chǎn)品、烘焙食品中抗生素[22]、抗氧化劑[23]、真菌毒素[24]以及牛肉中多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測[25],尚未發(fā)現(xiàn)在高脂肪含量的豬肉和豬肝樣品中β-受體激動劑殘留的檢測的相關(guān)報道。筆者采用脂質(zhì)特異性吸附EMR–Lipid QuEChER法,結(jié)合超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC–MS/MS),建立肉類食品中4類β-受體激動劑殘留的檢查方法,并與已有混合陽離子交換(MCX)固相萃取法進(jìn)行對比,結(jié)果證明,脂質(zhì)特異性EMR–Lipid QuEChER方法能夠更為有效的去除肉類樣品中的脂質(zhì)成分,降低基質(zhì)效應(yīng),重復(fù)性好,能夠滿足日常檢測工作需求。
高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀:Dionex UltiMate 3000/AB Sciex 3200 Qtrap型,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。
全自動固相萃取儀:GX–274型,美國吉爾森公司。
恒溫震蕩培養(yǎng)箱:ZWY–100H型,上海智城分析儀器制造有限公司。
高速冷凍離心機:AvantiJ–26XP型,美國貝克曼庫爾特公司。
電子天平:BL310型,感量值為0.01 g,德國賽多利斯公司。
電子天平:XSR204/AC型,感量值為0.1 mg,梅特勒–托利多國際有限公司。
氮吹儀:N–EVAP型,美國Organomation公司。
渦旋混勻儀:VORTEX 3型,艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。
增強型脂質(zhì)去除分散SPE管:Bond Elut EMR–Lipid型,美國安捷倫科技公司。
β-葡萄糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸脂酶:純度為99%,德國默克公司。
尼龍濾膜:0.22 μm,德國默克公司。
甲醇、甲酸:質(zhì)譜純,美國賽默飛世爾科技有限公司。
乙酸–乙酸鈉緩沖溶液:優(yōu)級純,0.2 mol/L,pH 5.2,美國希格瑪公司。
氨水:優(yōu)級純,美國賽默飛世爾科技有限公司。
實驗用水為超純水,電阻率大于18 MΩ·cm,由Mili–Q超純水系統(tǒng)純化制得。
4種β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)品以及對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品基本信息見表1。
表1 4種β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)品以及對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品
一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別取4種β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL于10 mL容量瓶中,用50%甲醇溶液稀釋定容,得到一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,4種β-受體激動劑的質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL。
二級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確吸取一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL,用50%甲醇稀釋至1 mL,得到二級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,4種β-受體激動劑的質(zhì)量濃度均為100 ng/mL。
內(nèi)標(biāo)儲備液:分別用1 mL 50%甲醇溶解1.00 mg D6-萊克多巴胺、1.00 mg D3-沙丁胺醇和1.00 mg D9-特布他林,得到質(zhì)量濃度均為1.00 mg/mL的D6-萊克多巴胺、D3-沙丁胺醇、D9-特布他林的內(nèi)標(biāo)儲備液。用2.13 mL 50%甲醇溶解2.40 mg D9-鹽酸克倫特羅,配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的D9-鹽酸克倫特羅內(nèi)標(biāo)儲備液。其中,D9-鹽酸克倫特羅的質(zhì)量濃度以D9-克倫特羅計,換算系數(shù)為88.8%。
混合內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液:分別取4種同位素內(nèi)標(biāo)儲備液各10 μL于10 mL容量瓶中,用50%甲醇溶液稀釋定容,得到4種同位素內(nèi)標(biāo)混合應(yīng)用液,質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL。
內(nèi)標(biāo)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別準(zhǔn)確吸取二級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、20、50 μL,以及一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10、30、50 μL,分別加入30 μL內(nèi)標(biāo)混合應(yīng)用液,再用超純水稀釋至1 mL,混勻。4種化合物標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度依次為:0.5、1.0、2.0、5.0、10、30、50 ng/mL;4種內(nèi)標(biāo)化合物的濃度均為30.0 ng/mL。
1.3.1 色譜條件
色譜柱:Welch Xtimate C18型柱[100 mm×2.1 mm,3 μm,月旭科技(上海)股份有限公司];柱溫:40 ℃;流量:300 μL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;流動相:A相為0.1%甲酸,B相為甲醇,梯度洗脫程序列于表2。
表2 梯度洗脫程序
1.3.2 質(zhì)譜條件
電離方式:ESI+;噴霧電壓:5 000 V;離子源溫度:500 ℃;霧化氣(Gas l)流量:50 mL/min;輔助加熱氣(Gas 2)流量:50 mL/min;氣簾氣流量:25 mL/min;碰撞氣流量:6 mL/min;監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。
1.4.1 樣品提取
稱取5 g(精確到0.01 g)粉粹的樣品于50 mL離心管中,加入30 μL 1.0μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液,再加入15 mL 0.2 mol/L pH 5.2乙酸–乙酸鈉緩沖溶液,均質(zhì)器勻漿后,再加入100 μLβ-葡萄糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸脂酶,于(37±1)℃震蕩酶解過夜,然后于4 ℃以12 000 r/min離心10 min,取上清液待凈化。
1.4.2 樣品凈化
(1)混合型強陽離子交換反相吸附(MCX)固相萃取法。取Oasis MCX型固相萃取小柱[(150 mg)/3 mL,美國沃特世公司],經(jīng)40 mmol/L HCl水溶液活化后,取上清液全部上樣,分別用5 mL水和甲醇淋洗,再用6 mL 5%氨水–甲醇分3次洗脫,每次2 mL。合并洗脫液,經(jīng)氮氣吹干后,用甲醇–0.1%甲酸(5∶95)定容至1.0 mL,用0.22 μm濾膜過濾,采用UPLC–MS/MS法測定。
(2)增強型脂質(zhì)去除(EMR–Lipid QuEChERS)法。移取上清液至EMR–Lipid d-SPE管中,然后加入等體積的甲醇,立即渦旋混合使樣品分散,渦旋60 s后以5 000 r/min離心3 min,移取5 mL上清液至含有2 g 鹽(氯化鈉與硫酸鎂質(zhì)量比為1∶4)的15 mL EMR–Lipid Polish管中,漩渦混合1 min后,以5 000 r/min離心3 min ,上清液經(jīng)氮氣吹干后,用甲醇–0.1%甲酸(5∶95)定容至1.0 mL,用0.22 μm濾膜過濾,采用UPLC–MS/MS法測定。4種β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1,其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖2。
圖1 4種β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)色譜圖
圖2 4種β-受體激動劑同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖
藥物進(jìn)入動物體內(nèi),會經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)之后排出體外,反應(yīng)中將生成一系列的代謝產(chǎn)物,由于藥物理化性質(zhì)的差異以及作用位點不同,其代謝場所各異,其中參與藥物代謝比較活躍的組織器官包括腸道、肝臟、腎臟以及肌肉組織。本研究通過體外培養(yǎng)模擬肝臟和肌肉組織中4種β-受體激動劑的代謝反應(yīng),研究4種化合物在上述動物組織中的存在形式。
稱取5.0 g新鮮豬肉和豬肝各兩份,設(shè)置實驗組和對照組,每組含豬肉和豬肝樣品各1份;均加入1 mL 50 ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,實驗組培養(yǎng)過程中不加入β-葡萄糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸脂酶,對照組則完全按照1.4.1標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作,培養(yǎng)完成后所有樣品按照1.4.2(1)方法進(jìn)行樣品凈化后測定。結(jié)果表明,4種化合物在豬的肌肉和肝臟中幾乎都以化合物原型存在。
將一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)應(yīng)用液等體積混合,通過針泵直接進(jìn)樣方式,對每種化合物的母離子和子離子進(jìn)行選擇,同時分別優(yōu)化其質(zhì)譜采集參數(shù):碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)和碰撞池出口電壓(CXP),優(yōu)化結(jié)果列于表3。
表3 4種β-受體激動劑及其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)監(jiān)測離子、質(zhì)譜參數(shù)
動物組織樣品進(jìn)行分析時,大量脂質(zhì)的存在是干擾分析結(jié)果準(zhǔn)確性的主要原因。動物所含脂質(zhì)的分子量較大(含碳原子數(shù)≥6),且多為直鏈結(jié)構(gòu),支鏈較少,EMR–Lipid QuEChERS中的脂質(zhì)特異性吸附填料通過其自身特殊的多孔構(gòu)象,能夠?qū)﹂L直鏈脂肪進(jìn)行基于空間位阻理論的特異性吸附。本研究以1.4.2中混合型強陽離子交換反相吸附(MCX)固相萃取法為參照,與EMR–Lipid QuEChERS法進(jìn)行比較,通過相同基質(zhì)(肌肉組織和肝臟)提取液進(jìn)行凈化處理,對樣液進(jìn)行一級質(zhì)譜(MS1)100~850m/z質(zhì)量范圍內(nèi)全掃描分析。結(jié)果表明,選擇C18填料的色譜柱、0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動相的色譜分離體系中,脂質(zhì)的保留能力較強,其色譜流出時間位于流動相中有機相比例較高的時間段(5~7 min),在此時間段內(nèi),經(jīng)MCX處理的樣液中有明顯雜質(zhì)色譜峰出現(xiàn)。與MCX法相比,EMR–Lipid QuEChERS法對豬肉以及豬肝中脂質(zhì)去除效果更好。
為了盡量減少基質(zhì)效應(yīng)的影響,采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量,以4種β-受體激動劑類藥物的色譜峰面積(x)為橫坐標(biāo),質(zhì)量濃度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)信噪比S/N=3計算方法的檢出限。各化合物線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表4。結(jié)果表明,4種化合物的質(zhì)量濃度在0.5~50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.997,檢出限均為0.1 μg/kg。
表4 4種β-受體激動劑類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限
取經(jīng)過檢測的空白新鮮豬肉和豬肝樣品,選取2.0、5.0、10.0 ng/kg 3個加標(biāo)水平,每個濃度水平平行測定6次,按照1.4.2(2)中優(yōu)化的實驗方法進(jìn)行分析,計算目標(biāo)化合物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果列于表5和表6。由表5和表6可知,4種β-受體激動劑在豬肉基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為79.8%~92.3%,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.95%~9.50%;在豬肝中的加標(biāo)回收率為81.5%~95.6%,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.47%~8.05%。表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,滿足日常檢測需求。
表5 4種β-受體激動劑類在豬肉樣品中加標(biāo)回收試驗結(jié)果
表6 4種β-受體激動劑類在豬肝樣品中加標(biāo)回收試驗結(jié)果
將本研究所建立的脂質(zhì)特異性基質(zhì)分散(EMR–Lipid QuEChERS)凈化結(jié)合超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法對市售的34個肉類樣品(包括豬肉、豬肝、雞肉、牛肉、魚肉5個大類)進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)未檢出克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林的違法添加。
脂質(zhì)特異性基質(zhì)分散(EMR–Lipid QuEChERS)凈化法用于肉類樣本中脂質(zhì)的去處,采用類似QuEChERS標(biāo)準(zhǔn)樣品前處理流程,相比傳統(tǒng)固相萃取法,操作更加簡便、靈活和快捷,且脂質(zhì)去處效果也更好,結(jié)合超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法的高特異性和靈敏度,能夠滿足日常工作中獸藥殘留的檢測工作。由于EMR–Lipid QuEChERS能夠特異性得吸附脂質(zhì)(尤其是含6個C以上的長鏈脂肪),而非對待測物進(jìn)行吸附和富集,因此,此法也可應(yīng)用于其他高油脂樣品中脂質(zhì)的去除,從而降低機制效應(yīng)的干擾,提高目標(biāo)化合的檢出限以及定量準(zhǔn)確性。