周素芹, 魏蘊(yùn)哲, 汪 昕, 薛 永, 茆 平

(1. 淮陰工學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2. 淮安市第三人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 淮安 223001)

自1930年，德國(guó)的Windaus確定維生素D的結(jié)構(gòu)以來(lái)，科研人員對(duì)于維生素D的研究從未間斷[1-5]，對(duì)維生素D在人體中的產(chǎn)生、運(yùn)輸、作用以及代謝機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。維生素D是類固醇激素家族的一員，主要有維生素D2[麥角骨化醇，9,10-開(kāi)環(huán)麥角甾-5,7,10(19),22-四烯-3β-醇]、維生素D3[膽骨化醇，9,10-開(kāi)環(huán)膽甾-5,7,10(19)-三烯-3β-醇]、維生素D4(22,23-二氫麥角鈣化醇)和維生素D5[(5Z,7E)-9,10-開(kāi)環(huán)豆甾-5,7,10(19)-三烯-3β-醇]，其分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 維生素D分子結(jié)構(gòu)

維生素D因其在促進(jìn)鈣吸收，維持適當(dāng)?shù)拟}、磷濃度中發(fā)揮重要作用而被大眾熟知。然而，其在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和代謝激素的過(guò)程中同樣扮演著重要的角色，它能夠修飾多種基因編碼的蛋白質(zhì)以及調(diào)節(jié)部分細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程，改善神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平，維持神經(jīng)元密度，從而起到保護(hù)神經(jīng)的作用[6]。此外，維生素D還能夠影響神經(jīng)傳遞和突觸的可塑性[7]。人體血清中的維生素D主要以維生素D3的形式存在。它可以通過(guò)膳食攝入或由皮膚中的7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射轉(zhuǎn)變而來(lái)，在空腸和回腸與脂肪一起被吸收后，與乳糜微粒一同由淋巴系統(tǒng)運(yùn)輸或由維生素D運(yùn)輸?shù)鞍?α-球蛋白部分)在血漿中運(yùn)輸。當(dāng)其被運(yùn)送至肝臟后，在25-羥化酶作用下，代謝生成25-羥基維生素D3。這一物質(zhì)通常被作為測(cè)量維生素D狀態(tài)的前激素。當(dāng)人體缺乏維生素D時(shí)，25-羥基維生素D3在甲狀腺素的作用下經(jīng)腎臟進(jìn)一步代謝成具有生物活性的1,25-二羥基維生素D3[8]。維生素D在人體中的代謝機(jī)理見(jiàn)圖2。

圖2 維生素D在人體中的代謝機(jī)理

維生素D的生物學(xué)行為離不開(kāi)維生素D受體(VDR)的介導(dǎo)[9]。VDR是一類親核蛋白，屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員。由腎臟代謝產(chǎn)生的1,25-二羥基維生素D3激素信號(hào)分子在靶細(xì)胞與VDR結(jié)合后會(huì)形成一種受體復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物作用于靶基因上特定的DNA序列時(shí)，它能夠調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。研究證明，VDR普遍存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞乃至整個(gè)大腦、脊髓和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，這也預(yù)示著維生素D缺乏將會(huì)使得神經(jīng)系統(tǒng)的失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致精神分裂癥等精神疾病發(fā)病率的提高[10]。本文概述了近年來(lái)關(guān)于維生素D與精神分裂癥關(guān)聯(lián)性的研究以及維生素D常用的檢測(cè)方法，為后續(xù)進(jìn)一步研究二者聯(lián)系提供參考依據(jù)。

1 維生素D與精神分裂癥之間的關(guān)聯(lián)性

精神分裂癥是一種以一系列顯著的精神和行為障礙為特征的精神疾病，有著較高的致殘率。其臨床癥狀包括：陽(yáng)性癥狀(幻覺(jué)、妄想等)和陰性癥狀(情感淡漠、意志缺乏等)以及認(rèn)知能力低下等。2014年，Clelland等[11]比較了64例精神分裂癥患者與90名健康人對(duì)照組的空腹血清中25-羥基維生素D [25(OH)D]的含量，結(jié)果表明，精神分裂癥患者血清中的25(OH)D水平顯著低于對(duì)照組，并且經(jīng)分析得出25(OH)D的缺乏與精神分裂癥具有相關(guān)性。此外，臨床上觀察性研究表明，維生素D缺乏的人患精神分裂癥的發(fā)病率是正常人的2.16倍，這項(xiàng)研究同樣證明了缺乏維生素D與精神分裂癥之間有著重要的聯(lián)系[12]。隨后，Shivakumar等[13]研究了未服用抗精神病藥物的精神分裂癥患者血清中維生素D水平與其海馬灰質(zhì)體積之間的聯(lián)系(35例)，應(yīng)用25-羥基維生素D免疫法測(cè)定患者血清中的維生素D含量，并采用形態(tài)計(jì)量學(xué)方法分析患者的海馬灰質(zhì)3-Tesla磁共振成像(MRI)圖像(切片厚度1 mm)。根據(jù)精神分裂癥患者血清中25(OH)D水平與海馬灰質(zhì)的體積的成正相關(guān)，發(fā)現(xiàn)97%的精神分裂癥患者缺乏維生素D。2017年，Salavert[14]對(duì)45例精神病首次發(fā)病的患者和22例相同年齡的健康對(duì)照者血清中的25-羥基維生素D進(jìn)行檢測(cè)，將這45名患者分為精神分裂癥患者(22例)和其他精神病患者(23例)兩類，發(fā)現(xiàn)這些患者普遍缺乏維生素D，特別是其中22例精神分裂癥患者。不久后，Eyles等發(fā)現(xiàn)新生兒缺乏維生素D會(huì)導(dǎo)致后期患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)顯著增大。對(duì)于那些在干血斑檢測(cè)中測(cè)出25-羥基維生素D含量低于20.4 nmol/L(符合維生素D缺乏的標(biāo)準(zhǔn)定義)的新生兒，患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)增加了44%。此外，新生兒血清中的25-羥基維生素D濃度與出生時(shí)其母親血清中的25-羥基維生素D濃度高度相關(guān)。因此，認(rèn)為母親在懷孕期間缺乏維生素D會(huì)增大子代患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)[15,18]。2019年，Yazici等[16]討論了維生素D與精神分裂癥之間的關(guān)聯(lián)性以及補(bǔ)充維生素D對(duì)治療精神分裂癥的作用，認(rèn)為雖然現(xiàn)有的觀察性研究結(jié)論支持維生素D與精神分裂癥之間存在潛在聯(lián)系，但在臨床試驗(yàn)中還沒(méi)有足夠高質(zhì)量的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)深入探究維生素D與精神分裂癥之間的關(guān)聯(lián)度及其在治療過(guò)程中的有效性和安全性。

影響精神分裂癥發(fā)生的另一個(gè)重要因素就是環(huán)境因素，如出生的季節(jié)、生活緯度等。人體25(OH)D水平的主要來(lái)源是皮膚受紫外線照射后的生物合成。因此，皮膚在陽(yáng)光下的暴露時(shí)間對(duì)個(gè)體的維生素D水平有顯著的影響。調(diào)查顯示精神分裂癥患者中的大多數(shù)出生于冬末早春的季節(jié)，因?yàn)樵谄洚a(chǎn)前和圍產(chǎn)期時(shí)處于較低水平的光照條件下，導(dǎo)致維生素D的缺乏[17-18]。Deluca等[19]發(fā)現(xiàn)位于遠(yuǎn)離赤道緯度的地區(qū)的精神分裂癥發(fā)病率和患病率在逐漸增加。生活在高緯度地區(qū)且膚色較深的人更容易患精神分裂癥[20]。美國(guó)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)黑人育齡婦女患有嚴(yán)重維生素D缺乏癥的人數(shù)約為白人育齡婦女的10倍[21]。

理解維生素D缺乏對(duì)精神分裂癥的影響機(jī)制，對(duì)于探究二者關(guān)聯(lián)性具有重要意義。維生素D作為一種有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)脯氨酸脫氫酶的表達(dá)。脯氨酸脫氫酶基因位于染色體22q11，此區(qū)域是目前已知精神分裂癥遺傳風(fēng)險(xiǎn)最高的區(qū)域。高脯胺酸血癥已經(jīng)被證明與認(rèn)知能力低下、分裂性情感障礙以及精神分裂癥有著密切聯(lián)系。Clelland等[11]研究發(fā)現(xiàn)維生素D不足的人患有高脯胺酸血癥的幾率是維生素D正常者的3倍。此外，精神分裂癥患者通常會(huì)患有一些其他代謝類疾病如肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、高脂血癥和心血管疾病等。眾所周知，維生素D缺乏與這些代謝問(wèn)題也有著重要的聯(lián)系。其生物學(xué)機(jī)制很可能與維生素D對(duì)炎癥和免疫過(guò)程調(diào)節(jié)作用有關(guān)，從而影響精神分裂癥臨床癥狀的表現(xiàn)和治療反應(yīng)[22-23]。一些研究者提出利用維生素D調(diào)節(jié)患者的免疫過(guò)程與精神分裂癥的治療反應(yīng)有一定的關(guān)聯(lián)性。Muller等[24-26]測(cè)試了維生素D結(jié)合抗炎藥物用于治療精神分裂癥患者的效果，研究結(jié)果表明抗炎藥物“塞來(lái)昔布”與抗精神分裂癥藥物“利培酮”協(xié)同作用于急性發(fā)作期精神分裂癥患者能夠顯著降低其在精神病理學(xué)中PANSS的評(píng)分。

為深入探究維生素D與精神分裂癥之間的關(guān)聯(lián)性，精準(zhǔn)、高效的檢測(cè)是必不可少的。維生素D在人體中經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)，最終以生物活性最強(qiáng)的1,25-二羥基維生素D的形式作用于生理活動(dòng)，然而25-羥基維生素D(25-(OH)D)是維生素D在人體代謝循環(huán)中的主要形式，因此常作為評(píng)價(jià)體內(nèi)維生素D營(yíng)養(yǎng)水平的指標(biāo)[27]。

2 維生素D水平的檢測(cè)

目前常用的檢測(cè)方法按照檢測(cè)原理可分成免疫法和色譜法兩大類。其中免疫法主要包括放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(ECLIA)和全自動(dòng)生化法(ABA)。色譜法主要包括高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。多數(shù)文獻(xiàn)中25-(OH)D檢測(cè)所用的生物樣本為血清，還有血漿、干血點(diǎn)、唾液、母乳、動(dòng)物內(nèi)臟(肝、腎、脾)等其他樣本[28]。目前，對(duì)于血清中25(OH)D濃度的檢測(cè)仍存在一定技術(shù)挑戰(zhàn)，包括：(1) 血液中的維生素D通常與結(jié)合蛋白(VDBP)結(jié)合，須先將其從結(jié)合蛋白上解離；(2) 需利用抗體或重組結(jié)合蛋白重新捕獲25-羥基維生素D，并排除其它形式的干擾；(3) 需除去樣本中VDBP及其它抗體的干擾；(4) 需排除差向異構(gòu)體的干擾[29]；(5) 檢測(cè)方法能否達(dá)到臨床可接受的精密度、敏感度以及線性相關(guān)性等參數(shù)要求。本文主要介紹一些常用的維生素D的檢測(cè)方法，各方法的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 25-羥基維生素D常用檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)分析

2.1 25-(OH)D免疫法測(cè)定

2.1.1放射免疫法

放射免疫法是利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原，同抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)的方法的體外微量分析方法。該方法不需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理純化過(guò)程，操作簡(jiǎn)單。目前，RIA試劑盒應(yīng)用比較廣泛、方便，特異性強(qiáng)，是基層單位對(duì)超微量物質(zhì)測(cè)定的主要手段。Hollis等[30]于1985年首次把3H-25-(OH)D3作為示蹤物，用放射免疫法(RIA)測(cè)定25-(OH)D濃度，并于1993年將方法改進(jìn)，用123I-25-(OH)D3代替了3H-25-(OH)D3作為示蹤物[31]，相比于前者，后者改進(jìn)了示蹤物，省略了樣品鈍化的預(yù)處理，操作更加簡(jiǎn)單，因此也被稱為25-羥基維生素D濃度測(cè)定最經(jīng)典的方法。但是放射免疫法存在放射性污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境都有一定的危害，放射性廢物的處理也比較復(fù)雜，而且測(cè)量需要設(shè)立平行樣，試樣花費(fèi)較多，每次檢測(cè)的數(shù)量有限。

2.1.2酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。ELISA法在自動(dòng)化操作、節(jié)省人力、無(wú)污染等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，適合于常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展定量檢測(cè)。蔣文良用此法測(cè)定了10例健康兒童血清25-羥基維生素D的水平[32]。ELISA法的主要缺陷是對(duì)基質(zhì)敏感，容易與其他非目標(biāo)化合物發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致方法特異性不足，只能用于檢測(cè)總的25-羥基維生素D含量。此外，酶促反應(yīng)易受溫度、時(shí)間等客觀因素影響，導(dǎo)致批內(nèi)和批間誤差相對(duì)較大。

2.1.3化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法

化學(xué)發(fā)光免疫分析法是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，適用于各種抗原、激素、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒使用連接有異魯米諾衍生物的25-(OH)D，反應(yīng)終止后加入激發(fā)劑，使用光電倍增管檢測(cè)產(chǎn)生的化學(xué)熒光信號(hào)。

單詠梅等[33]為確定LIAISON全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀是否可以滿足臨床檢驗(yàn)需求，用其測(cè)定25-(OH)D含量。經(jīng)驗(yàn)證，該方法臨床可報(bào)告范圍為3～262 ng/mL，精密度5.23%，總精密度6.75%，分析靈敏度2.5 ng/mL。符合國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，滿足臨床檢測(cè)的需要。

化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，快速檢測(cè)，無(wú)放射性污染，自動(dòng)化程度高，現(xiàn)已有多家廠商開(kāi)發(fā)出相關(guān)自動(dòng)免疫分析儀。然而，其缺點(diǎn)是自動(dòng)化儀器價(jià)格高且只能用于檢測(cè)25-(OH)D的總含量。

2.1.4電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法

李紅等[23]用E-170電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定25-羥基維生素D3并與使用酶免檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示E-170電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定25-羥基維生素D3質(zhì)控血清檢測(cè)結(jié)果均在1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)；與酶免檢測(cè)數(shù)據(jù)比較差異更有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，相關(guān)性差(r=0.568)。陳益明等[34-35]用ECLIA測(cè)定2027名健康嬰幼兒(1天～3歲)的血清25-(OH)D含量，初步了解本地區(qū)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)嬰幼兒血清25-(OH)D參考區(qū)間，為臨床檢測(cè)維生素D水平缺乏提供科學(xué)依據(jù)。

2.2 25-(OH)D色譜法測(cè)定

2.2.1高效液相色譜法

王劍等[36]用HPLC檢測(cè)47名正常健康兒童的血清25-(OH)D濃度。結(jié)果該方法在10～200 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9971)。劉怡欣等[37]用同樣的方法測(cè)定出健康成年人血清25-(OH)D濃度為(38.14±14.74 μg/L)，25-羥基維生素D在4.00～160.00 μg/L線性范圍內(nèi)與其響應(yīng)值線性關(guān)系良好(r=0.9999)，通過(guò)二者的測(cè)量結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法可用于血清中25-(OH)D的臨床檢測(cè)。

2.2.2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

在眾多檢測(cè)方法中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)因其極高的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性被國(guó)際上公認(rèn)為維生素D水平檢測(cè)方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”[38]。應(yīng)用與高分離快速液相色譜(RRLC)組合離子源的三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用法可使血清中25-(OH)D2和25-(OH)D3得到快速定量分析[39]。此方法在5～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)具有優(yōu)異的定量線性度響應(yīng)(R2>0.99)，且在血清中的檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)分別是2 ng/mL和3 ng/mL[40]。

徐鳳仙等[41]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (正離子電噴霧離子化(ESI+)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM))氘代同位素內(nèi)標(biāo)法，檢測(cè)281名志愿者血清中25-(OH)D含量。結(jié)果顯示，批內(nèi)精密度為0.88%～7. 69%，批間精密度為1.56%～9.90%；25-(OH)D在5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，校準(zhǔn)品測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確度為95.5%～101.2%，敏感性高，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可應(yīng)用于臨床分析。林海丹等[42]采用同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒食品中維生素D3質(zhì)量分?jǐn)?shù)。當(dāng)被測(cè)試樣質(zhì)量濃度在2～200 μg/L范圍內(nèi)時(shí)，線性相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)大于0.99。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于嬰幼兒食品中維生素D3的檢測(cè)。

3 結(jié)論與展望

維生素D對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)功能有著至關(guān)重要的作用，對(duì)海馬體、下丘腦、前額皮質(zhì)和顳葉的生理功能也有著重要影響[13]。缺乏維生素D將會(huì)導(dǎo)致精神分裂癥等精神疾病的發(fā)病率增加。母親在懷孕期間缺乏維生素D會(huì)增大子代后期患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)。此外，受出生季節(jié)、緯度、光照、膚色等因素影響導(dǎo)致的維生素D缺乏也會(huì)使得精神分裂癥的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。然而，由于維生素D相對(duì)其它維生素特殊的合成、代謝方式，對(duì)膚色，環(huán)境等外界因素的依賴性以及受體基因的多態(tài)性，還需要設(shè)計(jì)更多的前瞻性研究來(lái)更為深入地論證二者之間的聯(lián)系，評(píng)估補(bǔ)充維生素D在精神分裂癥治療過(guò)程中的作用以及建立更為系統(tǒng)化、多樣化的臨床試驗(yàn)。

目前，臨床上大多采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)25-羥基維生素D來(lái)評(píng)估維生素D的水平。此方法無(wú)需萃取、解離以及色譜分析等繁瑣的準(zhǔn)備工作，并且全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光平臺(tái)操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高，然而其精確度和靈敏度相對(duì)一般。此外，化學(xué)發(fā)光免疫分析法早期采用的競(jìng)爭(zhēng)性蛋白結(jié)合分析由于會(huì)受到內(nèi)源性維生素D結(jié)合蛋白的影響，其靈敏度和特異性遠(yuǎn)不及近年來(lái)得到廣泛認(rèn)可的采用25-羥基維生素D特異性抗體結(jié)合法。需要注意的是，各種測(cè)定方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，原理和操作步驟也有所不同，采用不同方法檢測(cè)25-羥基維生素D結(jié)果可能出現(xiàn)不同程度的差異。因此，在方法選擇時(shí)，應(yīng)對(duì)測(cè)定所要求的的靈敏度、特異性、費(fèi)用、時(shí)間及實(shí)驗(yàn)人員能力和實(shí)驗(yàn)室條件等實(shí)際情況進(jìn)行綜合考慮。此外，如何發(fā)展更為高效、精準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法還有待進(jìn)一步研究。