李欣 田朕 陳彰 李斌,2,3 張勇

1十堰市太和醫(yī)院眼科 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,十堰 442000；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院眼科，武漢 430030；3武漢紐福斯生物科技有限公司 420200

Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是由線粒體DNA突變所致的遺傳性眼病，常見的突變位點(diǎn)為11778[1]，臨床表現(xiàn)為雙眼視力同時(shí)或先后急性或亞急性下降[2]。本病好發(fā)于青少年男性，是導(dǎo)致青少年雙眼盲的常見原因之一，很多患者在較短時(shí)間內(nèi)雙眼視力急劇降至0.1以下。目前LHON的治療方法包括口服Q10、艾地苯醌、EPI-743等[3-5]，但均未獲得確切的療效。本研究團(tuán)隊(duì)前期進(jìn)行了一系列基礎(chǔ)研究，證實(shí)重組腺相關(guān)病毒2-還原型輔酶Ⅰ脫氫酶4(recombinant adeno associated virus 2-NADH dehydrogenase 4，rAAV2-ND4)能夠正常表達(dá)于線粒體或注射后進(jìn)入細(xì)胞的線粒體內(nèi)[6]，驗(yàn)證了rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射的安全性和有效性，確定了注射劑量[7]。在完成前期基礎(chǔ)研究后，本研究團(tuán)隊(duì)于2011—2012年對(duì)9例LHON患者進(jìn)行了首次基因治療臨床試驗(yàn)，隨訪36個(gè)月發(fā)現(xiàn)6例患者視力顯著提高，未見嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生[8-9]，初步證實(shí)了基因治療LHON的安全性和有效性。此后，法國和美國的研究團(tuán)隊(duì)也分別進(jìn)行了基因治療LHON的臨床試驗(yàn)，但均出現(xiàn)較嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥[10-11]。為了進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以證實(shí)基因治療藥物的安全性和有效性，本團(tuán)隊(duì)開展第2次基因治療LHON的臨床試驗(yàn)，以期為rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射治療LHON提供方法學(xué)和臨床療效評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用多中心前瞻性非隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)研究設(shè)計(jì)，研究團(tuán)隊(duì)由十堰市太和醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院、武漢大學(xué)附屬鄂州市中心醫(yī)院以及阿根廷布宜諾斯艾利斯的佩德羅·拉格萊澤眼科醫(yī)院臨床醫(yī)生組成，并于2017年12月至2018年2月在十堰市太和醫(yī)院眼科中心招募線粒體DNA 11778位點(diǎn)突變的LHON患者40例。選擇視力較差眼或右眼(雙眼視力相等時(shí))行rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射作為注射眼組，對(duì)側(cè)眼作為未注射眼組，每組40眼。LHON診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性或亞急性起病，無痛性視力下降；(2)單眼發(fā)病或雙眼相繼發(fā)?。?3)視覺誘發(fā)電位提示P100波潛伏期延長、振幅降低；(4)中心視野缺失或色覺障礙；(5)早期視盤正?；蜉p度充血、水腫，視盤旁局部微血管擴(kuò)張，無出血、滲出，晚期視盤顳側(cè)蒼白；(6)基因測序結(jié)果符合LHON診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合LHON診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且通過基因測序確定為11778位點(diǎn)突變，近3個(gè)月未經(jīng)其他治療，且視力未提高；(2)年齡12～65歲，病程>6個(gè)月且視力穩(wěn)定；(3)同意治療期間不使用其他針對(duì)此疾病的藥物或治療方法。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有糖尿病等慢性疾病，嚴(yán)重的心血管、腦血管、肝臟、腎臟等原發(fā)病，其他全身神經(jīng)性疾病者，心臟病手術(shù)后恢復(fù)期患者，有精神障礙的患者，腫瘤患者；(2)合并有青光眼等其他影響視力的眼部疾病患者；(3)近3個(gè)月內(nèi)參加其他臨床研究的患者；(4)酗酒、吸煙、吸毒或有藥物濫用史、有毒物質(zhì)接觸史者；(5)孕婦、哺乳期婦女或12個(gè)月內(nèi)有計(jì)劃懷孕者；(6)術(shù)前免疫實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果明顯異常者，如AAV2體液免疫反應(yīng)陽性、CD3/CD8異常等。40例患者均雙眼發(fā)病，其中男33例，女7例；病程為7～312個(gè)月，平均(41.30±56.08)個(gè)月；年齡為12～42歲，平均(20.30±6.39)歲；注射眼和未注射眼平均最佳矯正視力(best corrected visual acuity，BCVA)分別為(1.83±0.47)LogMAR和(1.75±0.46)LogMAR，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.813，P=0.419)；注射眼組和未注射眼組平均基線眼壓分別為(17.63±2.56)mmHg和(17.88±2.64)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.430，P=0.669)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，研究方案獲得十堰市太和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：201807)。在充分告知研究內(nèi)容及手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)后，所有患者和監(jiān)護(hù)人均自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1手術(shù)方法 手術(shù)在手術(shù)室進(jìn)行，患者取平臥位，術(shù)眼用鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)眼3次；常規(guī)消毒鋪巾，做好面部及眼部消毒；術(shù)眼用開瞼器開瞼，體積分?jǐn)?shù)0.5%聚維酮碘消毒液沖洗結(jié)膜囊，10 s后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液沖洗，洗凈消毒液；用1 ml注射器吸取0.05 ml rAAV2-ND4(1×1010vg)(武漢紐福斯生物科技有限公司)，沿注射眼順時(shí)針7：00～8：00位角膜緣后4 mm處進(jìn)針，緩慢推注藥物，拔出針頭后無菌棉簽按壓注射點(diǎn)2 min；術(shù)眼涂抗生素眼膏并包蓋，患者平臥30 min后返回病房。手術(shù)操作均由同一高年資醫(yī)師進(jìn)行。

1.2.2隨訪及評(píng)價(jià)指標(biāo) 術(shù)后1、3、6、12個(gè)月定期檢查視力、眼壓、眼前節(jié)及眼底等。評(píng)估患者治療的有效率，定義為末次隨訪時(shí)視力提高≥0.3 LogMAR。主要終點(diǎn)指標(biāo)為視力變化，由同一醫(yī)生采用兩用對(duì)數(shù)視力表(溫州星康醫(yī)學(xué)科技有限公司)檢查視力，并轉(zhuǎn)換成LogMAR視力；采用Full Auto Tonometer(日本Canon公司)噴氣式非接觸眼壓計(jì)測量眼壓3次，取平均值；采用裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)情況；采用CR-2免擴(kuò)瞳眼底照相機(jī)(日本Canon公司)檢查眼底。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)接近正態(tài)分布，以mean±SD表示；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及百分率表示。注射眼組和未注射眼組基因治療前后BCVA和眼壓總體比較均采用重復(fù)測量兩因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者治療有效率

治療后，注射眼組視力提高6眼，未注射眼組視力提高4眼，雙眼視力同時(shí)提高13例。40例患者中23例患者視力提高≥0.3 LogMAR，有效率為57.5%。

2.2 各組術(shù)眼治療前后BCVA比較

2個(gè)組BCVA總體比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=0.084，P=0.772)，治療前后BCVA總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=34.109，P<0.01)；治療后12個(gè)月2個(gè)組BCVA均較治療前提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表1)。

表1 2個(gè)組治療前和治療后12個(gè)月BCVA比較(mesn±SD,LogMAR)Table 1 Comparison of BCVA between the two groups before and after 12-month treatment (mesn±SD,LogMAR)組別眼數(shù)治療前后BCVA治療前治療后12個(gè)月未注射眼組401.75±0.461.51±0.62a注射眼組401.83±0.471.62±0.58a 注:F組別=0.084,P=0.772;F時(shí)間=34.109,P<0.01.與治療前比較,aP<0.01(重復(fù)測量兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) BCVA:最佳矯正視力 Note:Fgroup=0.084,P=0.772;Ftime=34.109,P<0.01.Compared with pre-treatment,aP<0.01 (Repeated measurement two-way ANOVA,LSD-t test) BCVA:best corrected visual acuity

2.3 各組術(shù)眼治療前后眼壓比較

2個(gè)組術(shù)眼治療前后眼壓總體比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=0.557，P=0.575；F時(shí)間=2.314，P=0.106)(表2)。

表2 2個(gè)組治療前后眼壓比較(mesn±SD,mmHg)Table 2 Comparison of intraocular pressure between the two groups before and after treatment (mesn±SD,mmHg)組別眼數(shù)治療前后不同時(shí)間點(diǎn)眼壓治療前治療后1個(gè)月治療后12個(gè)月未注射眼組4017.88±2.6418.25±2.2317.93±2.46注射眼組4017.63±2.5618.55±3.1417.85±2.51 注:F組別=0.557,P=0.575;F時(shí)間=2.314,P=0.106(重復(fù)測量兩因素方差分析) 1mmHg=0.133kPa Note:Fgroup=0.557,P=0.575;Ftime=2.314,P=0.106 (Repeated measurement two-way ANOVA) 1mmHg=0.133kPa

2.4 注射眼并發(fā)癥發(fā)生情況

隨訪期內(nèi)，所有患者rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射后均無結(jié)膜炎、角膜炎、前房炎癥、玻璃體炎癥及視網(wǎng)膜脫離出現(xiàn)。2眼注射治療后眼壓偏高，約為26 mmHg，使用鹽酸卡替洛爾滴眼液點(diǎn)眼，每日2次，眼壓恢復(fù)至正常。

3 討論

2007年，美國和英國3個(gè)研究小組針對(duì)Leber先天性黑矇成功開展了基因治療臨床試驗(yàn)[12-13]，開啟了眼部疾病的基因治療時(shí)代。LHON的發(fā)生是由于11778位點(diǎn)突變造成呼吸鏈上ND4基因編碼的第340位氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸所致，導(dǎo)致ND4蛋白功能異常。基因治療就是把未突變的ND4基因轉(zhuǎn)染到患者病變部位的細(xì)胞，編碼正常的ND4蛋白，替代患者體內(nèi)突變的ND4蛋白的功能?；蛑委熓悄壳爸委烲HON最有前景的方法，其安全性是首先要保證的問題。由于玻璃體腔內(nèi)注射AAV2載體會(huì)誘發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，從而影響藥物效果，本課題組在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段確定了AAV2引起機(jī)體免疫反應(yīng)的時(shí)間和峰值及用藥方案[14]，從而降低了機(jī)體免疫排斥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。法國GenSight Biologics公司和美國Guy教授研究團(tuán)隊(duì)用AAV2作為載體對(duì)LHON患者進(jìn)行基因治療后，均出現(xiàn)不同程度的玻璃體炎癥或葡萄膜炎[10-11]。此后法國GenSight Biologics公司證實(shí)了眼內(nèi)炎癥反應(yīng)與AAV2載體有關(guān)，并提出預(yù)防性系統(tǒng)地使用糖皮質(zhì)激素可以減輕炎癥反應(yīng)[15]。本研究中所有患者基因治療前1周和治療后4周均應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，以減少免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)會(huì)，術(shù)中及術(shù)后隨訪期內(nèi)均未發(fā)生任何嚴(yán)重并發(fā)癥，證實(shí)了基因治療的安全性。

2011—2012年，本研究團(tuán)隊(duì)首次使用rAAV2-ND4治療9例LHON患者并隨訪7年，有6例患者視力顯著提高(視力提高≥0.3 LogMAR)，有效率超過60%[16]。本研究結(jié)果顯示，rAAV2-ND4玻璃體腔內(nèi)注射后有效率達(dá)57.5%，與前期研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了LHON基因治療的有效性。此外，值得注意的是，2次基因治療結(jié)果顯示，不僅注射眼視力較基線提高，未注射眼視力也出現(xiàn)不同程度的提高。Yu-Wai-Man等[17]對(duì)37例m.11778G突變的LHON患者注射眼采用隨機(jī)分配原則，選擇1眼進(jìn)行rAAV2/2-ND4治療，在96周的隨訪期間觀察到雙眼視力的持續(xù)改善，結(jié)果顯示在第96周，68%(25/37)的受試者至少有1眼的BCVA較基線水平有臨床相關(guān)的恢復(fù)，78%(29/37)的受試者雙眼視力改善，表明單眼基因治療可以明顯改善雙眼視力。造成這種雙眼視力提高的機(jī)制仍不完全明確。一項(xiàng)非人靈長類動(dòng)物的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒載體DNA可從注射眼轉(zhuǎn)移到對(duì)側(cè)未注射眼的前節(jié)、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)(https://www.gensight-biologics.com)。此外，Yang等[18]將熒光金注射到鼠一側(cè)眼的玻璃體腔內(nèi)，2周后可見熒光金上行到對(duì)側(cè)視交叉，經(jīng)過視交叉后，部分進(jìn)入對(duì)側(cè)眼的視神經(jīng)，這為藥物單眼注射后雙眼視覺功能改善提供了一個(gè)合理的解釋，但物質(zhì)轉(zhuǎn)移是通過軸漿運(yùn)輸、軸突再生或其他方式仍不清楚，需要進(jìn)一步探索。

本研究的優(yōu)勢在于國內(nèi)缺少基因治療臨床實(shí)踐的相關(guān)報(bào)道，僅限于對(duì)外文文獻(xiàn)的參考和總結(jié)，本研究為我國LHON的基因治療提供了臨床依據(jù)。因本研究未設(shè)置正常對(duì)照組，而且單眼基因治療改變的是雙眼視功能，故未進(jìn)行玻璃體腔內(nèi)注射rAAV2-ND4治療的眼不能作為對(duì)照組。因此，40例患者80眼均以基因治療前后的視力變化進(jìn)行對(duì)比分析。本研究的不足之處在于未設(shè)置自然病程作為對(duì)照組，同時(shí)缺少自然病程患者分析。本研究未進(jìn)行視力提高與未提高患者的相關(guān)性影響因素分析，未納入視野、視神經(jīng)纖維層厚度和視覺誘發(fā)電位等客觀檢測指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，玻璃體腔內(nèi)注射rAAV2-ND4治療LHON是安全、有效的，研究結(jié)果為未來LHON基因治療走向臨床提供了理論依據(jù)。本研究團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)對(duì)40例患者進(jìn)行長期跟蹤隨訪，觀察患者全身情況，并結(jié)合視野、視神經(jīng)纖維層厚度和視覺誘發(fā)電位等客觀檢查資料評(píng)價(jià)基因治療后患者視功能的改善情況，探討基因治療LHON的遠(yuǎn)期安全性和有效性。

利益沖突李斌教授為武漢紐福斯生物科技有限公司董事長，是基因藥物rAAV2/2-ND4的發(fā)明者；本研究所用基因藥物來自武漢紐福斯生物科技有限公司；本研究承擔(dān)單位為公立三級(jí)甲等醫(yī)院，所有數(shù)據(jù)均為客觀檢查獲得，研究結(jié)果不會(huì)受到影響;其余作者均聲明不存在利益沖突