李亞紅 耿超 黑凱文 劉勝男 王奇 李筱榮 張琰

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國(guó)家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300384

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。過多的谷氨酸可作用于離子型或代謝型谷氨酸受體而導(dǎo)致興奮性毒性。興奮性毒性是阿爾茲海默病、帕金森病以及青光眼等神經(jīng)退行性病變的重要致病因素[1-2]。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體屬于離子型谷氨酸受體，在視網(wǎng)膜中，其與NMDA結(jié)合起到與谷氨酸類似的生物學(xué)作用，進(jìn)而引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)死亡[3]。研究表明，NMDA誘導(dǎo)的興奮性毒性是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)和青光眼等致盲眼病導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷的重要因素之一[3-4]，但其具體的分子作用機(jī)制尚未完全明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt且不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。根據(jù)lncRNA與鄰近基因的位置關(guān)系及其在基因組中的轉(zhuǎn)錄來源，可將其分為5類，即反義lncRNA、內(nèi)含子lncRNA、基因間lncRNA、啟動(dòng)子lncRNA和非翻譯區(qū)lncRNA[5-6]。反義lncRNA轉(zhuǎn)錄自蛋白編碼基因的反義鏈，與正義鏈存在序列互補(bǔ)配對(duì)，通常情況下其可通過抑制正義鏈基因的轉(zhuǎn)錄而調(diào)控基因表達(dá)[7]。Tsix和Xist是2個(gè)位于X染色體的lncRNAs[8]。Xist的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可致X染色體失活；而其反義lncRNA Tsix可抑制Xist基因表達(dá)，二者共同調(diào)節(jié)胚胎早期發(fā)育過程中X染色體失活的生理過程[9-10]。本課題組先前的研究中，利用猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞建立內(nèi)層血-視網(wǎng)膜屏障的體外模型，并用高糖、高脂模擬糖尿病條件下的細(xì)胞外病理環(huán)境；高通量RNA測(cè)序結(jié)果顯示，在高糖、高脂的刺激下，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA Tsix的表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著降低[11]，這提示高糖、高脂刺激在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中造成的氧化應(yīng)激可調(diào)控lncRNA Tsix的表達(dá)；在后續(xù)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中，本課題組還發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA Tsix，還可起到拮抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡的作用。另一方面，NMDA及其受體所介導(dǎo)的信號(hào)通路亦可使視網(wǎng)膜神經(jīng)元處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。因此，我們提出假說：在NMDA介導(dǎo)的視網(wǎng)膜興奮性毒性模型中，lncRNA Tsix在視網(wǎng)膜中的表達(dá)可能會(huì)發(fā)生改變。為證明此假說，本研究擬建立NMDA誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜興奮性毒性模型，并在此模型中檢測(cè)lncRNA Tsix的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究其在視網(wǎng)膜興奮性毒性狀態(tài)下對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取7～8周齡SPF級(jí)C57B6/J小鼠105只(北京維通利華公司)，于天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院動(dòng)物房飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為22～26 ℃，循環(huán)12 h光照，并給予充足的水和食物。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：SYXK2018-0004)。所有實(shí)驗(yàn)操作符合國(guó)家衛(wèi)生研究所實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循天津醫(yī)科大學(xué)及ARVO有關(guān)眼科與視覺科學(xué)研究中動(dòng)物使用的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2主要試劑及儀器 NMDA(美國(guó)Sigma公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液(中國(guó)大冢制藥公司)；鹽酸奧布卡因滴眼液、左氧氟沙星滴眼液、復(fù)方托吡卡胺滴眼液(中國(guó)參天制藥有限公司)；卡波姆滴眼液(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司)；小鼠單克隆β3-微管蛋白抗體(ab78078)、兔抗小鼠二抗(ab6724)(英國(guó)Abcam公司)；抗淬滅封片劑(美國(guó)Vectashield公司)；常規(guī)RNA提取試劑盒(美國(guó)EZBioscience公司)；RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；EvaGreen 2倍qPCR Master Mix(加拿大Abm公司)。33G針頭、10 μl微量注射器(美國(guó)Hamilton公司)；聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)硬性角膜接觸鏡(英國(guó)Cantor & Nissel公司)；光相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)儀(德國(guó)海德堡公司)；激光掃描共焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；RNAscope 2.5 HD可見光紅色試劑盒、Hybez雜交爐(美國(guó)ACD公司)；氧化鋯研磨珠、高速組織研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；7900HT real-time PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1NMDA誘導(dǎo)視網(wǎng)膜興奮性毒性模型的制作及分組 使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液分別制備2、10、20和40 mmol/L NMDA工作液[12]。采用隨機(jī)數(shù)表法將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、2 mmol/L NMDA組、10 mmol/L NMDA組、20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組，每組21只。適應(yīng)環(huán)境1周，腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%水合氯醛(0.1 ml/10 g)全身麻醉小鼠，采用鹽酸奧布卡因滴眼液點(diǎn)眼行眼表局部麻醉。在角膜緣后1 mm處用33G針頭沿45°方向刺入右眼，用微量注射器將1 μl氯化鈉溶液和不同濃度NMDA溶液緩慢注入相應(yīng)組別小鼠的右眼玻璃體腔內(nèi)，15 s后緩慢撤針。采用左氧氟沙星滴眼液點(diǎn)眼，預(yù)防眼部感染。

1.2.2OCT法測(cè)定活體小鼠視網(wǎng)膜厚度 玻璃體腔內(nèi)注射NMDA溶液后1周，每組各取10只小鼠，采用4%水合氯醛麻醉小鼠，復(fù)方托吡卡胺滴眼液點(diǎn)眼擴(kuò)瞳?？ú返窝垡簼駶?rùn)眼表后，將定制的PMMA硬性角膜接觸鏡固定在小鼠正前方角膜上，使眼球?qū)?zhǔn)前置鏡(屈光度為+25.00 D)，行頻域OCT(spectral-domain OCT，SD-OCT)檢查，測(cè)定活體小鼠視網(wǎng)膜厚度。打開HEYEX軟件，選擇“SD-OCT”模式和水平單線掃描方式，待眼底的圖像清晰且亮度均勻時(shí)，通過調(diào)整推桿使視網(wǎng)膜的縱向剖面圖保持水平位，確保視神經(jīng)位于圖像中間。拍照100張，將所拍的100張圖片自動(dòng)疊加為最清晰的圖像。儲(chǔ)存圖像，分別測(cè)量中央及距離中央相同位置的視網(wǎng)膜各層厚度。

1.2.3蘇木精-伊紅染色法測(cè)定視網(wǎng)膜各層厚度和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量 玻璃體腔內(nèi)注射NMDA溶液后1周，每組各取10只小鼠，過量水合氯醛深度麻醉小鼠，完整取出眼球，并于酸性固定液中固定過夜。石蠟包埋眼球，沿縱軸方向行3 μm厚石蠟切片，其中5只小鼠眼球的石蠟切片脫蠟、脫水后行常規(guī)蘇木精-伊紅染色。在每個(gè)眼球相應(yīng)部位選取5～6張切片，采用Photoshop CS6軟件計(jì)數(shù)各組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)單位長(zhǎng)度內(nèi)的細(xì)胞數(shù)；采用CellSens Standard軟件測(cè)量視網(wǎng)膜各層厚度。所有操作均采用雙盲法。

1.2.4視網(wǎng)膜鋪片法和免疫熒光染色法測(cè)定小鼠RGCs數(shù)量 視網(wǎng)膜鋪片及染色參照本課題組之前的研究方法[13]。NMDA注射后1周，每組各取3只小鼠，過量水合氯醛深度麻醉小鼠，摘出眼球，置于多聚甲醛溶液中，室溫下固定40 min。借助于解剖顯微鏡在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中分離視網(wǎng)膜，置于多聚甲醛溶液中4 ℃固定過夜。次日，用PBS洗視網(wǎng)膜標(biāo)本2次，用通透緩沖液(PBS pH 6.8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%牛血清白蛋白，體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X-100)4 ℃過夜。次日，用PBlec緩沖液(PBS pH 6.8，1% Triton X-100，0.1 mmol/L CaCl2，0.1 mmol/L MgCl2和0.1 mmol/L MnCl2)漂洗視網(wǎng)膜，加入鼠單抗β3-微管蛋白(PBlec緩沖液稀釋1∶ 1 000)，室溫下孵育過夜。次日，PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記的兔抗小鼠二抗(PBlec緩沖液稀釋至1∶ 500)，室溫下避光孵育2 h，PBS洗3次。將視網(wǎng)膜剪成3～4瓣，用含DAPI的抗淬滅封片劑封片，視網(wǎng)膜GCL朝上。激光掃描共焦顯微鏡下觀察，并在相同的光學(xué)參數(shù)下拍照。采用Photoshop CS6軟件計(jì)數(shù)β3-微管蛋白染色陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5RNAscope技術(shù)檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜GCL中l(wèi)ncRNA Tsix的表達(dá) 將1.2.3中制備的另5只小鼠眼球石蠟切片脫蠟，室溫下風(fēng)干，滴加過氧化氫，靜置10 min，蒸餾水清洗。將切片放入沸騰的抗原修復(fù)液中水浴15 min，在無水乙醇中脫水，通風(fēng)櫥中風(fēng)干。用Immedge疏水性屏障筆在每張組織切片周圍設(shè)定疏水圈，室溫下晾干。按照RNAscope熒光檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行探針雜交、信號(hào)放大及檢測(cè)。在疏水圈內(nèi)滴加1～2滴蛋白酶，在Hybez雜交爐中40 ℃孵育30 min。緩沖液清洗，加入美國(guó)ACD公司設(shè)計(jì)的針對(duì)小鼠Tsix序列的探針，并以枯草桿菌二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)作為陰性對(duì)照探針，置于雜交爐中40 ℃孵育2 h。去除多余液體，依次加入6種雜交反應(yīng)液，分別反應(yīng)30、15、30、15、30和15 min以進(jìn)行信號(hào)放大和分子雜交，避光條件下滴加Fast Red染色液，室溫下靜置10 min。清洗切片，蘇木素復(fù)染，用不含DAPI的抗淬滅封片劑封片。采用CellSens Standard軟件在顯微鏡明場(chǎng)下觀察并拍照；采用Photoshop CS6軟件計(jì)數(shù)各組GCL中l(wèi)ncRNA Tsix陽性細(xì)胞數(shù)和GCL總細(xì)胞數(shù)。GCL lncRNA Tsix陽性細(xì)胞率=GCL lncRNA Tsix陽性細(xì)胞數(shù)/GCL總細(xì)胞數(shù)×100%。所有操作均采用雙盲法。

1.2.6RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 玻璃體腔內(nèi)注射NMDA溶液后1周，每組各取8只小鼠，過量水合氯醛腹腔內(nèi)注射深度麻醉小鼠，摘出眼球，冰上迅速分離視網(wǎng)膜，置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存。采用常規(guī)RNA提取試劑盒提取視網(wǎng)膜標(biāo)本的總RNA。將每個(gè)視網(wǎng)膜置于1個(gè)1.5 ml EP管中，加入500 μl裂解液，利用1枚直徑4 mm和2枚直徑3 mm的氧化鋯研磨珠在高速組織研磨器中充分研磨。研磨后將液體移至另一1.5 ml EP管，加入100 μl緩沖液A，顛倒混勻后靜置，4 ℃條件下15 000×g離心3 min。取上清，加入等體積無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移至吸附柱，4 ℃條件下4 000×g離心1 min。然后用洗液洗柱2次，吸附柱中央加入30 μl洗脫液，室溫下放置2 min，4 ℃條件下12 000×g離心1 min。采用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)測(cè)定所得總RNA的濃度和純度。取1 μg總RNA，按照RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒說明書，以O(shè)ligo(dT)為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備cDNA。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定小鼠視網(wǎng)膜中Tsix mRNA表達(dá)水平 PubMed查詢小鼠Tsix和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物序列，采用Primer Express 3.0軟件(美國(guó)Applied Biosystems公司)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列，并由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。Tsix正向引物序列：5’-CGCAATTGGTTGCTTTTATCC-3’；反向引物序列：5’-GGCTATTCTCGAGCCAGTTACG-3’。GAPDH正向引物序列：5’-TGTGTCCGTCGTGGAT CTGA-3’；反向引物序列：5’-CCTGCTTCACCACCTTC TTGA-3’。以4 μl cDNA為模板，加入Tsix和GAPDH的正向和反向引物各1.5 μl，以及12.5 μl EvaGreen 2倍qPCR Master Mix，添加無核酸酶水補(bǔ)足25 μl反應(yīng)體系，在96孔板中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：50 ℃孵育2 min，95 ℃變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，進(jìn)行40次循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，95 ℃反應(yīng)15 s。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法分析所得數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組測(cè)量指標(biāo)的計(jì)量數(shù)據(jù)資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示，經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊。視網(wǎng)膜各層厚度、視網(wǎng)膜GCL細(xì)胞密度、β3-微管蛋白染色陽性細(xì)胞數(shù)、Tsix染色陽性細(xì)胞率以及Tsix mRNA表達(dá)水平的總體比較均采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey post hoc檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 OCT檢測(cè)各組活體小鼠視網(wǎng)膜厚度比較(mean±SD,μm)Table 1 Comparison of retinal thicknesses among different groups detected by OCT (mean±SD,μm)組別樣本量ONLOPLINLIPLGCLRNFL視網(wǎng)膜全層正常對(duì)照組1063.50±16.9525.42±7.3227.00±5.0821.25±7.7926.25±5.5224.42±4.59269.60±20.012mmol/L NMDA組1060.17±17.7722.67±2.9024.58±3.1219.00±4.8621.50±3.82a24.33±6.70255.00±6.63a10mmol/L NMDA組1060.40±25.9725.40±8.5223.47±8.7917.40±5.4318.00±5.62a22.87±15.57252.40±6.41a20mmol/L NMDA組1063.44±12.5325.00±3.8320.22±4.4917.33±9.5417.44±3.40a22.00±8.77248.67±6.20a40mmol/L NMDA組1062.44±3.7222.78±1.7521.78±5.3517.67±5.6015.44±3.86a18.00±6.53229.11±10.37aF值0.0850.5901.8170.6628.3090.64717.030P值0.9870.6720.1400.621<0.010.632<0.01 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.01(單因素方差分析,Tukey post hoc檢驗(yàn)) OCT:光相干斷層掃描;NMDA:N-甲基-D-天冬氨酸;ONL:外核層;OPL:外叢狀層;INL:內(nèi)核層;IPL:內(nèi)叢狀層;GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層;RNFL:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層 Note:Compared with the normal control group,aP<0.01 (One-way ANOVA,Tukey post hoc test) OCT:optical coherence tomography;NMDA:N-methyl-D-aspartic acid;ONL:outer nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;IPL:inner plexiform layer;GCL:ganglion cell layer;RNFL:retinal nerve fiber layer

2 結(jié)果

2.1 不同劑量NMDA組小鼠視網(wǎng)膜厚度變化

注射后1周，各組小鼠視網(wǎng)膜全層厚度總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.030，P<0.01)，其中2、10、20和40 mmol/L NMDA組視網(wǎng)膜全層厚度分別約為正常對(duì)照組的94.58%、93.55%、92.11%和85.11%，均顯著變薄，與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。此外，與正常對(duì)照組相比，不同劑量NMDA組GCL厚度均顯著變薄，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。各組外核層(outer nuclear layer,ONL)、外叢狀層(outer plexiform layer,OPL)、內(nèi)核層(inner nuclear layer,INL)、內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer,IPL)、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer,RNFL)厚度總體比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.085、0.590、1.817、0.662、0.647，均P>0.05)(圖1，表1)。

圖1 玻璃體腔內(nèi)注射NMDA后7 d OCT檢測(cè)各組活體小鼠視網(wǎng)膜厚度變化 與正常對(duì)照組比較，不同劑量NMDA組視網(wǎng)膜全層厚度和GCL厚度均顯著變薄 A：正常對(duì)照組 B：2 mmol/L NMDA組 C：10 mmol/L NMDA組 D：20 mmol/L NMDA組 E：40 mmol/L NMDA組Figure 1 Changes of retinal thicknesses in living mice detected by OCT at 7 days after intravitreal injection of different doses of NMDA Compared with the normal control group，the total retinal and GCL thickness in different doses of NMDA groups were significantly thinner A：Normal control group B：2 mmol/L NMDA group C：10 mmol/L NMDA group D：20 mmol/L NMDA Group E：40 mmol/L NMDA Group

2.2 不同劑量NMDA組小鼠GCL細(xì)胞及視網(wǎng)膜厚度變化

正常對(duì)照組小鼠GCL細(xì)胞均勻、緊密，單層排列，細(xì)胞核大而圓。NMDA注射后，細(xì)胞出現(xiàn)體積不均和空泡，有核固縮現(xiàn)象。正常對(duì)照組、2 mmol/L NMDA組、10 mmol/L NMDA組、20 mmol/L NMDA組、40 mmol/L NMDA組GCL細(xì)胞數(shù)量分別為(89.22±1.59)、(80.78±1.62)、(60.09±1.74)、(43.97±1.30)、(29.86±1.36)個(gè)/mm2，各組間GCL細(xì)胞數(shù)量隨著NMDA劑量的增加而逐漸減少，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=267.100，P<0.01)，2 mmol/L NMDA組、10 mmol/L NMDA組、20 mmol/L NMDA組、40 mmol/L NMDA組GCL細(xì)胞數(shù)量分別約降至正常對(duì)照組的90.54%、67.35%、49.28%和33.46%，與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。視網(wǎng)膜感光細(xì)胞外節(jié)(outer segments，OS)、ONL、INL、IPL厚度和視網(wǎng)膜全層厚度隨玻璃體腔內(nèi)注射NMDA劑量的增加而逐漸變薄，總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.390、8.633、15.210、104.700、45.590，均P<0.01)。10 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組OS厚度，2、10、20、40 mmol/L NMDA組ONL、INL、IPL厚度和視網(wǎng)膜全層厚度均較正常對(duì)照組明顯變薄，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖2，3，表2)。

圖2 玻璃體腔內(nèi)注射NMDA后7 d小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化(HE ×400，標(biāo)尺=20 μm) 與正常對(duì)照組比較，不同劑量NMDA組視網(wǎng)膜GCL細(xì)胞數(shù)量均顯著減少 A：正常對(duì)照組 B：2 mmol/L NMDA組 C：10 mmol/L NMDA組 D：20 mmol/L NMDA組 E：40 mmol/L NMDA組 圖3 各組GCL的細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/mm2) F=267.100；P<0.01.與正常對(duì)照組比較，aP<0.01(單因素方差分析，Tukey post hoc檢驗(yàn)，n=5) 1：正常對(duì)照組；2：2 mmol/L NMDA組；3：10 mmol/L NMDA組；4：20 mmol/L NMDA組；5：40 mmol/L NMDA組 GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層；OS：感光細(xì)胞外節(jié)Figure 2 Retinal morphological changes in mice at 7 days after intravitreal injection of NMDA (HE ×400，bar=20 μm) Compared with the normal control group，the number of GCL cells in different doses of NMDA groups were significantly decreased A：Normal control group B：2 mmol/L NMDA group C：10 mmol/L NMDA group D：20 mmol/L NMDA group E：40 mmol/L NMDA group Figure 3 Comparison of GCL cell number among different groups (pcs/mm2) F=267.100;P<0.01.Compared with the normal control group，aP<0.01 (One-way ANOVA，Tukey post hoc test，n=5) 1：Normal control group;2：2 mmol/L NMDA group;3：10 mmol/L NMDA group;4：20 mmol/L NMDA group;5：40 mmol/L NMDA group GCL：ganglion cell layer;IPL：inner plexiform layer;INL：inner nuclear layer;OPL：outer plexiform layer;ONL：outer nuclear layer;OS：outer segments

表2 各組小鼠眼球切片視網(wǎng)膜各層厚度比較(mean±SD,μm)Table 2 Comparison of thickness of different retinal layers in eyeball sections among different groups (mean±SD,μm)組別樣本量OSONLOPLINLIPL視網(wǎng)膜全層正常對(duì)照組518.97±3.0938.33±3.5612.53±2.1027.08±2.5339.38±2.59153.74±9.522mmol/L NMDA組517.30±2.0326.65±4.66a12.59±2.2423.48±4.05a35.79±5.18a147.20±11.65a10mmol/L NMDA組516.90±2.47a35.21±3.39a13.60±2.5723.58±2.67a29.05±4.93a137.48±8.91a20mmol/L NMDA組517.61±3.2636.43±3.05a13.38±2.6123.25±2.81a24.75±3.26a132.99±8.58a40mmol/L NMDA組515.62±2.69a33.11±2.76a12.24±1.7020.18±2.95a22.43±4.53a124.63±11.26aF值5.3908.6332.21715.210104.70045.590P值<0.01<0.010.069<0.01<0.01<0.01 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05(單因素方差分析,Tukey post hoc檢驗(yàn)) NMDA:N-甲基-D-天冬氨酸;OS:感光細(xì)胞外節(jié);ONL:外核層;OPL:外叢狀層;INL:內(nèi)核層;IPL:內(nèi)叢狀層 Note:Compared with the normal control group,aP<0.05 (One-way ANOVA,Tukey post hoc test) NMDA:N-methyl-D-aspartic acid;OS:outer segments;ONL:outer nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;IPL:inner plexiform layer

2.3 不同劑量NMDA組小鼠RGCs數(shù)量變化

正常對(duì)照組小鼠β3-微管蛋白陽性RGCs排列均勻、緊密，細(xì)胞核大而圓。NMDA注射后小鼠RGCs排列松散，著色變淺。注射后7 d，正常對(duì)照組、2 mmol/L NMDA組、10 mmol/L NMDA組、20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組小鼠視網(wǎng)膜中β3-微管蛋白陽性RGCs數(shù)量分別為(1 586.67±217.37)、(1 257.22±92.60)、(730.00±128.24)、(565.56±104.73)和(340.00±43.24)個(gè)/mm2，隨著NMDA劑量的增加，小鼠視網(wǎng)膜中β3-微管蛋白陽性RGCs數(shù)量逐漸減少。各組小鼠視網(wǎng)膜中β3-微管蛋白陽性RGCs數(shù)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=323.000，P<0.01)，其中2 mmol/L NMDA組、10 mmol/L NMDA組、20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組小鼠視網(wǎng)膜中β3-微管蛋白陽性RGCs數(shù)量較正常對(duì)照組均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4，5)。

圖4 NMDA注射后7 d小鼠視網(wǎng)膜中β3-微管蛋白陽性RGCs數(shù)量變化(FITC ×200，標(biāo)尺=20 μm) 與正常對(duì)照組比較，不同劑量NMDA組β3-微管蛋白陽性RGCs排列松散，數(shù)量顯著減少 A：正常對(duì)照組 B：2 mmol/L NMDA組 C：10 mmol/L NMDA組 D：20 mmol/L NMDA組 E：40 mmol/L NMDA組 圖5 各組β3-微管蛋白染色陽性細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/mm2) F=323.000，P<0.01.與正常對(duì)照組比較，aP<0.05(單因素方差分析，Tukey post hoc檢驗(yàn)，n=3) 1：正常對(duì)照組；2：2 mmol/L NMDA組；3：10 mmol/L NMDA組；4：20 mmol/L NMDA組；5：40 mmol/L NMDA組Figure 4 Changes of the number of retinal ganglion cells in mice at 7 days after intravitreal injection of different doses of NMDA (FITC ×200，bar=20 μm) Compared with the normal control group，β3-tubulin-positive RGCs in different doses of NMDA group were loosely arranged and significantly reduced in number A：Normal control group B：2 mmol/L NMDA group C：10 mmol/L NMDA group D：20 mmol/L NMDA group E：40 mmol/L NMDA group Figure 5 Comparison of the number of β3-tubulin-positive cells among the different doses of NMDA groups (pcs/mm2) F=323.000，P<0.01.Compared with the normal control group，aP<0.05 (One-way ANOVA，Tukey post hoc test，n=3) 1：Normal control group;2：2 mmol/L NMDA group;3：10 mmol/L NMDA group;4：20 mmol/L NMDA group;5：40 mmol/L NMDA group

2.4 不同劑量NMDA組小鼠視網(wǎng)膜lncRNA Tsix陽性細(xì)胞率比較

lncRNA Tsix主要表達(dá)于GCL，集中在蘇木素淡染的細(xì)胞質(zhì)中，蘇木素深染的細(xì)胞核中未見表達(dá)，其他視網(wǎng)膜各層未見表達(dá)；dapB作為陰性對(duì)照探針的陰性對(duì)照組未見著色。隨著NMDA劑量的增加，GCL lncRNA Tsix陽性細(xì)胞率逐漸降低。正常對(duì)照組、2 mmol/L NMDA組、10 mmol/L NMDA組、20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組lncRNA Tsix陽性細(xì)胞率分別為(38.13±3.25)%、(37.77±1.97)%、(33.88±2.23)%、(29.08±2.12)%和(28.43±1.33)%，各組小鼠GCL中的lncRNA Tsix陽性細(xì)胞率總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.670，P<0.01)，2 mmol/L NMDA組、10 mmol/L NMDA組、20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組小鼠視網(wǎng)膜lncRNA Tsix陽性細(xì)胞率均低于正常對(duì)照組，其中10 mmol/LNMDA組、20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組小鼠視網(wǎng)膜中l(wèi)ncRNA Tsix陽性細(xì)胞率與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖6，7)。

圖6 玻璃體腔內(nèi)注射NMDA后7 d小鼠視網(wǎng)膜組織中l(wèi)ncRNA Tsix的表達(dá)(Fast Red+蘇木素 ×400，標(biāo)尺=20 μm) 隨著NMDA劑量的增加，GCL lncRNA Tsix染色陽性細(xì)胞率降低 黑色箭頭指的紅點(diǎn)代表lncRNA Tsix陽性染色，紫藍(lán)色代表蘇木素染的細(xì)胞核 A：陰性對(duì)照組 B：正常對(duì)照組 C：2 mmol/L NMDA組 D：10 mmol/L NMDA組 E：20 mmol/L NMDA組 F：40 mmol/L NMDA組(右側(cè)為左側(cè)框內(nèi)局部放大圖) 圖7 各組GCL lncRNA Tsix陽性細(xì)胞率比較 F=13.670，P<0.01.與正常對(duì)照組比較，aP<0.05(單因素方差分析，Tukey post hoc檢驗(yàn)，n=5) 1：正常對(duì)照組；2：2 mmol/L NMDA組；3：10 mmol/L NMDA組；4：20 mmol/L NMDA組；5：40 mmol/L NMDA組 GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；lncRNA：長(zhǎng)鏈非編碼RNA 圖8 各組小鼠視網(wǎng)膜組織中Tsix mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 F=3.810，P=0.014.與正常對(duì)照組比較，aP<0.05(單因素方差分析，Tukey post hoc檢驗(yàn)，n=8) 1：正常對(duì)照組；2：2 mmol/L NMDA組；3：10 mmol/L NMDA組；4：20 mmol/L NMDA組；5：40 mmol/L NMDA組Figure 6 Expression of lncRNA Tsix in retina tissue at 7 days after intravitreal injection of different doses of NMDA (Fast Red+hematoxylin ×400，bar=20 μm) The lncRNA Tsix-positive cells in the GCL was decreased with the increasing doses of NMDA The red dots (black arrows) represented the positive stained lncRNA Tsix,and purple blue dots represented the nuclear staining with hematoxylin A：Negative control group B：Normal control group C：2 mmol/L NMDA group D：10 mmol/L NMDA group E：20 mmol/L NMDA group F：40 mmol/L NMDA group (the right pictures were the enlarged frame of the left pictures) Figure 7 Comparison of the ratio of the lncRNA Tsix-positive cells in GCL among the different doses of NMDA groups F=13.670，P<0.01. Compared with the normal control group，aP<0.05(One-way ANOVA，Tukey post hoc test，n=5) 1：Normal control group;2：2 mmol/L NMDA group;3：10 mmol/L NMDA group;4：20 mmol/L NMDA group;5：40 mmol/L NMDA group GCL：ganglion cell layer;lncRNA：long noncoding RNA Figure 8 Comparison of Tsix mRNA expression levels in retina tissue among the different doses of NMDA groups F=3.810，P=0.014.Compared with the normal control group，aP<0.05(One-way ANOVA，Tukey post hoc test，n=8) 1：Normal control group;2：2 mmol/L NMDA group;3：10 mmol/L NMDA group;4：20 mmol/L NMDA group;5：40 mmol/L NMDA group

2.5 不同劑量NMDA組小鼠視網(wǎng)膜中Tsix mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

在確認(rèn)lncRNA Tsix主要在GCL表達(dá)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量驗(yàn)證NMDA誘導(dǎo)的Tsix mRNA在視網(wǎng)膜中的表達(dá)變化是否與RNAscoepe結(jié)果一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、2 mmol/L NMDA組、10 mmol/L NMDA組、20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組小鼠視網(wǎng)膜組織中Tsix mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.52±0.65、1.03±0.39、0.92±0.33、0.78±0.13和0.75±0.14，各組間總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.810，P=0.014)，其中與正常對(duì)照組比較，2 mmol/L NMDA組和10 mmol/L NMDA組小鼠視網(wǎng)膜組織中Tsix mRNA相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組小鼠視網(wǎng)膜組織中Tsix mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖8)。視網(wǎng)膜組織中Tsix mRNA相對(duì)表達(dá)量隨NMDA劑量的增加而顯著降低，總體趨勢(shì)與RNAscope檢測(cè)出的GCL中l(wèi)ncRNA Tsix的變化趨勢(shì)一致。

3 討論

玻璃體腔內(nèi)注射NMDA可形成一種由于誘導(dǎo)RGCs興奮性毒性而造成的視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型[3]，為DR和青光眼等不可逆性致盲眼病致病機(jī)制的探索以及干預(yù)手段的篩選提供良好的平臺(tái)。NMDA激活NMDA受體，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流超載，觸發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)興奮性毒性，引起過量的自由基產(chǎn)生和RGCs凋亡[14-16]。注射不同劑量的NMDA造成視網(wǎng)膜損傷程度各異，NMDA劑量過高可導(dǎo)致RGCs損傷過多，NMDA劑量過低則損傷不明顯[17]，這2種情況均可造成所檢測(cè)的神經(jīng)保護(hù)性藥物效果不明顯。本研究建立視網(wǎng)膜興奮性毒性模型，并評(píng)價(jià)不同劑量NMDA小鼠玻璃體腔內(nèi)注射對(duì)視網(wǎng)膜RGCs的損傷程度，為今后神經(jīng)保護(hù)性藥物的篩選以及神經(jīng)興奮性毒性發(fā)病機(jī)制的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

在本研究中，OCT檢查發(fā)現(xiàn)不同劑量NMDA組視網(wǎng)膜全層厚度均較正常對(duì)照組明顯變薄，各組GCL厚度的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余視網(wǎng)膜各層厚度的組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，在不同劑量NMDA組中，除視網(wǎng)膜全層厚度外，視網(wǎng)膜ONL、INL、IPL厚度均顯著變薄。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能主要是由于檢測(cè)手段精度不同造成的，OCT主要反映活體動(dòng)物視網(wǎng)膜各層的厚度及形態(tài)，但其檢測(cè)精度不及石蠟切片染色和相應(yīng)的顯微鏡下觀察；而石蠟切片染色可觀察到視網(wǎng)膜組織學(xué)上的細(xì)微變化，但不能反映活體組織的實(shí)時(shí)情況[18]。在本研究中，這2種方法雖然精度有所差異，但檢測(cè)結(jié)果的趨勢(shì)一致，二者分別從宏觀和微觀角度驗(yàn)證了NMDA對(duì)視網(wǎng)膜的興奮性毒性作用。此外，組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，20 mmol/L NMDA組GCL中的細(xì)胞數(shù)量約減少至正常對(duì)照組的一半；視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光染色結(jié)果顯示，10 mmol/L NMDA組和20 mmol/L NMDA組β3-微管蛋白陽性RGCs細(xì)胞數(shù)量分別約減少至正常對(duì)照組的一半和37%。這2種方法檢測(cè)結(jié)果的差異可能是由于位于GCL的細(xì)胞除了RGCs外，還包括異位無長(zhǎng)突細(xì)胞、Müller細(xì)胞等，而RGCs對(duì)NMDA造成的興奮性毒性比其他種類的細(xì)胞更為敏感，因而相同劑量的NMDA會(huì)造成更多的RGCs死亡[19]。

本研究中SD-OCT結(jié)果顯示，2 mmol/L NMDA組IPL、GCL和RNFL厚度約降至正常對(duì)照組的90.15%，這一結(jié)果與Kimura等[20]的發(fā)現(xiàn)一致。此外，組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，20 mmol/L NMDA組和40 mmol/L NMDA組GCL中的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別下降至正常對(duì)照組的49.28%和33.46%，與Zheng等[21]的研究結(jié)果一致。但值得注意的是，本研究中玻璃體腔內(nèi)注射2、10、20、40 mmol/L NMDA后1周，β3-微管蛋白標(biāo)記的RGCs數(shù)量分別下降至正常對(duì)照組的79.23%、46.00%、35.64%、21.42%，這一結(jié)果與Zhao等[17]和劉詩(shī)亮等[22]的研究略有不同。Zhao等[17]在玻璃體腔內(nèi)注射7.5、10、20 mmol/L NMDA后，Brn-3a標(biāo)記的RGCs分別約降至對(duì)照組的80%、50%和25%；而劉詩(shī)亮等[22]發(fā)現(xiàn)注射30 mmol/L NDMA可使Brn-3b標(biāo)記的RGCs數(shù)量約降至對(duì)照組的16.34%，這可能與標(biāo)記RGCs的特異性標(biāo)志物不同有關(guān)。

LncRNA可在氧化應(yīng)激、興奮性毒性等病理?xiàng)l件下，作為表觀遺傳學(xué)的一種重要調(diào)控方式，參與調(diào)控視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA Tsix除了調(diào)控Xist的基因表達(dá)外[8]，還可調(diào)控其他基因的表達(dá)，如下調(diào)miR-30a-5p的表達(dá)，從而促進(jìn)小鼠體內(nèi)和體外金屬顆粒誘導(dǎo)的骨溶解過程中成骨細(xì)胞凋亡[26]，以及通過“海綿”作用吸附miR-384，從而上調(diào)miR-384靶基因的表達(dá)，促進(jìn)人胰腺癌細(xì)胞的增生[27]。我們?cè)谧罱难芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)，lncRNA Tsix在高糖、高脂刺激下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與RNA結(jié)合蛋白的共表達(dá)分析顯示，lncRNA Tsix與核受體共激活因子5(nuclear receptor coactivator 5，NCOA5)的表達(dá)呈高度正相關(guān)[11]。NCOA5是一種共調(diào)節(jié)因子，既往研究表明NCOA5在原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[28-29]；同時(shí)，NCOA5缺乏會(huì)上調(diào)促炎因子IL-6的表達(dá)，誘發(fā)葡萄糖耐受不良，進(jìn)而導(dǎo)致2型糖尿病[30]。因此，lncRNA Tsix可能通過結(jié)合下游的NCOA5減少RGCs凋亡以及減輕糖尿病代謝紊亂造成的氧化應(yīng)激，進(jìn)而減輕糖尿病所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)和血管的病理改變。LncRNA Tsix對(duì)糖尿病患者視網(wǎng)膜的保護(hù)作用及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)NMDA可劑量依賴性地誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜RGCs死亡；同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)了NMDA劑量與RGCs丟失及視網(wǎng)膜各層厚度降低的量化對(duì)應(yīng)關(guān)系，為藥物篩選提供了可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。此外，新型lncRNA Tsix的表達(dá)主要集中在視網(wǎng)膜GCL的細(xì)胞質(zhì)，而且其表達(dá)隨NMDA劑量的增加而顯著下調(diào)，對(duì)RGCs發(fā)揮保護(hù)作用。本研究為進(jìn)一步探索lncRNA Tsix對(duì)NMDA誘導(dǎo)視網(wǎng)膜興奮性毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突