趙小霞 周楊 周玥 楊麗敏 趙秉剛

(1南開大學(xué)附屬天津市第四中心醫(yī)院，天津 300140；2內(nèi)蒙古百晗旭木生物科技有限公司；3吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

衰老是一個生物學(xué)變化過程，由遺傳基因和復(fù)雜的內(nèi)外環(huán)境等多種因素相互作用引起。自由基學(xué)說認為在衰老的過程中，由于自由基水平不斷增加使機體的抗氧化能力下降，外界環(huán)境刺激及線粒體、脂肪酸均可產(chǎn)生超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等各種過氧化因子，加速推進衰老進程。在機體氧化衰老的過程中，機體會有抗氧化衰老防御系統(tǒng)〔1〕，而在一些天然藥物中有抗氧化衰老的成分，如多糖類、黃酮類、生物堿類。研究證實多糖有抗氧化、抗衰老、增強免疫、抗腫瘤的作用，而螺旋藻是一種原核藻類生物，原料易于獲取，且含有豐富的多糖類物質(zhì)〔2〕，但多糖的提取存在得率低、純度低、沒有系統(tǒng)化的標(biāo)準(zhǔn)等問題。本研究擬采用低溫提取工藝和凝膠過濾層析提取高純度、得率和活性的螺旋藻多糖，并通過紅外光譜檢測其成分和含量，為螺旋藻多糖的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)提供實驗數(shù)據(jù)，為綜合開發(fā)螺旋藻資源提供參考，并通過觀察其對果蠅的壽命、飛行能力和性活力的影響，探討提取物的抗衰老作用。

1 材料與方法

1.1材料 美國野生型黑腹果蠅，購自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，溫度為(25±1)℃，相對濕度為(60±5)%環(huán)境中培養(yǎng)，每天給予12 h光照。蔗糖和玉米粉購于市場；瓊脂、酵母粉、丙酸和乙醚購于生工生物工程有限公司；螺旋藻粉購于福建福清市新大澤螺旋藻有限公司；CM-Sephadex-C25和QAZ-Sephadex-A25購于 Amersham。LGJ-18冷凍干燥機購于北京松原興華；DZG-303A離子純水機購于美國摩爾；YDL5M離心機購于湘儀離心機廠；果蠅培養(yǎng)瓶和麻醉瓶等購于沈陽一化玻商貿(mào)有限公司；恒溫生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z型購于上海博迅。

1.2螺旋藻多糖的提取和含量成分測定 蒸餾水溶解螺旋藻粉1 000 g，放置于-30～-35℃的冰箱中過夜，自然解凍后離心，分離上清液，去掉沉渣，留取上清。螺旋藻所含多糖分子量大小不等，本課題組研究發(fā)現(xiàn)分子量在1.4萬以下的多糖效果佳，所以選用CM-Sephadex-C25和QAZ-Sephadex-A25凝膠柱子去蛋白，蛋白經(jīng)凝膠吸附后，再經(jīng)150 kD的超濾膜過濾得多糖，經(jīng)冷凍干燥后得螺旋藻多糖干粉，干粉為微黃色。將提取物在清華大學(xué)分析中心采用紅外光譜技術(shù)進行成分測定。采用硫酸-蒽酮比色法測定提取物中多糖的含量，評比硫酸-蒽酮比色法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率的性能指標(biāo)，具體操作方法參考文獻〔3〕。

1.3果蠅培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：瓊脂2 g、玉米粉20 g、蔗糖15 g、丙酸2 ml、酵母粉2 g、水200 ml。實驗培養(yǎng)基組成：對照組為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，低劑量組為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.125%螺旋藻多糖，中劑量組為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.250%螺旋藻多糖，高劑量組為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.500%螺旋藻多糖。

1.4分組 隨機分為4組，對照組和實驗高中低劑量組，每組200只，雌雄各半，置50 ml錐形瓶中，每組10瓶，每瓶20只。

1.5果蠅生存壽命測定 收集24 h內(nèi)羽化的果蠅成蟲，用乙醚麻醉，雄果蠅和雌果蠅分開飼養(yǎng)于培養(yǎng)管內(nèi)，每管20只，各組分別飼養(yǎng)于不同濃度的螺旋藻多糖培養(yǎng)基中，每3 d更換培養(yǎng)基一次，將培養(yǎng)基放置于25℃，相對濕度為65%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從20 d起每天定時觀察，統(tǒng)計死亡果蠅數(shù)，直至全部自然死亡，計算各組的半數(shù)死亡時間、平均壽命和最高壽命。每組果蠅半數(shù)死亡所需天數(shù)為半數(shù)死亡時間，全部果蠅存活總天數(shù)的均數(shù)為平均壽命，每組最后死亡的10只果蠅存活天數(shù)的平均數(shù)為該組果蠅的平均最高壽命。

1.6果蠅飛翔能力測定 果蠅飼養(yǎng)40 d后，放飛，能起飛的果蠅計入飛翔組內(nèi)。

1.7果蠅性活力測定 收集10 h內(nèi)基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)羽化的果蠅，每組雌雄蠅各100只，隨機分為對照組及實驗組。對照組用普通培養(yǎng)基，實驗組給予不同濃度的多糖培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)15 d后做性活力測定，每只培養(yǎng)管放30對果蠅，雌雄果蠅1∶1配對，記錄30 min內(nèi)交配的果蠅對數(shù)。

1.8統(tǒng)計處理 采用SPSS10.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1螺旋藻提取物光譜圖譜和含量測定 紅外光譜技術(shù)測得螺旋藻多糖提取物圖譜(圖1)，結(jié)果可見在1 000～1 200 cm-1的范圍，螺旋藻粉在1 082 cm-1處可見1個吸收峰，提取物的圖譜可見在1 155 cm-1、1 081 cm-1、1 022 cm-1處可見3個吸收峰且峰面積較大。不同濃度葡萄糖570 nm波長下的線性回歸方程為Y=0.205 1X-0.003 4，R=0.999(Y代表多糖含量，X代表OD值，R代表判定系數(shù))。測得提取物中多糖的含量為78.67%±3.51%。最終1 000 g的螺旋藻粉提取螺旋藻多糖的得率為12.33%±2.52%。

A.螺旋藻粉；B.螺旋藻多糖提取物圖1 螺旋藻多糖提取物紅外光掃描圖譜

2.2螺旋藻多糖對果蠅壽命的影響 中、高劑量組的半數(shù)死亡天數(shù)高于對照組，平均壽命及平均最高壽命均顯著高于對照組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 螺旋藻多糖對果蠅壽命的影響

2.3螺旋藻多糖對果蠅飛翔能力的影響 中、高劑量組果蠅存活數(shù)、飛翔數(shù)、飛翔率較對照組均提高(P<0.05，P<0.01)。低劑量組存活數(shù)、飛翔數(shù)與對照組相比顯著提高(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 螺旋藻多糖對果蠅飛翔、交配能力的影響

2.4螺旋藻多糖對果蠅交配能力的影響 與對照組比較，中、高劑量組明顯提高果蠅的交配率(P<0.01)。見表2。

3 討 論

衰老是正常的生理現(xiàn)象，抗衰老藥物通過改善機體體質(zhì)，調(diào)整機體功能和內(nèi)環(huán)境平衡，保障和維護機體的正常功能，延緩機體生理性衰老，提高生活質(zhì)量，達到抗衰老的作用。文獻報道采用三氯乙酸除蛋白法提取的螺旋藻多糖治療衰老模型組鼠能顯著提高超氧化物歧化酶(SOD)活力，并降低衰老小鼠的脂質(zhì)過氧化物含量，與主要成分為苷和酚羥基結(jié)構(gòu)的銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯的銀杏葉提取物聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同增效作用〔4，5〕。也有研究報道經(jīng)Sevage法脫蛋白和層析純化的螺旋藻多糖在改善D-半乳糖所致衰老小鼠機體物質(zhì)代謝紊亂及延緩機體衰老等方面具有一定的作用〔6～8〕。目前螺旋藻多糖的提取中細胞破壁主要采用超聲法〔9〕，粗提主要使用稀酸、稀堿、熱水抽提的方法，純化主要采用層析法、過濾法、季銨鹽法、酶解法、Sevage法，但主要存在多糖得率低，成本高，提取步驟復(fù)雜，沒有系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化體系，難以規(guī)?；a(chǎn)的問題，所以在中藥提取中優(yōu)化提取工藝并制訂相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，不斷規(guī)范中藥炮制加工工藝顯得尤為重要〔10〕。為了優(yōu)化螺旋藻多糖的提取工藝和提高產(chǎn)出率，便于生產(chǎn)高得率和高活性的多糖，并且不加入可能改變活性和結(jié)構(gòu)的化學(xué)試劑，本工藝采用了低溫水提的方法，介于超聲波破壁中可能產(chǎn)生的高熱和空化效應(yīng)對提取物的影響，本工藝細胞破壁采用反復(fù)凍融破壁，純化采用凝膠過濾層析法。目前高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜技術(shù)可以作為中藥工藝篩選過程中的有效評價手段，但是HPLC主要采用液相檢測的方法，將藥材溶于水或醇相進行檢測，而紅外光譜技術(shù)無須樣品預(yù)處理，反映藥材真實的整體信息，可用于中藥的定性和定量測定〔11〕，所以本研究采用紅外光譜繪制提取物的化學(xué)圖譜，觀察螺旋藻原粉和提取物多糖之間的差異，結(jié)果說明樣品中含有多糖類物質(zhì)〔12〕，且提取物波數(shù)范圍下的峰面積明顯大于螺旋藻原粉，提示多糖含量高。目前藥典規(guī)定HPLC方法獲得的參考值建立模型，但是由于紅外光譜技術(shù)測量的樣品一般是微小微量的，而標(biāo)準(zhǔn)方法卻無法對那么微小微量的樣品進行分析，所以目前紅外技術(shù)很少應(yīng)用于定量分析，所以本研究紅外光譜圖譜結(jié)果對比提示本研究提取出了螺旋藻多糖，并可將掃描圖譜作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的參考。本研究結(jié)果提示各濃度給藥組能不同程度的延長雌雄果蠅平均壽命，最高壽命和半數(shù)死亡期，提高飛行能力，性活力，尤其以0.5%濃度組效果最佳，這也與文獻報道的螺旋藻多糖具有抗衰老作用相一致〔4～8〕。

本研究采用低溫提取和凝膠過濾層析的方法，提取高純度和活性的螺旋藻多糖，同時觀察提取物對果蠅壽命、飛行能力和性活力的影響，進而改進螺旋藻多糖的提取工藝，紅外光譜繪制提取物的化學(xué)圖譜，初步制訂相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，為螺旋藻多糖的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化提取提供數(shù)據(jù)。