張 萍 邵 靚

1.江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西南昌 330000；2.江西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，江西南昌 330000

多巴胺能神經(jīng)元損傷和凋亡導(dǎo)致多巴胺分泌減少，是帕金森病的直接原因[1]。帕金森病多巴胺能神經(jīng)元損傷及減少的原因和保護(hù)策略是目前帕金森病研究的重點及熱點。多種因素均可引起多巴胺能神經(jīng)元損傷，其中環(huán)境因素所導(dǎo)致的帕金森病日益增多，引起越來越多的重視[2]。如何減輕環(huán)境所致的多巴胺能神經(jīng)元損傷，減少有機(jī)農(nóng)藥相關(guān)的帕金森病的發(fā)生具有現(xiàn)實意義。本研究從細(xì)胞氧化應(yīng)激與帕金森病多巴胺能神經(jīng)元減少的機(jī)制入手，從細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)抗氧化物及氧化物的水平干預(yù)等方面探討魚藤酮與多巴胺能神經(jīng)元損傷的相關(guān)關(guān)系，可能為臨床帕金森病的治療提供切實有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（human neuroblastoma cells，SH-SY5Y）細(xì)胞購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 儀器與試劑 本研究采用的主要儀器與試劑見表1。

表1 儀器與試劑

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在37°C，5% CO2恒定條件下，用含1%抗生素（青霉素和鏈霉素）的10%胎牛血清（美國Gibco）培養(yǎng)SH-SY5Y 細(xì)胞2 d。

1.3 實驗分組

根據(jù)細(xì)胞不同處理方式，將細(xì)胞分為正常組和魚藤酮組：正常組中1 mL 培養(yǎng)基加入1 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液；魚藤酮組中使用DMSO 稀釋10 mmol/L 魚藤酮溶液為不同濃度（25、50、100、200、500、1000、2000 nM）（nM：nmol/L）進(jìn)行干預(yù)。

1.4 MTT 檢測

3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），能與活性較強(qiáng)的細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，被還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中。使用酶標(biāo)儀比色對比，在490 nm 波長處測定吸光值，可以間接反應(yīng)存活細(xì)胞數(shù)量。

1.5 光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

活性較好的細(xì)胞呈橢圓形，突起較多；活性較差或死亡的細(xì)胞，突起消失變圓。

1.6 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平檢測

利用流式細(xì)胞術(shù)，在37°C 下保持20 min，使用2′-7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色正常組和魚藤酮組細(xì)胞。其激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm。硫代巴比妥酸活性物質(zhì)（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）和超氧化物根據(jù)實驗試劑盒步驟評估超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度魚藤酮處理SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的比較

分別使用25、50、100、200、500、1000、2000 nM 魚藤酮干預(yù)SH-SY5Y 細(xì)胞后，以正常組細(xì)胞活性為100%，其他各組細(xì)胞與正常組比較，活性分別為（98.19±3.43）%、（95.79±3.95）%、（92.45±4.76）%、（86.63±3.89）%、（78.02±4.97）%、（62.50±5.21）%、（49.37±5.69）%。當(dāng)魚藤酮濃度達(dá)到200 nM 及以上時，細(xì)胞活性明顯下降（P＜0.05），與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同濃度魚藤酮處理SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的比較

2.2 不同魚藤酮處理的SH-SY5Y 細(xì)胞光鏡結(jié)果

分別使用25、50、100、200、500、1000、2000 nM 魚藤酮干預(yù)SH-SY5Y 細(xì)胞后，光鏡下可見從200 nM開始細(xì)胞生長受限，隨著濃度的改變，細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞數(shù)量減少更為明顯，2000 nM 的魚藤酮加入培養(yǎng)基后細(xì)胞幾乎停止生長，突起消失變圓，細(xì)胞生長與魚藤酮濃度呈濃度依賴的負(fù)相關(guān)（圖2）。

圖2 不同魚藤酮處理的SH-SY5Y 細(xì)胞光鏡結(jié)果（×400 倍）

2.3 魚藤酮干預(yù)后SH-SY5Y 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的改變

選取500 nM 魚藤酮處理的SH-SY5Y 細(xì)胞24 h后，利用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)氧化簇（reactive oxygen species，ROS）水平，結(jié)果顯示，魚藤酮組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。通過酶聯(lián)反應(yīng)比色檢測發(fā)現(xiàn)，500 nM 魚藤酮處理后細(xì)胞內(nèi)SOD 表達(dá)水平低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化表達(dá)水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖3 500 nM 魚藤酮處理細(xì)胞24 h 細(xì)胞ROS 水平

圖4 500 nM 魚藤酮處理的SH-SY5Y 細(xì)胞24 h 細(xì)胞SOD 水平及脂質(zhì)過氧化水平

3 討論

帕金森病又稱震顫麻痹，是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，主要病理表現(xiàn)為Lewy 體形成，中腦多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，紋狀體多巴胺含量顯著減少[3]。研究表明氧化應(yīng)激是帕金森病發(fā)病機(jī)制中最常見的原因之一[4]。氧化應(yīng)激通常指抗氧化物和氧化物間的失衡而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，包括抗氧化物如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物還原酶家族、谷胱甘肽過氧化物酶等，以及氧化物如丙二醛、硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)、丙烯醛等[5]。ROS 可以攻擊核酸導(dǎo)致DNA 單鏈和雙鏈斷裂，DNA 蛋白交聯(lián)、嘌呤和嘧啶堿基改變以及導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼RNAs 和非編碼RNAs 的氧化修飾，可以攻擊蛋白質(zhì)的骨干和側(cè)鏈，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集[6]。同時，ROS 系統(tǒng)具有多種生物學(xué)作用，參與了激酶級聯(lián)反應(yīng)的活化，鈣動員和信號傳導(dǎo)、微調(diào)控氧化還原敏感性基因的表達(dá)、在神經(jīng)干細(xì)胞的分化以及神經(jīng)發(fā)生中起作用[7-13]。在帕金森病患者的血液中還原型谷胱甘肽顯著高于正常組，而其它抗氧化因子濃度和過氧化氫酶的活性均有下降[14]。

長時間接觸農(nóng)藥證實與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病相關(guān)，這些農(nóng)藥包括百草枯、代森錳、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、甲氰菊脂以及有機(jī)磷等。這些農(nóng)藥均可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激。已被確定與帕金森病發(fā)病相關(guān)的環(huán)境毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶就可通過增加多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)的氧化應(yīng)激[15]。魚藤酮是一種線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的抑制劑，能夠通過抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ，產(chǎn)生能量危機(jī)，而增加ROS 和OS 的產(chǎn)生，從而抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞作用，造成跨膜電位差改變及線粒體膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能喪失，氧化應(yīng)激激活，細(xì)胞凋亡壞死，最終造成在黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的損失[16]。本課題組既往研究也顯示觸發(fā)氧化應(yīng)激可以使暴露于氧化劑或淀粉樣蛋白-B 的肽（抗體）誘導(dǎo)的半胱氨酸殘基有利于分子間二硫鍵和隨后形成細(xì)胞質(zhì)聚集體的不可逆氧化，這種不溶性蛋白質(zhì)可能最終促進(jìn)細(xì)胞死亡[17]。本研究通過魚藤酮處理多巴胺能神經(jīng)母細(xì)胞系SH-SY5Y 細(xì)胞，證明其結(jié)果能造成氧化應(yīng)激，這一定程度上可以模仿農(nóng)藥等毒物造成帕金森病的機(jī)制。

許多抗氧化劑的研究也證實對帕金森病有神經(jīng)保護(hù)作用。如銀杏葉提取物可對抗MPP+的神經(jīng)毒性作用[18]，另一項研究表明銀杏葉提取物對MPTP 引起的氧化應(yīng)激有保護(hù)作用[19]。促甲狀腺激素釋放激素因其抗氧化應(yīng)激、抗谷氨酸鹽的毒性作用、抗caspase誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡、阻止DNA 片段化和抗炎作用而被研究于神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病如阿爾茨海默病與帕金森病[20]。既往本課題組研究也證實，通過敲低GAPDH 或者給予銀杏葉提取物可以抑制氧化應(yīng)激水平，從而改善魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡[21]。

綜上所述，本研究通過魚藤酮處理多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果造成細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高，脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，SOD 水平下降，而抑制魚藤酮通過氧化應(yīng)激途徑誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷是治療帕金森病的潛在策略。本研究僅限于體外細(xì)胞研究，有待進(jìn)一步進(jìn)行動物研究和人群研究證實降低氧化應(yīng)激水平治療帕金森病的有效性和安全性。