廖建青 呂靜 張英杰 謝邦 馬富文 王琦

1云南中醫(yī)藥大學（昆明650500）；2云南省中醫(yī)醫(yī)院（昆明650021）

膝關節(jié)骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是常見于中老年人的一種慢性骨關節(jié)疾患，與年齡、性別、肥胖、居住環(huán)境潮濕陰暗、站姿工作習慣、重體力勞動職業(yè)、膝關節(jié)外傷史、基因等因素相關［1?3］。其主要臨床表現為膝關節(jié)疼痛、腫脹、畸形、失去活動能力，疼痛可在活動時、上下樓梯時加重，關節(jié)局部有壓痛［4］。相關研究顯示，我國人口老齡化比例不斷上升，40 歲以上中老年人KOA 總患病率為17.0%，且隨年齡增長患病率呈不斷上升的趨勢［5?6］。晚期膝骨關節(jié)炎主要以手術治療為主［7］，而早中期多數患者更愿意選擇中醫(yī)藥保守治療。因此，在中醫(yī)藥中尋找安全有效防治KOA 的藥物，以提高患者的生活質量、延長壽命成為現代中醫(yī)藥研究的一大熱點。研究表明PI3K/AKT 信號傳導通路在KOA 的發(fā)病機制中尤為重要，對軟骨細胞增殖、凋亡具有重要的調控作用［8?9］，本課題基于PI3K/AKT 信號傳導途徑來探討具有活血通絡作用的骨痹合劑防治KOA 的分子機制，從現代分子生物學角度揭示KOA 的發(fā)生發(fā)展機制與中醫(yī)學論治“活血通絡，通則不痛”相關理論的內在關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級C57 小鼠60 只，體質量（19.6±0.6）g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物許可證號：SCXK（蘇）2017?0001。小鼠置于IVC 動物實驗房中，隨機每籠5 只。正常飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，室溫20～24 ℃，相對濕度42%～53%，日照時間為每天10～12 h，空氣流通。本研究通過云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查，倫理批件號：動物2016?001。

1.2 實驗試劑 甲苯胺藍染液（Aladdin T104232）；蘇木素染液（珠海貝索BA4097）；Tunel試劑盒（南京凱基生物KGA704）；DAB 顯色劑（DAKO K5007）；TEMED（Alladin T105496）；甘氨酸（Solarbio G8200）；蛋白酶抑制劑cocktail（Roche 4693116001）；HRP 抗小鼠抗體（Beyotime A0216）；HRP 抗兔抗體（Beyotime A0208）；HRP 抗山羊抗體（Beyotime A0181）。

1.3 實驗儀器 組織脫水機PQT?A、組織包埋機PBM?A、組織攤片機PHY?Ⅲ（常州普瑞斯星醫(yī)療器械有限公司）；病理切片機RM2235（上海徠卡儀器有限公司）；顯微鏡（日本尼康，NIKON H550S）；濕法轉膜儀170?3930 Bio?Rad。

1.4 實驗藥物 骨痹合劑（滇藥制字（Z）04A01888）由云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供；氨糖美辛腸溶片（國藥準字H20023171）購自上海華中藥業(yè)有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物模型制備 取10 周齡SPF 級C57 雄性小鼠60 只，4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，小鼠膝關節(jié)部位剃毛、備皮消毒，取髕旁內側切口顯露膝關節(jié)，切斷前交叉韌帶，止血，關節(jié)腔逐層閉合。術后3 d 每天予每只小鼠肌肉注射青霉素（8 萬單位/kg）以預防感染。

1.5.2 動物分組、給藥及取材切片 造模8 周后，60 只小鼠稱重記錄并隨機分為骨痹合劑組、氨糖美辛組、生理鹽水組3 組，每組20 只。自由進食飲水1 周后，骨痹合劑組小鼠予骨痹合劑13 mL/（kg·次）灌胃，氨糖美辛組小鼠予19.5 mg/（kg·次）灌胃，對照組予等體積生理鹽水灌胃；每日上、下午各一次。灌胃8 周后小鼠4%戊巴比妥鈉腹腔過麻處死，分離膝關節(jié)并保留其相連的脛骨和股骨，取下雙膝關節(jié)，固定新鮮組織于4%多聚甲醛24 h 以上，將膝關節(jié)組織部位用手術刀修平整后，對應標簽置于脫水盒中，再放入脫水機內依次梯度酒精予脫水、浸蠟、包埋處理。-20 ℃凍臺冷卻，蠟凝固后取出修整，切片，片厚4 μm。于攤片機40 ℃溫水上將切片組織展平后用載玻片撈起，烤片，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 甲苯胺藍染色 石蠟切片至水，置于60 ℃溫箱用0.5%甲苯胺藍染色40 min，95%乙醇鏡下控制分色，將切片依次放入無水乙醇Ⅰ5 min ?無水乙醇Ⅱ5 min?二甲苯Ⅰ5 min ?二甲苯Ⅱ5 min 中脫水透明，取出稍晾干后中性樹膠封片，顯微鏡下鏡檢，并作圖像采集分析。

1.5.4 Tunel 法檢測細胞凋亡 石蠟切片至水，滴加蛋白酶K 工作液覆蓋組織，37 ℃溫箱孵育30 min，置于PBS 中洗3 次，每次5 min。切片稍甩干滴加破膜工作液覆蓋組織，重復上述操作。采用Tunel 試劑盒按照說明書操作進行細胞凋亡鑒定，細胞凋亡結果判定：切片中軟骨細胞細胞核內棕黃色顆粒者為陽性細胞，凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.5.5 蛋白質免疫印跡法（Western blotting）檢測各組軟骨細胞中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白的表達 取分離好的軟骨組織約50 mg，研磨收集骨粉加入1 000 μL RIPA 裂解液，在冰上裂解30 min，離心，取上清轉移至1.5 mL 離心管中，-20 ℃保存，測定蛋白含量。清洗玻璃板、灌膠、上樣，電泳，終止電泳，轉膜。膜晾干后，TBS 浸濕，再移至含有封閉液（5%脫脂奶粉TBST 溶液）的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。用含5% BSA 的TBST溶液按照1∶1 000 稀釋于4 ℃孵育過夜。用TBST按照1∶5 000 稀釋，室溫下孵育2 h 后，用TBST 在室溫下脫色搖床上洗3 次，每次10 min；進行化學發(fā)光，于Tanon5200 化學發(fā)光成像儀下拍照，獲取圖片。

1.6 統計學方法 應用SPSS 17.0 軟件對數據進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組之間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲苯胺藍對各組軟骨細胞的染色情況 與生理鹽水組比較，骨痹合劑組與氨糖美辛組軟骨組織有明顯改善，甲苯胺藍染色較深，見圖1。

圖1 各組軟骨細胞的甲苯胺藍染色的不同表達情況Fig.1 Different expressions of toluidine blue staining in chondrocytes of each group

2.2 Tunel 法檢測各組軟骨細胞凋亡情況 與生理鹽水組相比較，骨痹合劑組與氨糖美辛組軟骨組織細胞凋亡明顯減少（P<0.01），見表1、圖2。

圖2 Tunel 檢測各組軟骨細胞凋亡水平的表達Fig.2 Expression of apoptotic level of chondrocytes in each group detected by TUNEL

表1 各組200 倍視野下凋亡細胞數目Tab.1 The number of apoptotic cells in each group at 200 times field of vision ±s

表1 各組200 倍視野下凋亡細胞數目Tab.1 The number of apoptotic cells in each group at 200 times field of vision ±s

注：**表示P<0.01

組別凋亡細胞數目生理鹽水組27.67±4.04骨痹合劑組11.00±4.36**氨糖美辛組11.67±3.06**

2.3 蛋白質免疫印跡法（Western blotting）檢測各組PI3K、AKT 和mTOR 蛋白的表達 與生理鹽水組比較，骨痹合劑組小鼠關節(jié)軟骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達下降（均P< 0.05）；氨糖美辛組小鼠關節(jié)軟骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達均下降（P<0.01），見圖3。

圖3 蛋白質免疫印跡法檢測各組軟骨細胞內PI3K、AKT、mTOR 蛋白的表達Fig.3 Expression of PI3K/Akt /mTOR protein in chondrocytes of the each group detected by Western blotting

3 討論

本研究主要通過切斷前交叉韌帶法以建立KOA 小鼠模型。膝關節(jié)炎的造模方法主要有關節(jié)內手術（Hulth 法、前交叉韌帶切斷法、半月板切除法、軟骨缺損法、破壞關節(jié)穩(wěn)定術、破壞關節(jié)血液循環(huán)術），非手術方法（關節(jié)制動、寒冷刺激、關節(jié)撞擊）；關節(jié)腔內注射藥物法（尿激酶型纖溶酶原激活物、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶等）［10］。通過甲苯胺藍染色發(fā)現生理鹽水組中軟骨表面缺損，染色基本缺失，Tunel 法檢測到軟骨表面大量細胞凋亡，說明本次造模KOA 凋亡模型成功。在動物試驗中公認的造模方式多樣，但整個造模過程對實驗動物造成了極大痛苦，如何能減輕實驗動物的痛苦而取得需要的實驗模型，是未來實驗研究的方向所在，如何通過正常的軟骨細胞運用藥物誘導或物理作用的方式取得成功實驗模型，本課題將在進一步細胞實驗中進行研究。

膝關節(jié)骨關節(jié)炎主要以關節(jié)軟骨退變?yōu)椴±硖卣鳎m然正常軟骨細胞也存在凋亡現象，但應激狀態(tài)下的軟骨細胞過度凋亡會導致軟骨基質變化，以致軟骨發(fā)生退行性改變［11］。細胞凋亡是受基因調控的一種細胞程序性死亡的過程，參與生理和病理過程，而PI3K/AKT/mTOR 信號通路為調控軟骨細胞增殖生長、凋亡及軟骨細胞外基質重塑方面的一條重要通路［12］。PI3K 是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，由調節(jié)亞基p85 和催化亞基p110 構成［13］，AKT 又稱PKB（protein kinase B），是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，能調控各種不同細胞的生長代謝、轉錄以及蛋白質合成。當PI3K 接收細胞膜上的各種傳入信號后直接或間接激活下游部位的AKT，后者磷酸化作用于P53、NF?κB 及Caspase?9 而發(fā)揮特異性的生物學作用［14?15］。XU等［16］研究發(fā)現抑制PI3K/AKT/NF?κB 信號通路的激活能抑制軟骨細胞的凋亡，減輕骨性關節(jié)炎炎癥反應。段志遠等［17］研究發(fā)現蛇床子素可顯著降低PI3K、AKT 及NF?κB 蛋白的表達，緩解KOA 大鼠關節(jié)軟骨退變。NF?κB 是PI3K/AKT 下游靶蛋白之一，是參與炎癥、免疫反應和細胞凋亡的重要信號通路［18］。XUE 等［19］研究發(fā)現抑制PI3K/AKT 通路能誘導細胞自噬，減輕炎癥反應。細胞自噬參與了關節(jié)軟骨退化的過程，而mTOR 是自噬的主要負性調節(jié)因子，mTOR 通路被抑制可誘導自噬，從而起到保護軟骨細胞的作用［20?21］。mTOR 也具有調控KOA 關節(jié)軟骨退變的作用［22］。因此，mTOR 是細胞凋亡及自噬信號傳導通路的交匯點，對細胞的凋亡和自噬都具有關鍵性的調控作用［23?24］。

我院骨傷科在多年來運用中醫(yī)藥治療膝關節(jié)骨關節(jié)炎的學術思想及臨床經驗的基礎上，采用具有活血通絡作用的骨痹合劑進行治療，其主要成分包括當歸、丹參、紅花、桂枝、桑寄生、地龍、杜仲、枸杞、蒼術、細辛等十多味藥物，全方以活血通絡為主，又兼祛風除濕、補益肝腎。前期臨床試驗和基礎研究表明以具有活血通絡作用的骨痹合劑治療KOA 作用機理是通過改善軟骨退變過程中的軟骨機制代謝、抑制氧自由基損傷、軟骨細胞凋亡及調節(jié)細胞因子等多種生物學效應，從多途徑、多靶點延緩軟骨退變，控制KOA 進展［25］，但其具體作用機制尚未明確。本次課題研究結果顯示：甲苯胺藍染色中，生理鹽水組中軟骨表面可見缺損，軟骨表面大量細胞凋亡；而骨痹合劑組與氨糖美辛組染色較深，軟骨組織有明顯改善，細胞凋亡明顯減少（P<0.01），說明骨痹合劑能減少KOA 軟骨細胞凋亡；相比生理鹽水組，骨痹合劑組小鼠關節(jié)軟骨中PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達均下降（均P< 0.05）；氨糖美辛組小鼠關節(jié)軟骨中PI3K、AKT和mTOR 蛋白表達均下降（P< 0.01），說明具有活血通絡作用的骨痹合劑能下調PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達，抑制PI3K/AKT 信號通路，從而減少軟骨細胞凋亡，緩解KOA 小鼠的炎癥反應。

綜上所述，具有活血通絡作用的骨痹合劑對KOA 小鼠軟骨細胞具有明顯的改善作用，其作用機制是下調PI3K、AKT 和mTOR 蛋白表達，抑制PI3K/AKT 信號通路，從而減少軟骨細胞凋亡，以緩解膝骨性關節(jié)炎進一步發(fā)展。