李媛 龍富立 張衎 官志杰 姚凡 彭云鶴 舒發(fā)明 唐春回 毛德文 黃古葉

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科（南寧530023）；2廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地（南寧530023）；3廣西巴馬瑤族自治縣民族醫(yī)院（廣西河池547500）

乙肝肝硬化（hepatitis B cirrhosis，HBC）是一種由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）持續(xù)感染所引起的慢性、彌漫性肝損傷疾?。?］。近年來，中藥已成為治療HBC 的首選藥物之一［2］。健肝顆粒是依據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)研制的經(jīng)驗(yàn)方，具有良好的抗肝纖維化、抗脂質(zhì)過氧化物形成等效果，可顯著改善乙肝患者肝功能［3］，應(yīng)用前景良好。CD4+T 細(xì)胞的凋亡壞死是HBV 感染后導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能障礙的重要原因之一［4］。最新研究表明，線粒體自噬在肝臟免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中具有重要作用［5］，PINK1/Parkin/ROS 介導(dǎo)的線粒體自噬可提高細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡［6］，這有利于CD4+T 細(xì)胞的存活及免疫功能的發(fā)揮。故本研究擬通過采集臨床HBC 代償期患者經(jīng)常規(guī)抗病毒治療及聯(lián)合健肝顆粒治療后外周血，基于線粒體自噬PINK1/Parkin/ROS 信號通路，探究健肝顆粒對磁珠分選CD4+T細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的作用機(jī)制，旨在為健肝顆粒的開發(fā)及應(yīng)用提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 健肝顆粒組方（田七10 g，地龍10 g，半夏10 g，川芎10 g，白芍10 g）由我院藥劑科提供。

1.2 患者一般資料 隨機(jī)選取2018年7月至2019年12月在我院就診的HBC 代償期患者100 例，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組各50 例；其中，對照組男27 例，女23 例，年齡（40.2±9.5）歲；觀察組男25 例，女25 例，年齡（40.9 ± 10.6）歲；另外，隨機(jī)選取同期至我院的健康體檢者共50 例為正常組，男28 例，女22 例，年齡（41.2 ± 12.8）歲。各組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年）》HBC 診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，知情并同意參與本研究（倫審2019?011?01）?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn)：合并其他病毒感染，如：甲/丙/丁/戊型肝炎病毒、艾滋病毒、梅毒等，合并酒精性肝病及自身免疫性疾病，接受手術(shù)、放化療及免疫治療的肝癌患者等。

1.3 試劑 CD4+T 細(xì)胞陽選試劑盒（Miltenyi 130?090?860）；ROS 試劑盒（mlbio，ml009876?1）；MDA試劑盒（Elabscienc，E?EL?0060c）；SOD 試劑盒（Elabscience E?BC?K019?S）；Annexin V FITC/PI 試劑盒（Solarbio CA1020?50T）；JC?1 熒光探針試劑盒（碧云天C2006）；Anti?PINK1 antibody（abcam，ab216144）；Anti?Parkin antibody（abcam，ab77924）；Anti?LC3?Ⅱantibody（abcam，ab48394）；Anti?Bax antibody（abcam，ab32503）；Anti?Bcl?2 antibody（ab?cam，ab59348）；Anti? β ?actin antibody（abcam，ab8227）；山羊抗鼠二抗（Sigma A9309）；山羊抗兔二抗（Sigma A9169）。

1.4 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（新加坡ESCO，CLM?170B?8?NF）、流式細(xì)胞儀（BD FACSMelody）、多功能酶標(biāo)儀（美國MD FilterMax F3）、電泳儀（Bio?Rad Power?Pac Basic）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能Tanon 5200）。

1.5 方法

1.5.1 治療方法及樣品處理 對照組采用恩替卡韋（博路定，國藥準(zhǔn)字H20052237，0.5 mg*7 片）治療，0.5 mg/次，1 次/d。觀察組采用健肝顆粒聯(lián)合恩替卡韋治療，恩替卡韋0.5 mg/次，1 次/d，健肝顆粒1 包/次，2 次/d，兩組均治療3 個(gè)月。分別采集對照組和觀察組患者治療前、后及正常組的外周靜脈血各5 mL，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常組靜脈血經(jīng)磁珠分選得到CD4+T 細(xì)胞后，分為Control 組、H2O2組和H2O2+CCCP（線粒體自噬激活劑）組，并進(jìn)行以下處理［8］：H2O2組使用100 μmol/L H2O2培養(yǎng)24 h，H2O2+CCCP 組使用100 μmol/L H2O2和5 μmol/L CCCP 共培養(yǎng)24 h。

1.5.2 免疫磁珠分選CD4+T 細(xì)胞 使用10 mL PBS 稀釋血液樣本后，加入10 mL 淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法分離外周靜脈血中單核細(xì)胞，使用含10%血清RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，為單核細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)后按照1 × 107個(gè)細(xì)胞加入含10%磁珠的磁珠分選緩沖液100 μL，充分混勻后于4 ℃冰箱中避光孵育15 min。根據(jù)CD4+T 細(xì)胞陽選試劑盒進(jìn)說明書行操作，經(jīng)過柱、洗脫、洗滌及離心等步驟得到CD4+T 細(xì)胞團(tuán)，使用RPMI1640 培養(yǎng)液洗滌重懸，按每孔2×106/2 mL 密度接種于6 孔板中培養(yǎng)。

1.5.3 Western blot 法檢測PINK1/Parkin 通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá) 各組樣品使用RIPA 消化，收集細(xì)胞裂解液。BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測定，5 × Load?ing buffer 混勻，沸水浴5 min；每泳道上樣20 μg 蛋白，SDS?PAGE 電泳，切膠，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉浸泡，室溫封閉約1 h。將膜與一抗于4 ℃過夜孵育，1 × TBST 清洗；二抗37 ℃孵育1 h，1 × TBST 清洗；顯色曝光后行底片掃描，統(tǒng)計(jì)蛋白灰度值。

1.5.4 Annexin V FITC/PI 檢測細(xì)胞凋亡 使用4 ℃PBS 洗滌待檢測細(xì)胞，離心后使用1 mL Bind?ing Buffer 重懸細(xì)胞，取出100 μL 細(xì)胞，加入5 μL Annexin V?FITC，室溫避光孵育10 min，后加入5 μL PI，室溫避光孵育5 min，隨后加入400 μL PBS，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.5.5 JC?1 熒光探針檢測線粒體膜電位 取各組細(xì)胞種于12 孔板中，待細(xì)胞融合至80%棄去培養(yǎng)基，加入終濃度為1 μg/mL 的JC?1 熒光探針染料，培養(yǎng)箱中孵育20 min，JC?1 染色緩沖液清洗后，加入1 mL 培養(yǎng)基，使用流式細(xì)胞儀檢測紅色熒光強(qiáng)度，紅色熒光越強(qiáng)，線粒體膜電位越高。

1.5.6 ELISA法檢測ROS、MDA、SOD的含量 根據(jù)ROS、MDA、SOD ELISA 試劑盒使用說明進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值（OD），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清ROS、MDA、SOD含量及CD4+T 細(xì)胞ROS 含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健肝顆粒對HBC 代償期患者氧化應(yīng)激水平的影響 ELISA 檢測結(jié)果顯示，相較于正常組，對照組和觀察組治療前的ROS 和MDA 含量升高，SOD 含量降低（P< 0.05）；相較于治療前，對照組和觀察組治療后的ROS 和MDA 含量降低，SOD 含量升高（P< 0.05），且觀察組治療后與對照組治療后的比較結(jié)果與之一致（P< 0.05）；對照組和觀察組治療前的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1?3。

圖1 各組血清中ROS 含量的比較Fig.1 Comparison of the content of ROS in serum of each group

圖2 各組血清中MDA 含量的比較Fig.2 Comparison of the content of MDA in serum of each group

圖3 各組血清中SOD 含量的比較Fig.3 Comparison of the content of SOD in serum of each group

2.2 健肝顆粒對HBC 代償期患者CD4+T 細(xì)胞凋亡的影響 Western blot 和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，相較于正常組，對照組和觀察組治療前的Bax表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均升高，Bcl?2 的表達(dá)降低（P<0.05）；相較于治療前，對照組和觀察組治療后的Bax 表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均降低，Bcl?2 的表達(dá)升高（P< 0.05），且觀察組治療后與對照組治療后的比較結(jié)果與之一致（P< 0.05）；對照組和觀察組治療前的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見圖4、5。

圖4 各組細(xì)胞中Bax 和Bcl?2 蛋白表達(dá)水平比較Fig.4 Comparison of protein expression levels of Bax and Bcl?2 in cells of each group

圖5 各組細(xì)胞凋亡率的比較Fig.5 Comparison of apoptosis rate in cells of each group

2.3 線粒體自噬對體外誘導(dǎo)的CD4+T 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的影響 通過H2O2誘導(dǎo)建立CD4+T 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，并使用線粒體自噬誘導(dǎo)劑CCCP 上調(diào)線粒體自噬水平，結(jié)果顯示，相較于Control 組，H2O2組的ROS 含量和細(xì)胞凋亡率升高，LC3?Ⅱ的表達(dá)降低（P<0.05）；而相較于H2O2組，H2O2+CCCP組的ROS 含量和細(xì)胞凋亡率降低，LC3?Ⅱ的表達(dá)升高（P<0.05）。見圖6?8。

圖6 各組細(xì)胞中ROS 含量Fig.6 Comparison of ROS content in cells of each group

圖7 各組細(xì)胞中LC3?Ⅱ蛋白表達(dá)水平的比較Fig.7 Comparison of protein expression levels of LC3?Ⅱin cells of each group

圖8 各組細(xì)胞凋亡率的比較Fig.8 Comparison of apoptosis rate in cells of each group

2.4 健肝顆粒對患者CD4+T 細(xì)胞線粒體自噬的影響 Western blot 和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，相較于正常組，對照組和觀察組治療前的PINK1、Parkin 和LC3?Ⅱ蛋白表達(dá)水平以及線粒體膜電位水平均降低（P< 0.05）；相較于治療前，對照組和觀察組治療后的PINK1、Parkin 和LC3?Ⅱ蛋白表達(dá)水平以及線粒體膜電位水平均升高（P< 0.05），且觀察組治療后與對照組治療后的比較結(jié)果與之一致（P< 0.05）；對照組和觀察組治療前的結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖9、10。

圖9 各組細(xì)胞中PINK1、Parkin 和LC3?Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較Fig.9 Comparison of expression levels of PINK1，Parkin and LC3?Ⅱin cells of each group

圖10 各組細(xì)胞中線粒體膜電位水平比較Fig.10 Comparison of mitochondrial membrane potential levels in cells of each group

3 討論

肝纖維化是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)過程，代償期是疾病進(jìn)展的早期階段，可有效逆轉(zhuǎn)［9］。肝損傷和肝纖維化的初期，持續(xù)的、不可逆的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞功能異常，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。研究表明，ROS 的過量蓄積可促進(jìn)肝纖維化的形成［11］。MDA 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈的終產(chǎn)物，SOD 是機(jī)體抗氧化體系的主要酶類。本研究發(fā)現(xiàn)，HBC 代償期患者血清ROS 和MDA 含量升高，SOD 含量降低，與既往研究結(jié)果一致［12-13］，表明HBC 代償期患者機(jī)體呈現(xiàn)高氧化應(yīng)激狀態(tài)，提示抗氧化治療是促進(jìn)疾病轉(zhuǎn)歸的重要手段。

祖國醫(yī)藥認(rèn)為，肝硬化屬“黃疸”、“脅痛”、“瘀血”、“積聚”的范疇，其病機(jī)主要為濕熱所致毒損肝絡(luò)，氣滯血瘀，濕濁積聚，而致毒、痰、瘀互結(jié)［14］。健肝顆粒組方，具有活血益氣、去瘀生新、清肺化痰、柔肝止痛、疏肝開郁等功效。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用健肝顆粒治療HBC 代償期患者，可有效降低ROS 和MDA 含量，增加SOD 含量，降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，且效果優(yōu)于單用恩替卡韋，表明健肝顆粒可抑制HBC 代償期患者的氧化應(yīng)激水平，抗氧化效應(yīng)顯著。

臨床研究表明，慢性HBV 持續(xù)感染會致先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)功能障礙，涉及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞［15］。其中，特異性CD4+T細(xì)胞通過識別肝細(xì)胞表面的HBV 產(chǎn)生特異性細(xì)胞因子，從而參與肝臟的免疫應(yīng)答，對HBV 的殺滅、清除具有關(guān)鍵作用。研究表明，由CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在肝硬化患者中免疫應(yīng)答微弱，且CD4+T 細(xì)胞凋亡與肝硬化進(jìn)程及歸轉(zhuǎn)有關(guān)［16-17］。在細(xì)胞凋亡機(jī)制中，促凋亡因子Bax 和抑凋亡因子Bcl?2 的異常表達(dá)可促進(jìn)肝臟疾病進(jìn)展［18?19］。既往研究已表明，健肝顆粒治療乙型肝炎患者可提高外周血CD4+T 細(xì)胞計(jì)數(shù)及患者細(xì)胞免疫功能，且療效優(yōu)于單用恩替卡韋［20］，提示健肝顆粒對HBC 的作用機(jī)制與CD4+T 細(xì)胞有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，健肝顆粒聯(lián)合恩替卡韋可顯著降低CD4+T 細(xì)胞凋亡率，抑制Bax，上調(diào)Bcl?2，效果優(yōu)于單用恩替卡韋，表明健肝顆?？赡芡ㄟ^抑制CD4+T 細(xì)胞凋亡，進(jìn)而調(diào)節(jié)HBC 患者細(xì)胞免疫功能。

機(jī)體氧化與抗氧化失衡時(shí)，可致ROS 過量生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體是ROS 生成的“能量工廠”，其功能障礙可增加ROS 水平，引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷［21］，促進(jìn)肝纖維化。在正常情況下，線粒體可啟動線粒體自噬機(jī)制，通過選擇性自噬清除受損線粒體，維持線粒體膜電位以及限制ROS 過量累積，從而維持氧化/抗氧化平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可提高CD4+T 細(xì)胞ROS 含量和細(xì)胞凋亡率，與HBC 患者機(jī)體高氧化應(yīng)激狀態(tài)以及細(xì)胞免疫功能障礙機(jī)制一致，而CCCP 誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生可降低ROS 含量，減少CD4+T 細(xì)胞凋亡，表明激活線粒體自噬有利于抑制CD4+T 細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)氧化/抗氧化平衡。

PINK1/Parkin 通路是介導(dǎo)線粒體自噬的重要途徑。研究表明，線粒體功能障礙可加速肝纖維化進(jìn)程，而上調(diào)PINK1 蛋白水平可發(fā)揮抗肝纖維化作用［22］，表明PINK1/Parkin 通路與肝纖維化進(jìn)程有著密切的聯(lián)系。自噬標(biāo)記物L(fēng)C3?Ⅱ定位于自噬小體，是檢測自噬水平的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)，HBC 代償期患者CD4+T 細(xì)胞中PINK1、Parkin 和LC3?Ⅱ蛋白表達(dá)以及線粒體膜電位水平均顯著低于正常者，表明患者CD4+T 細(xì)胞的線粒體自噬水平被抑制，這可能是加重HBC 患者機(jī)體高氧化應(yīng)激狀態(tài)以及細(xì)胞免疫功能障礙的重要機(jī)制。此外，相較于單用恩替卡韋，聯(lián)合健肝顆粒治療可上調(diào)患者CD4+T 細(xì)胞中PINK1、Parkin、LC3?Ⅱ的表達(dá)，升高線粒體膜電位，表明健肝顆?？赡芡ㄟ^激活PINK1/Parkin 通路進(jìn)而抑制HBC 進(jìn)展。由此可推測，在HBC 患者外周血CD4+T 細(xì)胞中，PINK1/Parkin 通路介導(dǎo)的線粒體自噬被抑制或功能無法正常發(fā)揮，使受損線粒體無法及時(shí)清除，導(dǎo)致ROS過量蓄積，細(xì)胞氧化與抗氧化機(jī)制失衡，出現(xiàn)高氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，致使細(xì)胞免疫障礙，加速了肝硬化進(jìn)程。而健肝顆?？赏ㄟ^上調(diào)粒體自噬水平，發(fā)揮抗氧化效應(yīng)，抑制CD4+T 細(xì)胞凋亡，進(jìn)而治療HBC。

綜上所述，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的CD4+T 細(xì)胞凋亡是促進(jìn)HBV 感染，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化發(fā)展至HBC的重要因素之一。在HBC 代償期患者中，健肝顆?？赏ㄟ^PINK1/Parkin/ROS 通路誘導(dǎo)線粒體自噬抑制HBC 患者CD4+T 細(xì)胞凋亡，阻斷肝硬化進(jìn)程，極具臨床應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步推廣。