張海弢，付娟，李曼曼，范業(yè)文，李旭

江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（連云港 222001）

黃精靈芝膠囊由黃精、靈芝、紅景天等中藥組成，具有緩解體力疲勞的保健功能。保健食品復(fù)方多采取傳統(tǒng)水提的方式，水提取工藝有較高的安全性。由于在水提過(guò)程中，多糖、脂溶性色素等會(huì)隨有效成分一起溶出[1]。在水提液中加入適量乙醇，即可沉淀除去其中的雜質(zhì)[2]。復(fù)方組分具有多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn)[3]，決定工藝指標(biāo)評(píng)價(jià)逐步由單一轉(zhuǎn)向多個(gè)，以體現(xiàn)整體性和合理性[4]。綜合評(píng)價(jià)是利用數(shù)學(xué)方法（包括數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法）[5-7]對(duì)一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)進(jìn)行分析處理，是一種對(duì)多個(gè)指標(biāo)、多個(gè)單位同時(shí)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)的方法。為保證制劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性，提高有效成分的含量，以醇沉后紅景天苷轉(zhuǎn)移率、粗多糖轉(zhuǎn)移率和浸膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選水提液的醇沉工藝。

1 儀器和試藥

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20AT液相色譜儀（日本島津）；UV-2700紫外分光光度計(jì)（日本島津）；HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TDL-5-A離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；H1650-W離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；BSA224S-CW電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）；BP211D電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）；KQ-250DB型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

黃精（云南白藥集團(tuán)文山七花有限責(zé)任公司經(jīng)營(yíng)分公司）；靈芝（亳州市宏大中藥飲片科技有限公司）；紅景天（亳州市國(guó)一堂中藥飲片有限公司）；紅景天苷（99.4% 110818-201707）、D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（99.5% 110833-201205）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜甲醇（19025121，美國(guó)天地公司）；其他試劑除特殊說(shuō)明，所用試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分測(cè)定

2.1.1 紅景天苷的測(cè)定方法

紅景天苷的測(cè)定按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》（2003年版）[8]中“保健食品中紅景天苷的測(cè)定”進(jìn)行。

2.1.1.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol/L乙酸鈉（9∶91）。

2.1.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取適量紅景天苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的紅景天苷溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)液。

2.1.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取5 g上清液，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，離心，即得。

2.1.1.4 線性關(guān)系考察

將2.1.1.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成質(zhì)量濃度分別為10.06，25.14，52.08，201.11和502.77 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。按照2.1.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以紅景天苷對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y1），以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X1），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y1=12790904X1+1639（R2=1.0000），結(jié)果表明，紅景天苷在10.06～502.77 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 紅景天苷對(duì)照品（A）、供試品（B）HPLC圖

2.1.1.5 精密度試驗(yàn)

取紅景天苷對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為25.14 μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得紅景天苷峰面積的SRSD值為0.37%，表明該方法精密度良好。

2.1.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于第0，第2，第4，第8，第12和第24小時(shí)注入液相色譜儀，測(cè)得紅景天苷的峰面積的SRSD值為0.60%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按照2.1.1.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定，6份供試品溶液中紅景天苷含量的SRSD值為0.34%，表明該方法重復(fù)性好。

2.1.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品，精密稱定6份，置10 mL容量瓶中，加入紅景天苷對(duì)照品。按照2.1.1.3項(xiàng)下方法制得供試品溶液，測(cè)定，平均回收率為100.11%，SRSD值為1.2%。

2.1.2 粗多糖的測(cè)定方法

粗多糖按照《保健食品功效成分檢測(cè)方法》中“粗多糖的測(cè)定方法”（苯酚-硫酸分光光度法）[9]規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

2.1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取適量D-無(wú)水葡萄糖，精密稱定，用純化水制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取1 g粗多糖，加水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并用純化水多次洗滌，洗滌液并入量瓶中，加水至刻度，搖勻，離心（5000 r/min，5 min），得上清液，備用。取2.5 mL上清液于50 mL離心管中，加入10 mL無(wú)水乙醇，混勻，于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，離心（4000 r/min，5 min），棄去上清液，殘?jiān)脭?shù)毫升80%（V/V）乙醇溶液洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，待用。精密量取1.0 mL于25 mL比色管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚試液，混合均勻后再加10.0 mL濃硫酸，于渦旋混合器混勻，在沸水浴中加熱2 min，取出置冰水浴中冷卻，待測(cè)。

2.1.2.3 線性考察

分別精密吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 2.1.2.1項(xiàng)下D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL比色管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚試液，混合均勻后再加10.0 mL濃硫酸，混勻，在沸水浴中加熱2 min，取出置冰水浴中冷卻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以試劑空白為參比，以吸光度為縱坐標(biāo)（Y2），D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X2），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y2=0.04111X2- 0.00505（R2=0.9991），結(jié)果表明，D-無(wú)水葡萄糖在0.815～8.15 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.1.2.4 精密度試驗(yàn)

取D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為4.89 μg/mL），在485 nm處連續(xù)測(cè)定6次，吸光度SRSD值為0.05%，說(shuō)明儀器精密度好。

2.1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.1.2.2的供試品制備方法制備6份供試品，測(cè)定吸光度，計(jì)算得到SRSD為1.89%（n=6），結(jié)果表明此法重復(fù)性良好。

2.1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性項(xiàng)下的供試品溶液，分別于第0，第0.5，第1，第2和第3小時(shí)測(cè)定供試品的吸光度，供試品溶液吸光度的SRSD值為0.27%，說(shuō)明供試品溶液在3 h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2.1.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取6份粗多糖供試品，按1∶1加入標(biāo)準(zhǔn)品，按照2.1.2.2項(xiàng)下方法制得供試品溶液，測(cè)定，平均回收率為100.15%，SRSD值為1.04%。

2.1.3 浸膏得率測(cè)定

精密量取V1（mL）待測(cè)樣品，置于已恒重蒸發(fā)皿中（M1），先在105 ℃水浴上揮干，再于105 ℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，取出置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重（M2），按式（1）計(jì)算浸膏得率。

式中：m為待測(cè)樣品中藥材總質(zhì)量，g；V1為精密量取的待測(cè)樣品體積，mL；V2為待測(cè)樣品總體積，mL；M1為已恒重蒸發(fā)皿的質(zhì)量，g；M2為烘干恒重后蒸發(fā)皿與干浸膏的總質(zhì)量，g。

2.2 基于信息熵理論的工藝評(píng)價(jià)

信息熵理論用于多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)時(shí)，相當(dāng)于將每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)作為1個(gè)隨機(jī)變量，通過(guò)計(jì)算各指標(biāo)的信息熵，從而給出各個(gè)指標(biāo)的不同權(quán)重。對(duì)于一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，其取值變異程度越大指標(biāo)越有序，信息熵就越小，其提供的信息量越多，該指標(biāo)就越重要，所占權(quán)重系數(shù)就越大[10]。信息熵理論在多屬性決策問(wèn)題中的應(yīng)用屬于客觀賦權(quán)法的一種，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理、計(jì)算和分析，其得到的權(quán)重系數(shù)可靠性更高。而權(quán)重系數(shù)在綜合評(píng)分中的分配直接關(guān)系工藝提取的科學(xué)性和合理性。

2.2.1 醇沉正交工藝試驗(yàn)

根據(jù)中藥材性質(zhì)及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，擬定藥液濃縮相對(duì)密度、醇沉?xí)r間、醇沉濃度作為主要考察因素，采用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，以醇沉后浸膏得率、粗多糖轉(zhuǎn)移率、紅景天苷轉(zhuǎn)移率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.2.2 醇沉工藝研究數(shù)據(jù)的處理

根據(jù)文獻(xiàn)所給出的步驟[11-12]，建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣，原始評(píng)價(jià)矩陣如式（2）所示。

將原始數(shù)據(jù)陣（X）轉(zhuǎn)為“指標(biāo)概率”矩陣（P），如式（3）所示。

計(jì)算信息熵值，確定第i項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的信息熵Hi，如式（4）所示。結(jié)果顯示Hi=[0.99780.99920.9936]。

按式（5）計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)Wi，Wi=[0.23020.08660.6832]。

2.2.3 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

對(duì)概率矩陣的數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)處理，得綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)M，Mm=P1m×W1+P2m×W2+P3m×W3+…Pnm×Wn，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定結(jié)果

表3 方差分析

由表2極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)綜合指標(biāo)的影響主次順序?yàn)镃＞B＞A，即醇沉濃度＞醇沉?xí)r間＞相對(duì)密度。以極差最小的D因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，C因素具有顯著性差異，A、B兩個(gè)因素?zé)o顯著性差異。最終確定最佳醇沉工藝A2B2C2，即藥液濃縮為相對(duì)密度1.10 g/mL，醇沉濃度為40%，醇沉?xí)r間為12 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證上述結(jié)論的準(zhǔn)確性，按照最佳工藝條件A2B2C2進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，并計(jì)算浸膏得率、粗多糖轉(zhuǎn)移率、紅景天苷轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表4。M的平均值是0.12081，SRSD為0.41%。結(jié)果表明，優(yōu)化后的醇沉工藝穩(wěn)定可行，符合生產(chǎn)實(shí)際和工業(yè)化生產(chǎn)。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

黃精靈芝膠囊是中藥復(fù)方制劑，具有緩解體力疲勞的保健功能，主要有效成分紅景天苷、粗多糖是重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，干浸膏得率也是工藝生產(chǎn)中權(quán)衡的重要指標(biāo)。醇沉是中藥提取過(guò)程中常用的工藝步驟。中藥水提液經(jīng)濃縮后在常溫或低溫下加入乙醇進(jìn)行醇沉，乙醇既作為溶劑，溶解濃縮液中的有效成分，又作為沉淀劑來(lái)沉淀水煎液中淀粉、樹(shù)膠、果膠、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)、蹂質(zhì)、色素、無(wú)機(jī)鹽等水溶性雜質(zhì)。

試驗(yàn)以藥效成分紅景天苷的轉(zhuǎn)移率、粗多糖的轉(zhuǎn)移率、干浸膏得率作為綜合評(píng)分指標(biāo)，在單因素基礎(chǔ)上采用L9(34)正交試驗(yàn)，基于信息熵理論對(duì)各指標(biāo)賦權(quán)重分析，優(yōu)選黃精靈芝膠囊的醇沉工藝。確定了藥液相對(duì)密度1.10 g/mL，醇沉?xí)r間12 h，醇沉濃度40%的最佳醇沉工藝參數(shù)，并進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示該工藝合理、穩(wěn)定、可行，為黃精靈芝膠囊的產(chǎn)業(yè)化研究提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。