李 博，陳中元，王京仁，王貴平

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.常德市農(nóng)業(yè)大分子研究中心，湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000）

1 發(fā)病情況

據(jù)場(chǎng)負(fù)責(zé)人反映，該場(chǎng)存欄經(jīng)產(chǎn)母豬400頭，肥育豬600頭，在2020年11月斷奶仔豬轉(zhuǎn)保育舍時(shí)，發(fā)現(xiàn)有仔豬腹瀉，并陸續(xù)出現(xiàn)死亡，且病死率比較高。仔豬死亡前耳朵發(fā)紫，同舍豬也陸續(xù)出現(xiàn)死亡。

2 臨床癥狀

送檢的4頭仔豬體溫在39～41 ℃，被毛粗亂，消瘦，眼瞼腫脹，精神沉郁；其中有兩只的耳部、背部、腹下發(fā)紺明顯，并且皮膚有出血斑點(diǎn)，后軀無力，四肢劃動(dòng)，呼吸困難。在解剖前有2頭已經(jīng)死亡。

3 病理變化

將送檢的4頭仔豬在指定的隔離區(qū)進(jìn)行解剖并詳細(xì)記錄剖檢變化。經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)，4頭仔豬腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)腫大，有心包積水，肺出血，呈間質(zhì)性肺炎；腎臟表面有出血點(diǎn)且被膜易剝離；脾臟腫大，肝臟出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)、腫大。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 材料

4.1.1 樣品處理 采集病豬的腎臟、淋巴結(jié)、肺等組織，取約1 g左右放入研磨管，加入適量生理鹽水，進(jìn)行充分研磨，研磨成勻漿后，移入1.5 mL離心管，4 ℃ 10 000 r/min，離心5 min，取上清液0.2 mL待用。

4.1.2 主要設(shè)備和試劑 主要檢測(cè)儀器：美國(guó)BIO-RAD公司熒光定量PCR儀、德國(guó)Biometra梯度PCR儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室室溫25 ℃（表1）。

表1 主要試劑及廠家

4.2 診斷方法

4.2.1 豬藍(lán)耳病病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 參照病毒核酸提取試劑盒說明書，提取組織樣品中豬藍(lán)耳病病毒RNA；按照豬藍(lán)耳病病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 30 min，95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，25 ℃ 10 s（40個(gè)循環(huán)）。

4.2.2 豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 參照病毒核酸提試劑盒說明書，提取組織樣品中豬圓環(huán)病毒2型DNA；按照豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，25 ℃ 10 s（35個(gè)循環(huán)）。

4.2.3 豬藍(lán)耳病病毒陽(yáng)性樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄 若對(duì)豬藍(lán)耳病病毒檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性，參照BioRT Master逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增（RT-PCR）試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min（35個(gè)循環(huán)）。

4.2.4 豬藍(lán)耳病病毒陽(yáng)性樣品測(cè)序 對(duì)豬藍(lán)耳病病毒陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序，并與不同藍(lán)耳病毒株進(jìn)行序列比對(duì)。

5 結(jié)果

5.1 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)。4份樣品中，豬藍(lán)耳病病毒陽(yáng)性樣品3份，1份樣品為可疑結(jié)果，豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性樣品4份。

5.2 豬藍(lán)耳病病毒陽(yáng)性樣品測(cè)序

用測(cè)序引物對(duì)1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)陽(yáng)性樣品出現(xiàn)目的條帶，4號(hào)可疑樣品沒有出現(xiàn)目的條帶，4份PCR擴(kuò)增結(jié)果詳見圖1。將3個(gè)豬藍(lán)耳病病毒檢測(cè)陽(yáng)性樣品的目的條帶切下，并分別裝入離心管中做好標(biāo)記，送往湖南擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1 4份豬藍(lán)耳病病毒樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果

5.3 豬藍(lán)耳病病毒基因遺傳進(jìn)化分析

將3個(gè)藍(lán)耳病陽(yáng)性樣品的基因與基因庫(kù)中藍(lán)耳病病毒毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系對(duì)比。結(jié)果如圖2，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)在同一個(gè)大分支上。1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)與15HUN3、JXA1-P160等高致病性毒株在同一個(gè)大分支上。說明它們的親緣關(guān)系較近。1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)與CH-1R、NADC30、CH-1a等低致病性毒株不在同一分支上，說明它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 豬藍(lán)耳病病毒株基因序列遺傳進(jìn)化樹

5.4 豬藍(lán)耳病病毒同源性序列分析

從同源性序列對(duì)比圖3中可以看出，1號(hào)樣品與HUN4的相似度最高，為98.9%；2號(hào)樣品與HUN4的相似度最高，為99.6%；3號(hào)樣品與JXA1-P160的相似度最高，為100%。

圖3 豬藍(lán)耳病病毒株同源性序列對(duì)比

5.5 結(jié)論

根據(jù)序列分析得出的結(jié)果可知，3個(gè)藍(lán)耳病陽(yáng)性分離株與高致病性毒株的同源性最高，推測(cè)這3個(gè)藍(lán)耳病陽(yáng)性分離株為高致病性毒株。并參考臨床癥狀和解剖病變?cè)\斷，該豬場(chǎng)暴發(fā)的病情為高致病性豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病毒2型混合感染。

6 討論

通過同源性序列對(duì)比圖可知1號(hào)、2號(hào)樣品與HUN4的相似度最高，而3號(hào)樣品與JXA1-P160的相似度為100%。說明該豬場(chǎng)已經(jīng)存在高致病性豬藍(lán)耳病病毒的流行。應(yīng)該對(duì)豬群進(jìn)行緊急接種，并對(duì)全場(chǎng)實(shí)行封閉管理，進(jìn)出的車輛進(jìn)行嚴(yán)格的消毒。對(duì)圈舍定期清理，通過通風(fēng)、換氣等措施提高空氣質(zhì)量。禁用變質(zhì)的飼料，適量的飼喂青綠飼料，做到營(yíng)養(yǎng)均衡[1]。定期進(jìn)行水質(zhì)測(cè)試，確保為豬提供清潔的水源[2]。對(duì)發(fā)病豬舍進(jìn)行徹底消毒，對(duì)病死豬進(jìn)行無害化處理，空欄7～10 d再進(jìn)豬。必須隔離和觀察新引進(jìn)的種豬，采取免疫措施，并對(duì)所在豬舍進(jìn)行嚴(yán)格消毒[3]。

本次實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的4份樣品中，高致病性豬藍(lán)耳病與豬圓環(huán)病毒2型的混合感染率為75%。近年來，隨著豬場(chǎng)集約規(guī)?；l(fā)展，養(yǎng)殖密度也越來越大，病毒病以及多種病毒病混合感染的發(fā)生率也越來越大[4]，其中最常見的就是豬藍(lán)耳病與豬圓環(huán)病的混合感染[5]。豬藍(lán)耳病是一種傳染性很高，致病力很高的傳染病。它的傳播途徑有很多種，如空氣，豬群間等，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)有很大的影響[6]。豬圓環(huán)病毒2型可侵害豬的神經(jīng)、呼吸、消化等系統(tǒng)，使機(jī)體發(fā)生綜合性衰竭，該病在仔豬中發(fā)病率高達(dá)50%，致死率為20%[7]。養(yǎng)豬場(chǎng)須解決當(dāng)前在豬常見傳染病免疫工作中的缺陷，嚴(yán)格按照國(guó)家要求采取有力措施，有效做好豬疫病的免疫、預(yù)防和控制，并盡可能防止豬病的發(fā)生。