潘立寧，劉紹鋒*，李東亮，樊美娟，沈 怡，王曉瑜，施豐成，羅 誠*，孫學(xué)輝，劉瑞紅，秦亞瓊

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

2.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心 卷煙減害降焦四川省重點實驗室，成都市錦江區(qū)成龍大道一段56號610021

近年來，隨著全球控?zé)熈Χ炔粩嗉哟?，一些發(fā)達(dá)國家傳統(tǒng)卷煙的銷量出現(xiàn)了一定的下降趨勢，而電子煙在全球銷量呈快速增長之勢［1-3］。作為電子煙的重要組成部分，電子煙液的質(zhì)量安全直接影響消費者的健康。低分子羰基物是一類對人體感覺系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)有強(qiáng)烈刺激作用的有害物質(zhì)，特別是甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛8種低分子羰基物［4］。這8種羰基物均被列于Hoffmann名單中［5］，甲醛、乙醛和巴豆醛分別被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為1類、2B類、3類人類致癌物［6］，丙烯醛被美國環(huán)境保護(hù)署（US Environmental Protection Agency，US EPA）列入“有害大氣污染物名單”［7］。為保障電子煙液的安全性，規(guī)范電子煙市場，部分國家和地區(qū)對電子煙液中的羰基物進(jìn)行了規(guī)范或限量［8-9］。準(zhǔn)確測定電子煙液中羰基物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對于確定羰基物的形成機(jī)理和評價其對人體健康的影響具有重要意義。低分子量羰基物由于極性大、反應(yīng)活性高、易揮發(fā)等特點，通常對其衍生化后再采用色譜或光譜技術(shù)進(jìn)行檢測［10］。羰基物與DNPH的衍生應(yīng)用廣泛［11-25］，由于腙類化合物在高溫下會發(fā)生分解，液相色譜（LC）比氣相色譜（GC）更適合對羰基物的腙類產(chǎn)物進(jìn)行測定［13］，DNPH衍生-LC檢測法被一些國家的標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)用作分析主流煙氣中羰基物的標(biāo)準(zhǔn)方法［14-15］。目前，電子煙氣溶膠中羰基物的研究較多，而電子煙液中羰基物分析方法的相關(guān)報道較少。Lim等［23］利用2,2,2-三氟乙基肼對羰基物進(jìn)行衍生，采用頂空固相微萃取-GC-MS聯(lián)用法測定電子煙液中的甲醛、乙醛和丙烯醛；Varlet等［24］使用盛有DNPH的吸附管捕集電子煙液中的羰基物，經(jīng)乙腈洗脫后采用LC-UV/MS法進(jìn)行測定。

在本研究中，采用DNPH衍生化羰基物、采用LC-MS/MS法進(jìn)行檢測，解決了在樣品前處理過程中因甘油和DNPH乙腈溶液不混溶導(dǎo)致的溶液分層問題以及腙類產(chǎn)物在酸性條件下的降解問題，旨在為電子煙液中多種羰基物的同時測定提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

收集市場上22種不同品牌、不同口味和不同煙堿量的電子煙液樣品。

甲醛-2,4-二硝基苯腙（＞97%）、乙醛-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丙酮-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丙烯醛-2,4-二硝基苯腙（＞95%）、丙醛-2,4-二硝基苯腙（＞97%）、巴豆醛-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、2-丁酮-2,4-二硝基苯腙（＞98%）、丁醛-2,4-二硝基苯腙（＞96%）（標(biāo)準(zhǔn)品，日本東京化成工業(yè)株式會社）；甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3、乙醛-2,4-二硝基苯腙-d（3標(biāo)準(zhǔn)品，＞98%，上海安譜公司）。

水（自制，符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水，電阻率18.2 MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Dikma公司）；吡啶（色譜純）、2,4-二硝基苯肼（DNPH，＞98%）（美國Sigma-Aldrich公司）；高氯酸［70%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），比利時Acros Organics公司］。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

采用乙腈配制8種羰基物-2,4-二硝基苯腙的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，以及甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的混合內(nèi)標(biāo)儲備液，置于-20℃冰箱中保存。采用乙腈稀釋配制甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的濃度均為20μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。采用乙腈逐級稀釋并加入內(nèi)標(biāo)工作液配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各羰基物-2,4-二硝基苯腙的濃度分別為10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為200 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理和儀器條件

稱取0.2 g電子煙液樣品于10 mL容量瓶中，依次加入1.2 mL去離子水、2 mL 1.2 mg/mL DNPH乙腈溶液以及80μL高氯酸水溶液，搖勻，室溫放置60 min進(jìn)行衍生化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后加入200μL吡啶和100μL內(nèi)標(biāo)工作溶液（甲醛-2,4-二硝基苯腙-d3和乙醛-2,4-二硝基苯腙-d3的混合溶液，濃度均為20μg/mL），并用乙腈定容至10 mL，搖勻。溶液過有機(jī)相濾膜，將濾液進(jìn)行LC-MS/MS分析。分析條件：

色譜柱：Acclaim?Explosive E2柱（3 mm×150 mm，3μm，120?）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL；流動相A：水；流動相B：乙腈；洗脫方式：40%A+60%B等度洗脫；流速：0.4 mL/min；離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；電噴霧電壓：-4 200 V；離子源溫度：500℃；氣簾氣壓力：0.138 MPa；碰撞氣壓力：0.041 MPa；輔助氣1壓力：0.276 MPa；輔助氣2壓力：0.276 MPa；監(jiān)測離子對信息見表1。

表1 各衍生物的內(nèi)標(biāo)物、母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量及保留時間Tab.1 Internal standards，precursor ions，product ions，declustering potentials，collision energies and retention time of the derivatives

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS法與HPLC法比較

文獻(xiàn)研究表明，電子煙液中低分子量羰基物質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為μg/g級；為了改善口感，電子煙液中加入不同種類的香味成分，導(dǎo)致電子煙液基質(zhì)比較復(fù)雜，不同電子煙液樣品基質(zhì)差異較大［23-24］。選擇2個市售電子煙液樣品，按照1.2.2節(jié)的方法進(jìn)行樣品前處理，然后分別采用LC-MS/MS法和LC法進(jìn)行測定，LC條件參見文獻(xiàn)［7］。

圖1為標(biāo)準(zhǔn)溶液和2個電子煙液樣品中8種羰基物-2,4-二硝基苯腙的LC-MS/MS提取離子色譜圖（圖1a）和LC譜圖（圖1b）。LC-MS/MS提取離子色譜圖顯示，樣品1中含有甲醛和乙醛，樣品2中含有甲醛、乙醛和2-丁酮。LC譜圖顯示，在樣品1中也檢測甲醛、乙醛，但因雜質(zhì)干擾，甲醛的色譜峰前沿處有凸起，難以準(zhǔn)確定量，且丙烯醛及丙醛色譜峰中間存在很大的雜質(zhì)峰；樣品2中檢出甲醛和乙醛，但未檢出2-丁酮，且在巴豆醛出峰位置出現(xiàn)了很大的色譜峰，該峰經(jīng)LC-MS/MS法證實為雜質(zhì)峰而非巴豆醛，并將2-丁酮色譜峰掩蓋。由此可見，由于電子煙液基質(zhì)比較復(fù)雜，且不同電子煙液樣品基質(zhì)差異較大，采用LC法難以準(zhǔn)確檢測樣品中的8種羰基物；LC-MS/MS法靈敏度高，且選擇性好，適于電子煙液中8種羰基物的測定。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和2個電子煙液樣品中8種羰基物-2,4-二硝基苯腙的LC-MS/MS提取離子色譜圖（a）和LC圖（b）Fig.1 Extracted ion chromatograms（a）and liquid chromatograms（b）for eight carbonyls in standard solution and two e-liquid samples

2.2 DNPH溶液溶劑的優(yōu)化

甲醇和乙腈為LC-MS/MS法的常用流動相，DNPH在甲醇和乙腈中的溶解性良好，因此分別采用甲醇和乙腈配制一定濃度的DNPH溶液，考察兩種溶劑產(chǎn)生的背景對檢測結(jié)果的影響。具體步驟：移取2 mL DNPH甲醇溶液（或DNPH乙腈溶液）和80μL高氯酸水溶液于10 mL容量瓶中，搖勻，室溫放置60 min進(jìn)行衍生化反應(yīng)。然后，加入200μL吡啶，采用甲醇（或乙腈）定容至10 mL，搖勻。將溶液過有機(jī)相濾膜，進(jìn)行LC-MS/MS分析。分析條件同1.2.2節(jié)。

3.2 主要臨床表現(xiàn) 鉤蟲性十二指腸炎綜合征是由鉤蟲寄生于小腸所引起的疾病，鉤蟲性十二指腸炎綜合征患者因感染鉤蟲的數(shù)量、時間及個人的身體狀況常呈現(xiàn)輕重不一的臨床表現(xiàn)。本征多先有胃納增加而體重減輕，上腹部不適，可有不同程度的隱痛，餐后腹脹。后期食欲不振，可有惡心、嘔吐、便秘或腹瀉，甚至黑便、柏油樣便、血便等消化道出血表現(xiàn)。貧血嚴(yán)重時胃酸分泌減低，可有異嗜癖、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥，甚至發(fā)生嗜酸性膿腫導(dǎo)致腸梗阻表現(xiàn)。鉤蟲感染輕者可無癥狀，部分可有貧血、營養(yǎng)不良、胃腸功能失調(diào)，重者可有發(fā)育障礙及心功能不全[7]。

結(jié)果表明，采用甲醇配制DNPH溶液會造成很大背景（圖2a），DNPH甲醇溶液背景中存在6種羰基物的2,4-二硝基苯腙產(chǎn)物，這6種羰基物分別為甲醛、乙醛、丙酮、丙醛、2-丁酮、丁醛。其中，甲醛-2,4-二硝基苯腙的色譜峰很高，丙酮-2,4-二硝基苯腙和2-丁酮-2,4-二硝基苯腙的色譜峰較高，乙醛-2,4-二硝基苯腙、丙醛-2,4-二硝基苯腙和丁醛-2,4-二硝基苯腙的色譜峰相對較低，這些背景峰影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用購自不同公司的甲醇試劑配制DNPH溶液，結(jié)果無顯著性差異。低分子量羰基物可能由甲醇試劑引入，盡管實驗中所用為HPLC級試劑，但仍含有微量的羰基物，其與DNPH反應(yīng)會帶來較高的背景值。在DNPH乙腈溶液背景中檢出了甲醛-2,4-二硝基苯腙和乙醛-2,4-二硝基苯腙。已知空氣中存在甲醛和乙醛，在背景中檢測出甲醛和乙醛是不可避免的。相對于DNPH甲醇溶液，DNPH乙腈溶液的本底小得多，因此選擇用乙腈配制DNPH溶液，同時所有結(jié)果均需要扣除溶劑背景。

圖2 DNPH甲醇溶液（a）和DNPH乙腈溶液（b）背景中8種羰基物腙類產(chǎn)物的提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms for eight carbonyls in treated DNPH/methanol solution（a）and DNPH/acetonitrile solution（b）

2.3 分散劑用量的選擇

電子煙液主要由丙二醇和甘油組成，其在不同電子煙液中的比例差異很大。甘油與乙腈不混溶，導(dǎo)致甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的電子煙液樣品與DNPH乙腈溶液混合時出現(xiàn)分層現(xiàn)象，影響測定結(jié)果。為了使反應(yīng)體系均一化，在電子煙液樣品中引入一定量水進(jìn)行分散后，再加入DNPH乙腈溶液。DNPH在乙腈中溶解度較大，在水中溶解度較小，當(dāng)加入大量水后，DNPH會析出。因此，為了避免分層和DNPH析出，考察了水和DNPH乙腈溶液的加入量。

采用同等質(zhì)量的甘油代替電子煙液樣品進(jìn)行避免分層實驗：當(dāng)水的加入量大于甘油質(zhì)量的6倍以上，無論加入多少DNPH乙腈溶液，反應(yīng)體系均不會出現(xiàn)分層現(xiàn)象。避免DNPH析出實驗表明，保證DNPH不析出的允許加水量與DNPH濃度有關(guān)：當(dāng)DNPH濃度為2 mg/mL時，若加水量不大于乙腈使用量，DNPH不會析出；當(dāng)DNPH濃度減小，允許加水量將增加。根據(jù)以上分析，對于0.2 g電子煙液樣品，加入1.2 mL水（加入水的質(zhì)量為樣品質(zhì)量的6倍），再加入2 mL 1.2 mg/mL的DNPH乙腈溶液（加水量小于乙腈使用量）進(jìn)行衍生化反應(yīng)時，既不會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，也不會析出DNPH。

2.4 衍生過程參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

電子煙液中的羰基物能否與DNPH完全反應(yīng)生成相應(yīng)的腙類衍生物顯著影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。以分析物與內(nèi)標(biāo)的面積比作為評價指標(biāo)，分別研究確定DNPH濃度、高氯酸濃度和反應(yīng)時間參數(shù)（圖3）。實驗所用的電子煙液樣品可檢出甲醛、乙醛、丙酮和丙醛，為了考察衍生過程參數(shù)對電子煙液中8種羰基物衍生化反應(yīng)結(jié)果的影響，在該電子煙液樣品中加入一定量丙烯醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛。

2.4.1 DNPH濃度

腙類衍生物的生成量取決于DNPH與分析物的摩爾比［25］，因此采用不同濃度的DNPH溶液處理電子煙液樣品。如圖3a所示，隨DNPH濃度增加，8種羰基物的2,4-二硝基苯腙衍生物先逐漸增加，然后保持不變。DNPH濃度由0.2 mg/mL增加至1.4 mg/mL，各腙類衍生物的響應(yīng)依次增加至原來的2.45倍（甲醛-2,4-二硝基苯腙）、1.20倍（乙醛-2,4-二硝基苯腙）、3.82倍（丙酮-2,4-二硝基苯腙）、1.46倍（丙烯醛-2,4-二硝基苯腙）、1.54倍（丙醛-2,4-二硝基苯腙）、1.30倍（巴豆醛-2,4-二硝基苯腙）、2.26倍（2-丁酮-2,4-二硝基苯腙）和1.18倍（丁醛-2,4-二硝基苯腙）。當(dāng)DNPH濃度為1.2 mg/mL時，8種羰基物的2,4-二硝基苯腙的響應(yīng)最高；繼續(xù)增加DNPH濃度，響應(yīng)不再增加。因此，選用DNPH濃度為1.2 mg/mL。

圖3 衍生過程參數(shù)對測定結(jié)果的影響Fig.3 Effects of derivation parameters on determination results

2.4.2 高氯酸濃度

羰基物與DNPH發(fā)生反應(yīng)，需要在酸性條件下進(jìn)行，反應(yīng)體系酸性強(qiáng)弱直接影響反應(yīng)效率。因此，考察了不同濃度高氯酸水溶液對衍生化反應(yīng)結(jié)果的影響（圖3b）。結(jié)果表明，當(dāng)高氯酸濃度由1.4%增加至10.5%時，除丙烯醛外，其他7種羰基物的2,4-二硝基苯腙響應(yīng)先逐漸增加，然后保持不變。當(dāng)高氯酸濃度由1.4%增加至5.6%時，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙響應(yīng)逐漸增加；高氯酸濃度為5.6%～7.0%范圍內(nèi)，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙的響應(yīng)保持不變；高氯酸濃度繼續(xù)增加，丙烯醛-2,4-二硝基苯腙響應(yīng)下降。這主要是由于丙烯醛-2,4-二硝基苯腙在酸性較高條件下容易發(fā)生聚合反應(yīng)［11-12］。當(dāng)高氯酸濃度由1.4%增加至10.5%時，8種羰基物的2,4-二硝基苯腙的響應(yīng)最大值與最小值的比例分別為甲醛-2,4-二硝基苯腙1.71、乙醛-2,4-二硝基苯腙1.49、丙酮-2,4-二硝基苯腙3.10、丙烯醛-2,4-二硝基苯腙7.05、丙醛-2,4-二硝基苯腙2.25、巴豆醛-2,4-二硝基苯腙21.67、2-丁酮-2,4-二硝基苯腙8.59和丁醛-2,4-二硝基苯腙2.16。由此可見，在羰基物與DNPH反應(yīng)體系中，高氯酸濃度大小為非常重要的一個參數(shù)，尤其對丙烯醛、巴豆醛和2-丁酮衍生化反應(yīng)影響很大。當(dāng)高氯酸濃度為7.0%時，8種羰基物的2,4-二硝基苯腙的響應(yīng)均達(dá)到最大。因此，選擇高氯酸濃度為7.0%。

2.4.3 反應(yīng)時間

反應(yīng)時間是衍生過程的重要參數(shù)，當(dāng)電子煙液中的羰基物與DNPH反應(yīng)一段時間后，加入一定量吡啶終止衍生反應(yīng)，以評價反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響。圖3c表明，當(dāng)反應(yīng)時間為30 min時，除甲醛外，其余7種羰基物與DNPH反應(yīng)完全，繼續(xù)增加反應(yīng)時間至100 min，該7種羰基物的腙類衍生物無明顯變化。甲醛與DNPH反應(yīng)較慢，當(dāng)反應(yīng)時間為60 min時，甲醛-2,4-二硝基苯腙的響應(yīng)達(dá)到最大。因此，選擇反應(yīng)時間為60 min。

2.5 加入吡啶的確定

文獻(xiàn)研究表明，丙烯醛和巴豆醛的DNPH腙類衍生物在酸性條件下易發(fā)生聚合反應(yīng)［11-12］。因此在電子煙液中的羰基物與DNPH反應(yīng)完全后，加入一定量吡啶中和溶液中過量的酸?？疾炝诉拎﹄娮訜熞褐斜┤┖桶投谷y定結(jié)果的影響，對樣品溶液每小時取樣測定1次，持續(xù)測定10 h。結(jié)果顯示，加入適量吡啶后，丙烯醛和巴豆醛的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%；而不添加吡啶時，兩種分析物的響應(yīng)逐漸降低，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于20%。

2.6 方法表征

分別對系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行LC-MS/MS分析，以羰基物腙類衍生物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比對相應(yīng)羰基物的濃度進(jìn)行線性回歸，得到各羰基物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（表2）。可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以3倍信噪比（S/N=3）計算檢測限（LOD），10倍信噪比（S/N=10）計算定量限（LOQ），8種羰基物的檢測限在5～28 ng/g之間，定量限在17～93 ng/g之間。

表2 8種羰基物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Tab.2 Linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of eight carbonyls

在電子煙液樣品中分別加入低、中、高3個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗。由表3可知，8種羰基物的平均加標(biāo)回收率在92.5%～106.4%之間。對加標(biāo)樣品進(jìn)行5次日內(nèi)和日間平行測定，8種羰基物日內(nèi)和日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在3.2%～6.2%和4.1%～7.9%之間。

表3 8種羰基物的回收率、日內(nèi)和日間精密度Tab.3 Recoveries,intra-and inter-day precisions of eight carbonyls

2.7 實際樣品分析

采用該方法測定了22種電子煙液樣品中8種羰基物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如表4所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①所測電子煙液樣品中均含有甲醛和乙醛，甲醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.19～13.84μg/g之間，乙醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.63～9.60μg/g之間。②有15種樣品中檢出丙酮，檢出率為68.2%，其中14種樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于1μg/g；僅1種樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為7.15μg/g。③丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛的檢出率分別為31.8%、45.4%、9.1%、31.8%、13.6%，且這5種羰基物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于1μg/g。

表4 22種電子煙液樣品中8種羰基物的分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of eight carbonyls in 22 e-liquid samples (μg·g-1)

3 結(jié)論

①建立的水分散-DNPH衍生結(jié)合LC-MS/MS同時測定電子煙液中8種低分子量羰基物的方法，可有效消除基質(zhì)干擾，溶劑背景小，樣品溶液均一、穩(wěn)定；②該方法線性良好、靈敏度和精密度高、抗干擾能力強(qiáng)，前處理過程簡單、快速，適合大批量電子煙液樣品中8種羰基物的準(zhǔn)確檢測。