董學(xué)易，趙秀蘭，趙楠，張丹芳，李巖磊，孫保存，2△

胃癌是全球范圍內(nèi)癌癥死亡的第3 大原因，早發(fā)現(xiàn)、早診治對于預(yù)后至關(guān)重要，但多數(shù)胃癌患者就診時已是中晚期，5年生存率不到10%。胃腺癌是胃癌中最常見的一個類型，其容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特性給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)［1］。Wnt1誘導(dǎo)信號通路蛋白1（WISP1）是細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)（CCN）蛋白家族中的一員，是一種富含半胱氨酸的分泌型細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白［2］。研究發(fā)現(xiàn)，WISP1 作為經(jīng)典 Wnt/βcatien 通路的靶蛋白，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移［3］。目前關(guān)于WISP1 在胃腺癌中的作用及其機制尚不完全清楚。本研究通過收集的臨床胃腺癌樣本，結(jié)合癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫中的胃腺癌數(shù)據(jù)集，綜合分析WISP1 在胃腺癌中表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床診療提供新思路和潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2001年1月—2008 年7 月經(jīng)手術(shù)切除的胃腺癌標(biāo)本200 例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)過放化療，由2位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師重新閱片確診為胃腺癌。200例患者中男138例，女62例，年齡28～82歲，平均（60.63±11.52）歲；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移126 例；有復(fù)發(fā)和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移103例。

1.2 實驗材料 兔抗WISP1 抗體（Abcam 公司，ab178547），兔抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體（Santa-cruse 公司，SC-7269），兔抗Twist1 抗體（Santa-cruse 公司，SC-81417），兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2 抗體（Proteintech 公司，10373-2-AP），兔二抗工作液（PV-6001）、封閉用山羊血清（ZLI-9022）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色 石蠟切片（厚度5 μm）采用PV 二步法進(jìn)行免疫組化染色。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，用3%無水甲醇過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，梯度乙醇水化，枸櫞酸抗原修復(fù)液（pH=6.0）修復(fù)10～12 min。于山羊血清室溫封閉30 min，滴加 WISP1（1∶600），VEGF（1∶100），Twist1（1∶100），MMP-2（1∶400）一抗于4 ℃孵育過夜。次日恢復(fù)室溫1 h，滴加兔二抗孵育1 h后，3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2 min，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。WISP1 陽性對照選取人胎盤組織，VEGF陽性對照選取人甲狀腺組織，Twist1陽性對照選取人肝癌組織，MMP-2 陽性對照選取人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織，用PBS 代替一抗作為陰性對照。免疫組化結(jié)果判讀采用Mattern積分法［4］，每張切片于高倍（×400）顯微鏡下隨機讀取5 個視野，計數(shù)100 個腫瘤細(xì)胞/視野。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的陽性細(xì)胞百分率和染色強度評價染色效果。陽性細(xì)胞百分率：陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)＜25%記0分，25%～50%記1分，51%～74%記2分，≥75%記3分。染色強度評分：無色記0分，淺黃色記1分，深黃色記2 分，棕黃色或褐色記3 分。兩者得分乘積為總評分，≥3分陽性，＜3分為陰性。

1.4 數(shù)據(jù)庫信息分析WISP1 表達(dá) 利用GEPIA（Gene Expression profiling interactive analysis，http://gepia. cancerpku.cn/）［5］和UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）在線工具［6］中的表達(dá)模塊分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中胃腺癌數(shù)據(jù)集（TCGASTAD）中WISP1 的表達(dá)水平。其中GEPIA 在線工具表達(dá)模塊中收錄408 例胃腺癌組織、36 例癌旁組織和175 例正常胃組織。UALCAN在線工具表達(dá)模塊中收錄415例胃腺癌組織和34例癌旁組織。從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO 數(shù)據(jù)庫中獲得GSE13861 胃腺癌數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含65 例胃腺癌組織和19 例癌旁組織。基于compare_means 函數(shù)進(jìn)行t檢驗，通過“ggpubr”R包中的ggviolin進(jìn)行結(jié)果可視化。

1.5 預(yù)后分析 針對本中心胃腺癌標(biāo)本和TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集分析WISP1 與預(yù)后的關(guān)系。對隨訪的200 例人體胃腺癌標(biāo)本進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析，比較WISP1陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組患者生存時間的差異；并用GEPIA和UALCAN在線工具的生存分析模塊驗證TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集中患者WISP1表達(dá)水平與生存率的關(guān)系。

1.6 WISP1 表達(dá)與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和血管生成相關(guān)基因的相關(guān)性分析 利用人體胃腺癌免疫組化檢測和TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集分析 WISP1 與 EMT 相關(guān)基因（Twist1、Snail、Vimentin 和 CDH1）和血管生成相關(guān)基因（VEGF、CDH5、MMP-2和MMP-9）的關(guān)系。利用“TCGAbiolinks”R包下載TCGA-STAD 基因表達(dá)矩陣，分析WISP1與EMT相關(guān)基因和血管生成相關(guān)基因的相關(guān)性。

1.7 差異基因富集分析 基于WISP1 表達(dá)的中位數(shù)，將TCGA-STAD數(shù)據(jù)集和GSE13861中的樣本分為WISP1高、低表達(dá)組。利用“l(fā)imma”R包進(jìn)行差異分析，對TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因本體（GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。從生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3 個層面進(jìn)行GO 分析。此外，利用基因集富集分析（GSEA）軟件［7］對TCGA-STAD 和GSE13861分別進(jìn)行基因集富集分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 基于SSPS 16.0軟件和R軟件（3.6.1版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料的比較用四格表χ2檢驗。計量資料的比較采用2獨立樣本比較的t檢驗?；颊呱骖A(yù)后的差異比較采用Kaplan-Meier 生存分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WISP1 在胃腺癌中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，WISP1主要定位于胃腺癌細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒狀（圖1）。200 例胃腺癌組織中WISP1 陽性表達(dá)116例（58%），陰性表達(dá)84例（42%）。

Fig.1 The WISP1 expression levels in stomach adenocarcinoma(immunohistochemistry staining,×200)圖1 WISP1蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)水平（免疫組化染色，×200）

2.2 WISP1 與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、性別、腫瘤直徑和組織分化程度患者WISP1表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TNM Ⅲ～Ⅳ期患者WISP1表達(dá)陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期者，有淋巴轉(zhuǎn)移患者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和（或）復(fù)發(fā)患者高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)者（均P＜0.05），見表1。TCGASTAD數(shù)據(jù)集和GSE13861分析結(jié)果均顯示W(wǎng)ISP1在胃腺癌中的表達(dá)水平高于對照組，見圖2A～D。胃腺癌高分期患者WISP1表達(dá)較高，見圖2E、F。

Tab.1 The difference of positive WISP1 expression in gastric adenocarcinoma patients with different clinicopathological parameters表1 不同臨床病理特征的胃腺癌患者WISP1表達(dá)陽性率的差異 ［例（%）］

2.3 生存預(yù)后分析 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，WISP1 陽性表達(dá)患者的中位生存時間短于WISP1 陰性表達(dá)患者（24 個月vs.52 個月，Log-rankχ2=5.368，P＜0.05），見 圖 3A。 同 時 GEPIA 和UALCAN 分析STAD 數(shù)據(jù)集的結(jié)果與此相一致（GEPIA：25 個月vs.49 個月，P＜0.05；UALCAN：25個月vs.48個月，P＜0.05），見圖3B、C。

Fig.3 Survival curves of stomach adenocarcinoma with high and low expression of WISP1圖3 WISP1高表達(dá)和低表達(dá)胃腺癌患者生存曲線

2.4 WISP1 與 VEGF、Twist1 和 MMP-2 蛋白表達(dá)的關(guān)系 VEGF、Twist1 和 MMP-2 蛋白表達(dá)于胃腺癌細(xì)胞漿內(nèi)，見圖 4。VEGF、Twist1 和 MMP-2 的表達(dá)和WISP1陽性表達(dá)具有一定程度的關(guān)聯(lián)（P＜0.05），見表2。

Fig.4 The expression levels of VEGF,Twist1 and MMP-2 in gastric adenocarcinoma(immunohistochemistry staining,×200)圖4 VEGF，Twist1和MMP-2蛋白在胃腺癌組織中的表達(dá)水平（免疫組化染色，×200）

Tab.2 Expression levels of VEGF,Twist1 and MMP-2 in high and low WISP1 expression groups表2 VEGF，Twist1和MMP-2在WISP1陽性組和陰性組間表達(dá)的比較 ［例（%）］

2.5 WISP1 與血管生成和EMT 相關(guān)基因的相關(guān)性 利用TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集進(jìn)行的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：WISP1 與 VEGF、CDH5、MMP-2、MMP-9、Twist1、Snail 和 Vimentin 呈正相關(guān)（r分別為 0.64、0.49、0.64、0.32、0.49、0.43、0.64，均P＜0.05），與CDH1呈負(fù)相關(guān)（r=-0.25，P＜0.05）。

2.6 WISP1 基因GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 按WISP1 表達(dá)水平中位數(shù)，將TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集分為高、低2 組，并進(jìn)行差異基因的富集分析。結(jié)果顯示，WISP1基因參與單核細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）構(gòu)造和細(xì)胞間黏附等生物過程，具有與整合素和膠原結(jié)合及細(xì)胞因子激活的分子功能（圖5A～C）。同時KEGG通路富集分析結(jié)果表明，WISP1參與ECM結(jié)合和細(xì)胞黏附的信號傳導(dǎo)通路（圖5D）。

Fig.5 Gene Ontology analysis and KEGG pathway analysis圖5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

2.7 GSEA富集分析 將GSE13861和TCGA-STAD數(shù)據(jù)集進(jìn)行WISP1 高、低表達(dá)分組后進(jìn)行GSEA 分析，結(jié)果表明在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中，當(dāng)WISP1高表達(dá)時，血管生成和EMT 的相關(guān)基因上調(diào)，高表達(dá)的WISP1與血管生成和EMT的發(fā)生有關(guān)，見圖6。

Fig.6 GSEA enrichment analysis of WISP1 and angiogenesis pathway and EMT pathway in TCGA database and GSE13861 dataset圖6 TCGA數(shù)據(jù)庫和GSE13861數(shù)據(jù)集中WISP與血管生成通路和EMT通路富集分析

3 討論

WISP1 是 Hashimoto 等［8］在研究黑色素瘤細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)的分泌型細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白?，F(xiàn)已表明WISP1在口腔鱗癌［9］、胰腺導(dǎo)管腺癌［10］、乳腺癌［11］等腫瘤中高表達(dá)，并促進(jìn)癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移，與患者的生存預(yù)后密切相關(guān)。本研究從蛋白和基因?qū)用?，通過對人胃腺癌標(biāo)本、TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集和GEO數(shù)據(jù)庫中GSE13861 數(shù)據(jù)集分析等多種方法證實，WISP1 在胃腺癌中的表達(dá)高于癌旁組織，在胃腺癌高表達(dá)者更容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，同時生存率明顯下降。

Folkman［12］認(rèn)為腫瘤的生長依賴血管為其提供營養(yǎng)，并且腫瘤的血管生成在其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過程中起了重要作用。VEGF 可以誘導(dǎo)腫瘤血管生成［13］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，其中MMP-2可降解基底膜和Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型膠原以及溶解明膠［14］。MMP-9能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、黏連蛋白等，并且MMP-2和MMP-9可以協(xié)助VEGF發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤血管生成的作用［15］。CDH5是一種表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附分子，在維持血管完整性、調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞連接和血管的形成中起著重要的作用［16］。本研究中，免疫組化染色結(jié)果表明，VEGF、MMP-2 和WISP1 的表達(dá)具有一定程度的關(guān)聯(lián)，在WISP1 高表達(dá)組中伴隨VEGF 和MMP-2 的高表達(dá)。TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集相關(guān)分析說明WISP1 表達(dá)與VEGF、CDH5、MMP-2 和 MMP-9 呈正相關(guān)。另外WISP1 的GO 功能分析和KEGG 通路差異基因富集分析證實，WISP1 參與細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)造過程。同時GSEA 富集實驗結(jié)果表明，WISP1 高表達(dá)與血管發(fā)生相關(guān)。綜合這些結(jié)果表明，WISP1 可能具有促進(jìn)胃腺癌血管生成的潛力。

EMT即上皮性來源的細(xì)胞失去原有表型而獲得間充質(zhì)表型，并經(jīng)歷細(xì)胞骨架重塑的過程。EMT 的細(xì)胞標(biāo)志事件是細(xì)胞中E-cadherin（CDH1）等黏附蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞間的橋粒連接減弱，同時伴有間充質(zhì)特性的標(biāo)志物Vimentin 等表達(dá)增加，細(xì)胞的遷移能力增加。其中Twist1 和Snail 是啟動組織發(fā)生EMT 的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究中免疫組化染色結(jié)果證實，Twist1和WISP1表達(dá)具有一定關(guān)聯(lián)，并且對TCGA-STAD 數(shù)據(jù)集的分析顯示，WISP1 表達(dá)水平與 Twist1、Snail 和 Vimentin 呈正相關(guān)，與 CDH1呈負(fù)相關(guān)；另外WISP1的GO功能分析和KEGG通路差異基因富集分析證實，WISP1 參與細(xì)胞黏附功能和單核細(xì)胞的遷移過程；同時GSEA 富集實驗結(jié)果表明，WISP1 高表達(dá)與EMT 發(fā)生相關(guān)。筆者推測WISP1 可能通過EMT 過程促進(jìn)胃腺癌的轉(zhuǎn)移。Jia等［17］研究證實，WISP1可使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。本課題組前期研究亦證實，EMT參與胃癌血管生成擬態(tài)過程，而血管生成擬態(tài)是胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)之一［16］。上述結(jié)果為WISP1促進(jìn)胃腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲提供了更有力的證據(jù)。

綜上所述，WISP1在胃腺癌組織中高表達(dá)，并且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和（或）復(fù)發(fā)的胃腺癌組織中高表達(dá)，高表達(dá)的WISP1患者生存預(yù)后差；WISP1可通過促進(jìn)胃腺癌的血管生成和啟動胃腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促使胃腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。WISP1 通過多個途徑發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致胃腺癌患者發(fā)生不良的預(yù)后。然而，關(guān)于WISP1 在胃腺癌中如何調(diào)控VEGF、Twist1、MMP-2 的表達(dá)以及相關(guān)通路的相互作用還需進(jìn)一步研究。