李悅嫻，秦樹存，張錦△

膿毒癥是宿主對感染反應失調(diào)造成的一種嚴重全身炎癥反應綜合征，最終導致多器官功能衰竭和膿毒性休克［1］，是重癥感染死亡的主要原因。胰腺損傷是膿毒癥重要的器官功能障礙之一［2］。氫分子具有選擇性清除羥基自由基和過氧亞硝酸鹽陰離子的作用，是一種新型抗氧化劑，于2007 年被首次應用于醫(yī)療領域［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氫分子可明顯改善膿毒癥誘導的肝損傷［4］、心功能障礙［5］和肺損傷［6-8］。氫分子對膿毒癥腎損傷亦有治療作用［9］，但對膿毒癥胰腺損傷是否有改善作用卻鮮見報道。本實驗通過脂多糖（LPS）尾靜脈注射建立小鼠胰腺損傷模型，觀察氫分子對膿毒癥胰腺損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 LPS 購自美國Sigma-Aldrich 公司；富氫水（HRS）購自北京活力氫源公司；異氟烷購自深圳瑞沃德公司；無水乙醇、二甲苯、中性塑膠購自國藥集團化學試劑有限公司；HE 染液套裝購自武漢Servicebio 公司；淀粉酶檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、髓過氧化物酶（MPO）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自武漢優(yōu)爾生公司；包埋機JB-P5購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機RM2016 購自上海徠卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡Eclipase E100、成像系統(tǒng)DS-U3購自日本尼康公司；低溫高速離心機3-18K購自德國SIGMA公司；酶標儀ELX 808購自美國Biotek公司。

1.2 動物模型制備及分組 SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠18只，體質(zhì)量18～20 g，購自中國醫(yī)科大學實驗動物部。所有動物管理和手術操作均經(jīng)中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理編號：2020PS701K）。小鼠飼養(yǎng)于標準化環(huán)境中，環(huán)境溫度為（24±2）℃，光照條件為12 h晝夜節(jié)律，可自由食用標準食物和飲水。

按隨機數(shù)字表法將C57BL/6J雄性小鼠分為對照組、模型組（LPS 組）和HRS 處理組（LPS+HRS 組），每組6 只。LPS 組和LPS+HRS 組小鼠給予尾靜脈單次注射LPS 5 mg/kg，建立胰腺損傷模型［8］，對照組小鼠尾靜脈給予相同劑量的生理鹽水。參考本課題組前期研究［5-6］，LPS+HRS 組小鼠在 LPS 給藥后1 h 給予10 mL/kg HRS 腹腔注射，對照組和LPS 組小鼠于相同時間點腹腔注射相同劑量的生理鹽水。

LPS 給藥后24 h，小鼠異氟烷麻醉后仰臥固定，乙醇消毒，經(jīng)腹正中線剪開皮膚，暴露腹主動脈取血0.5 mL；而后脫頸處死小鼠，取胰腺組織。血液室溫自然凝固10～20 min，3 000 r/min離心20 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。胰腺組織一半完全浸泡于10%福爾馬林溶液，另一半于-80 ℃冰箱保存。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 小鼠行為學表現(xiàn) LPS給藥后觀察各組小鼠精神狀態(tài)和活動狀況。

1.3.2 胰腺組織HE染色和改良Schmidt組織病理學評分 取經(jīng)10%福爾馬林溶液固定后的胰腺組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，經(jīng)70%、80%、90%和無水乙醇浸泡梯度脫水，純二甲苯透明后，進行石蠟包埋。包埋后切成5 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、復水后，蘇木素染色5～10 min，PBS洗滌，0.1%鹽酸乙醇分化液分化10 s，伊紅染色30 s～2 min，PBS洗去多余染液。經(jīng)脫水、透明和中性塑膠封片后，置于顯微鏡下觀察。對Schmidt胰腺組織病理學評分［10］進行改良，從水腫、炎癥、出血和壞死4個方面對進行胰腺組織病理學量化評分［11］。將出血（實質(zhì)出血面積）評分進一步改進為：0 分，無；1 分，≤25%；2分，＞25%～50%；3分，＞50%～75%；4分，＞75%～100%。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清淀粉酶、胰腺組織炎性因子、MPO和MDA水平 從-80 ℃冰箱取出小鼠血清和胰腺組織。胰腺組織用PBS沖洗后稱質(zhì)量剪碎，按10%勻漿比例加入預冷的含蛋白酶抑制劑的PBS 勻漿。吸取勻漿液到離心管，4 ℃、5 000 r/min 離心5～10 min，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書操作測定血清淀粉酶，胰腺組織TNF-α、IL-6、MPO和MDA水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間多重比較行Dunn’s 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠行為學表現(xiàn) LPS給藥后10 h LPS組小鼠出現(xiàn)1 只死亡。因此，各組小鼠24 h 檢測數(shù)據(jù)樣本量均為5只。與對照組相比，LPS組小鼠表現(xiàn)為嗜睡、寒戰(zhàn)、行動遲緩，梳毛活動減少，并出現(xiàn)嚴重腹瀉。與LPS 組相比，LPS+HRS 組小鼠嗜睡和寒戰(zhàn)程度減輕、梳毛活動增加、腹瀉減輕、排泄物減少。

2.2 各組小鼠胰腺組織形態(tài)學變化 HE染色結果顯示，與對照組相比，LPS 組小鼠胰腺出現(xiàn)組織水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死，各項改良Schmidt組織病理學評分及總分升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，LPS+HRS 組水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死程度和范圍明顯減輕，各項改良Schmidt組織病理學評分無明顯變化（P＞0.05），改良Schmidt 組織病理學評分總分降低（P＜0.05）；LPS+HRS組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1、表1。

Fig.1 HE staining of pancreatic tissues in the three groups of mice(×200)圖1 小鼠胰腺組織HE染色（×200）

Tab.1 Histopathological scores of pancreatic injury in the three groups of mice表1 各組小鼠胰腺損傷的組織病理學評分 ［n=5，分，M（P25，P75）］

2.3 各組小鼠血清淀粉酶變化 LPS組小鼠血清淀粉酶水平顯著高于對照組，LPS+HRS 組小鼠血清淀粉酶水平明顯低于LPS 組，但仍高于對照組（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum amylase level,IL-6 and TNF-α levels in pancreatic tissue between the three groups of mice表2 各組小鼠血清淀粉酶、胰腺組織IL-6和TNF-α水平比較 （n=5，）

Tab.2 Comparison of serum amylase level,IL-6 and TNF-α levels in pancreatic tissue between the three groups of mice表2 各組小鼠血清淀粉酶、胰腺組織IL-6和TNF-α水平比較 （n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與LPS組比較，P＜0.05

組別對照組LPS組LPS+HRS組F血清淀粉酶（U/L）551.80±26.10 2 627.00±186.40a 1 555.00±142.70ab 289.800＊＊IL-6（ng/L）9.15±0.59 27.81±0.93a 15.42±1.29ab 471.800＊＊TNF-α（ng/L）51.53±1.74 157.10±5.62a 96.07±4.82ab 728.500＊＊

2.4 各組小鼠胰腺組織炎性因子變化 LPS組小鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α水平均高于對照組，LPS+HRS 組小鼠胰腺組織中IL-6 和TNF-α 水平均低于LPS組，但仍高于對照組（均P＜0.05），見表2。

2.5 各組小鼠胰腺組織中MPO 和MDA 水平比較 LPS 組小鼠胰腺組織中MPO 和MDA 水平均高于對照組，LPS+HRS 組小鼠胰腺組織中MPO 和MDA 水平均低于LPS 組，但仍高于對照組（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of MPO and MDA levels in pancreatic tissues between the three groups of mice表3 各組小鼠胰腺組織MPO和MDA水平比較（n=5，）

Tab.3 Comparison of MPO and MDA levels in pancreatic tissues between the three groups of mice表3 各組小鼠胰腺組織MPO和MDA水平比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與LPS組比較，P＜0.05

組別對照組LPS組LPS+HRS組F MPO（U/g）10.62±1.11 24.84±0.62a 16.05±5.18ab 27.180＊＊MDA（μmol/g）22.28±1.64 65.20±1.74a 42.82±1.66ab 815.700＊＊

3 討論

LPS注射是一種簡便可重復的標準化膿毒癥制模方式，廣泛應用于膿毒癥各種器官損害的研究。本研究采用LPS尾靜脈注射的方式成功建立了小鼠膿毒癥的胰腺損傷模型，膿毒癥小鼠出現(xiàn)嗜睡、寒戰(zhàn)和腹瀉等膿毒癥行為學表現(xiàn)。此外，本研究結果顯示，膿毒癥小鼠的胰腺組織學表現(xiàn)為水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死，各項改良Schmidt 組織病理學評分及總分、血清淀粉酶升高，與既往研究報道的膿毒癥胰腺損傷的病理改變一致［2，11］，提示在LPS誘導的膿毒癥中存在嚴重的胰腺損傷。

氫分子是自然界中最小的分子，可穿透細胞膜和細胞器膜，作用于細胞核和線粒體等其他藥物難以到達的靶點，可選擇性清除人體內(nèi)有害的活性氧（ROS）而不干擾人體內(nèi)正常的氧化還原反應，且終產(chǎn)物為水，無毒無害，因此被眾多學者應用于各種氧化損傷和炎癥相關疾病的治療研究中，包括膿毒癥器官損傷［12］、胰腺炎［13］、缺血再灌注損傷［14］、阿爾茨海默癥［15］和動脈粥樣硬化［16］等。HRS 是采用高壓物理溶解的方式制成的富含氫分子的水溶液。本研究結果顯示，HRS處理后小鼠的嗜睡、寒戰(zhàn)和腹瀉等行為學表現(xiàn)有所減輕，胰腺組織水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死程度降低、總改良Schmidt 組織病理學評分和血清淀粉酶水平降低，提示HRS可明顯改善內(nèi)毒素誘導的小鼠胰腺損傷。與LPS 組相比，LPS+HRS 組小鼠胰腺組織水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死的各項改良Schmidt 組織病理學評分無明顯變化，推測可能是樣本量較小的原因；但改良Schmidt 組織病理學評分總分降低，改良Schmidt 組織病理學評分總分更能評價胰腺組織的整體損傷程度。

炎癥是膿毒癥的重要病理之一。LPS通過與脂多糖結合蛋白（LBP）結合形成LPS-LBP 復合物，活化Toll 樣受體4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）通路［17］，促進炎性因子釋放，造成級聯(lián)放大的炎癥反應，形成膿毒癥炎癥反應機制［18］。TLR4 亦存在于胰腺組織中［17，19］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制 TLR4/NF-κB 通路介導的IL-6 和TNF-α 表達的升高從而降低炎癥反應可以改善LPS誘導的膿毒癥胰腺損傷［20］。本研究結果顯示，LPS 組小鼠胰腺組織中 IL-6 和 TNF-α 較對照組升高，HRS 顯著抑制了LPS 誘導的膿毒癥小鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α表達的升高，提示HRS逆轉了介導膿毒癥胰腺損傷中的核心炎癥機制。MPO 常被用來評價中性粒細胞浸潤。既往實驗研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥肺損傷［6］和胰腺炎［21］中 MPO 升高。在急性胰腺炎中，胰腺組織中的中性粒細胞可形成中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs），活化信號通路，參與炎癥反應［13］。本研究結果顯示，在膿毒癥胰腺損傷中同樣存在MPO升高，HRS處理后MPO的升高被明顯抑制，提示HRS可顯著改善膿毒癥胰腺組織中的中性粒細胞浸潤，從而抑制炎癥。此外，在胰腺炎中存在內(nèi)源性ROS 生成增多導致的過氧化水平升高［22］。本研究用MDA 評價膿毒癥小鼠胰腺組織的氧化應激水平，結果顯示，LPS 組胰腺組織中MDA 水平較對照組升高，HRS 處理顯著降低了MDA 水平，提示HRS 可明顯改善膿毒癥胰腺組織的氧化應激損傷。同時，本研究結果顯示，HRS 處理后血清淀粉酶、胰腺組織IL-6、TNF-α、MPO 和MDA 水平仍高于對照組，提示單次10 mL/kg 劑量腹腔注射的HRS 并不能獨立用于治療膿毒癥胰腺損傷。

綜上所述，HRS 可通過抑制炎癥反應和降低氧化應激顯著改善內(nèi)毒素誘導的小鼠膿毒癥胰腺損傷。HRS 具有溫和抗氧化，可穿透細胞膜和細胞器膜，以及抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗休克，調(diào)節(jié)多種分子通路和自噬等多種作用機制，且成本低廉等優(yōu)點，故具有較好的研究和應用前景。本研究尚存在不足之處，如未對HRS 改善LPS 誘導的膿毒癥胰腺損傷的上下游信號通路進行探索，未設置膿毒癥胰腺損傷多時間點和HRS多劑量觀察，這將是本課題組下一步的研究方向。