許家偉

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847

全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬人，居各種死因首位。心腦血管疾病給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，氣虛血瘀證作為老年心血管疾病的多發(fā)證型，尤其不能被忽視［1］?！八幨惩础笔枪湃嗽谑澄锖退幬锏陌l(fā)現(xiàn)中總結(jié)的智慧［2］。補(bǔ)氣活血方作為藥食同源類藥方，是由諸多具有補(bǔ)氣、補(bǔ)血、活血化瘀等功效的藥物相互配伍組成的，用以補(bǔ)中益氣、活血生津、通經(jīng)活絡(luò)，其藥效功能對氣虛血瘀證有著良好的作用［3-4］。本研究旨在研究自擬補(bǔ)氣活血方在不同劑量下對氣虛血瘀證大鼠的血液學(xué)評價。

1.2 材料、試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司；RMPI-1640購自Gbico公司；LipofectamineTM 2000 購自Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；抗LDH抗體購自Abcam公司；抗GAPDH抗體購自CST公司；GV219-PTEN(PTEN-OE)及對照質(zhì)粒(NC)由吉凱生物技術(shù)公司構(gòu)建；LDH、LD試劑盒購自南京建成生物工程研究所；人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1-A及實驗儀器由上海交通大學(xué)第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室提供。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠180只，雌雄各半，體重180～220 g，由本溪長生生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK（遼）2015-0001。于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物房飼養(yǎng)，動物使用許可證號SYXK（遼）2013-0009。

2014年5月，為認(rèn)真貫徹落實黨的十八大和十八屆三中全會精神，加強(qiáng)基層服務(wù)型黨組織建設(shè)，中共中央辦公廳印發(fā)了《關(guān)于加強(qiáng)基層服務(wù)型黨組織建設(shè)的意見》，這是對基層黨組織功能定位的深化，是基層黨組織建設(shè)工作思路創(chuàng)新和方式方法轉(zhuǎn)型的必由之路，具有十分重要的意義〔1〕。

1.2 藥材制備

補(bǔ)氣活血方（人參10 g，甘草10 g，淮小麥20 g，大棗10 g，姜黃10 g，當(dāng)歸10 g，山藥15 g，炒山楂15g），補(bǔ)陽還五湯（黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，紅花3 g，川芎3 g，地龍3 g）。分別將補(bǔ)氣活血方與補(bǔ)陽還五湯中各味藥混合后在水中浸泡1h，后加至10倍量水煎煮1 h，濾去煎煮液備用。再添入8倍量水，煎煮1 h后收集煎煮液，與第一次煎煮液合并濃縮［5］，制備出高劑量補(bǔ)氣活血方1.25 g／ml與陽性對照藥補(bǔ)陽還五湯1.45 g／ml，高劑量稀釋后可得到0.625 g／ml、0.3125 g／ml中低劑量藥物。

1.3 試劑

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（±s）表示，各組間的比較采用單因素方差分析ANOVA的LSD-t檢驗分析，P≤0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 儀器

1.5.3 血液流變學(xué)測定

1.5 方法

1.5.1 氣虛血瘀模型的制備及給藥

將雌雄各半的大鼠隨機(jī)分為6組，空白組、模型組、陽性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。每組30只，除空白組外，均采用饑餓、勞累、寒冷相結(jié)合的方式復(fù)制氣虛血瘀模型。造模前，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。造模時，除空白組正常飲食飲水外，其余各組每天限制以40 g／kg給予飼料［6］，并將大鼠放入水溫14～16℃，水深（35±5）cm，直徑為50 cm的水桶中進(jìn)行游泳，以每組大鼠自然沉降沒入水中不能自主上浮為其疲憊標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)全組有50%出現(xiàn)自然沉降時，全組停止游泳撈出，使之暴露于空氣中自然晾干［7］，不予擦拭。給藥組每天按照10 ml／kg標(biāo)準(zhǔn)灌胃，空白組給予等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃60天，取血前一天禁食24 h，不禁水。

在車牌定位時，當(dāng)遇到整張圖片較為昏暗或者轉(zhuǎn)化為灰度圖像后區(qū)分度不高等情況時，使用OTSU算法，就會出現(xiàn)二值化后車牌區(qū)域值為0，即為黑色，導(dǎo)致車牌定位失敗。此外，由于車牌定位主要基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)運算，運用腐蝕膨脹操作，如果圖片中也有二值化后白色像素點比較密集的地方，可能會被誤判為車牌區(qū)域。

全血黏度：60天模型組相對于空白組提升明顯，陽性對照組與中高劑量組相對模型組下降明顯，低劑量組相對模型組有下降趨勢。血漿黏度：60天模型組相對空白組有明顯提升，高、中、低劑量組相對模型組明顯下降。見表1。

腹主動脈采血于肝素鈉和檸檬酸鈉采血管內(nèi)。取60天大鼠心臟用10%氯化鉀溶液沖洗，使其充分舒張。切取心肌組織，用4%多聚甲醛溶液固定［8］。

半自動血液流變儀LBY-N6K，（北京普利生儀器有限公司）；Sysmex CA510型全自動血凝分析儀（日本Sysmex株式會社）；酶標(biāo)儀（美國伯樂Bio-Rad公司）。

將1.5.2中肝素鈉采血管輕輕上下震蕩，使血液產(chǎn)生抗凝作用，用血液流變儀測定全血黏度和血漿黏度。

1.5.4 凝血四項測定

HE染色結(jié)果顯示，空白組心肌組織為正常心肌組織，心肌細(xì)胞橫紋清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)內(nèi)未見血管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞的浸潤。而在模型組中，可見心肌結(jié)構(gòu)破壞、紊亂、纖維增生。低劑量組心肌細(xì)胞損傷程度較模型組明顯減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)大體規(guī)整，可見少量的纖維化改變，但無明顯大片纖維化病灶形成。中高劑量組心肌細(xì)胞纖維化程度進(jìn)一步減輕，未見明顯纖維化改變。見圖1。

1.5.5 PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶、F1＋2片段含量測定

將1.5.4中血漿按照ELISA試劑盒步驟操作，并用酶標(biāo)儀測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測物質(zhì)濃度。

園林花卉的栽培與管理對于園林景觀的構(gòu)成與造景具有重要影響。因此，需要利用科學(xué)的栽培技術(shù)并加強(qiáng)對栽植花卉的日常管理，從而確?；ɑ苌L良好。因此，需要通過合理種植、科學(xué)的水肥管理及病蟲害防治，以保證花卉的安全性及經(jīng)濟(jì)效益。

1.5.6 統(tǒng)計學(xué)方法

PT測定試劑盒（批號：1905048）、FIB測定試劑盒（批號：1905010）、TT測定試劑盒（批號：1905079）、APTT測定試劑盒（批號：1905026）、氯化鈣、希森美康清洗液購于上海長島生物技術(shù)有限公司。凝血片段F1＋2測定試劑盒、谷氨酸羧化酶測定試劑盒、PIVKA-Ⅱ測定試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科 技 有 限 公 司（批 號：ml204917、ml059265、ml601445）。

2 結(jié) 果

2.1 心臟病理形態(tài)變化

將1.5.2中檸檬酸鈉采血管輕輕上下震蕩，使血液產(chǎn)生抗凝作用，冷凍離心15 min使血漿分離出，使用全自動血凝分析儀分析，剩余血漿吸入EP管內(nèi)，－80℃保存。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化（HE染色，×400）

2.2 血液流變學(xué)變化

1.5.2 標(biāo)本采集

表1 60天大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)（±s，n＝10）

表1 60天大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 全血黏度／（mpa／s）3-1 60-1 200-1 血漿黏度150-1／（mpa／s ）空白組18.80±2.76 5.86±0.81 4.35±0.77 1.46±0.08模型組 14.32±1.04＃＃ 4.71±0.93＃＃ 3.23±0.47＃＃ 1.13±0.14＃＃陽性對照組 16.19±1.20** 5.61±0.72* 3.84±0.37** 1.23±0.05*低劑量組 15.13±1.27 5.03±0.51 3.67±0.41* 1.21±0.06*中劑量組 16.04±1.71* 5.53±0.67* 3.73±0.27** 1.28±0.02**高劑量組 16.36±1.67** 5.66±0.43** 3.96±0.25** 1.31±0.11**

2.3 大鼠凝血四項指標(biāo)觀察

氣虛血瘀證動物模型是中醫(yī)理論中一種常見的證候模型。“氣為血之帥”，氣能行血，氣虛不能充分推動血液運行以致血行不暢而瘀滯，或氣不行津，導(dǎo)致痰飲水濕停聚，而間接產(chǎn)生血流受阻致瘀，則發(fā)展為氣血同病、氣虛血瘀（因虛致瘀）?！把獮闅庵浮?，血能生氣，血瘀則臟腑失養(yǎng)、生氣乏源，亦能致使氣虛，表現(xiàn)為氣血同病、氣虛血瘀（因瘀致虛）［9］。所以造模時從上述兩個方向入手，“饑則損氣”“勞則耗氣”可通過勞累加饑餓的方式以達(dá)到因虛致瘀［10］，再通過寒涼的方式來達(dá)到因瘀致虛，多因素共同影響來營造氣虛血瘀模型。

表2 60天大鼠凝血四項指標(biāo)變化情況

2.4 大鼠血漿中PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶、F1＋2片段含量測定

大鼠血漿中PIVKA-Ⅱ：模型組含量相對空白組明顯升高，藥物組含量在60天相對于模型組明顯降低；谷氨酸羧化酶：模型組含量相對于空白組明顯下降，藥物組含量相對模型組明顯提升；F1＋2片段：模型組相較于空白組含量在20天明顯上升，在40天和60天含量明顯下降；藥物組在40天和60天相較于模型組均明顯上調(diào)。見表3～5。

表3 大鼠血漿中PIVKA-Ⅱ含量

表4 大鼠中血漿谷氨酸羧化酶含量

表5 大鼠血漿中中F1＋2片段含量

3 討 論

60天模型組相較于空白組PT與APTT上升明顯，F(xiàn)IB在40天后明顯下降，TT有上升趨勢。藥物組在60天均對PT和APTT有明顯下調(diào)作用，中高劑量組FIB上調(diào)明顯，TT相較模型組有回落趨勢，見表2。

將冷凍的胰臟置于4℃冰箱中解凍，待樣品將要完全解凍時從頭、體、尾三個部位剪取約0.5 g左右的胰腺，并用分析天平準(zhǔn)確稱重。按質(zhì)量體積比1∶9的比例加入勻漿介質(zhì)在玻璃勻漿器中勻漿(整個操作過程都在冰浴條件下進(jìn)行)。充分勻漿后將勻漿液倒入離心管中3 000 r/min 4℃條件下離心10 min，收集上清并迅速將上清液分裝成若干份貯存于-20℃中，以備進(jìn)行酶活性分析。

血液流變學(xué)是判斷血液黏稠度的重要指標(biāo)。本實驗全血及血漿黏度明顯下降，APTT和PT明顯上升，F(xiàn)IB明顯降低等數(shù)據(jù)表明，氣虛血瘀模型大鼠處于低凝低黏的狀態(tài)，為陳可冀［11］血瘀證分類中的血瘀證Ⅱ型，與李雅君［12］龐樹齡等結(jié)果一致。部分疾病屬于這一類型，主要表現(xiàn)為血液黏度低、血漿蛋白等有形成分不足，或者某一凝血功能不足等，常見貧血癥、部分月經(jīng)病、肝硬化等。

凝血四項是臨床上血栓性疾病的常用檢查指標(biāo)之一，是反映機(jī)體凝血功能正常與否，從而判斷是否有血液疾病及肝病的嚴(yán)重程度的重要手段［13］。在凝血四項結(jié)果中模型組PT在20天前有明顯下降，在40天、60天時明顯上升，F(xiàn)IB一直呈上升趨勢，這種PT與APTT異常轉(zhuǎn)換可能是其他因素影響下的結(jié)果。肝臟作為機(jī)體的主要產(chǎn)熱單位，在機(jī)體遇到寒冷時會主動進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)，不斷產(chǎn)生熱量，長久以來會造成損傷，進(jìn)入失代償期。并且饑餓情況下肝部代謝功能降低，缺乏對維生素K的吸收與補(bǔ)充，導(dǎo)致凝血功能異常，通過APTT升高和PT升高推斷是維生素K缺乏導(dǎo)致，并且APTT和PT在20天時的表現(xiàn)與40天和60天相反，F(xiàn)IB表現(xiàn)降低預(yù)測模型大鼠有DIC前期高凝期和中期消耗性低凝期的表現(xiàn)［14］。

為了驗證上述推測，接著測定血漿中PIVKA-Ⅱ、谷氨酸羧化酶［15］、F1＋2片段含量［16］。模型組相較于空白組PIVKA-Ⅱ明顯升高、谷氨酸羧化酶明顯降低，表明機(jī)體內(nèi)肝功能下降導(dǎo)致維生素K含量不足，營養(yǎng)不良。F1＋2片段在20天有提升，在40天和60天有明顯下降，結(jié)合凝血四項APTT先由20天的升高變?yōu)?0天、60天的顯著降低來推測體內(nèi)先有微血栓的生成，后面隨著肝臟功能負(fù)荷逐漸加重，出現(xiàn)DIC的中期的溶解表現(xiàn)，表明血栓的生成與溶解過程，而補(bǔ)氣活血方及陽性藥物組都可以顯著改善這幾個指標(biāo)狀況。

在傳統(tǒng)教學(xué)中英語教師在施教過程中往往采用填鴨式的教學(xué)，教師關(guān)注學(xué)生的筆試多一點而輕視學(xué)生的聽說能力培養(yǎng)。在新課程理念的指引下，小學(xué)英語教師應(yīng)試著從傳統(tǒng)的教學(xué)形式中解脫出來，改進(jìn)教學(xué)方式和方法，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。但這些愿望的實現(xiàn)需要相關(guān)的政策支持與指導(dǎo)。

水資源規(guī)劃與規(guī)劃水資源論證的最大不同應(yīng)體現(xiàn)在“論證”二字，水資源規(guī)劃是創(chuàng)造性地提出區(qū)域水資源的相應(yīng)規(guī)劃措施，而規(guī)劃水資源論證重點是對規(guī)劃已有內(nèi)容的一個分析，雖然都涉及水資源配置、水資源管理等內(nèi)容，但報告編制的概念、工作內(nèi)容的深度應(yīng)有所區(qū)別，規(guī)劃水資源論證在提出相關(guān)規(guī)劃調(diào)整、修改的結(jié)論上不應(yīng)達(dá)到水資源規(guī)劃的深度。

綜上所述，本研究成功復(fù)制氣虛血瘀大鼠模型，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)具有維生素K缺乏（營養(yǎng)不良）、心肌輕微纖維化、DIC前中期表現(xiàn)，并推斷可誘發(fā)心功能及肝功能受損等癥狀。而補(bǔ)氣活血方可以顯著改善上述狀態(tài)，并且對肝臟起到了明顯的保護(hù)作用。驗證了補(bǔ)氣活血方對治療低凝狀態(tài)下氣虛血瘀證有著很好的療效。