平麗瑩，江婉玲，馬 勛，王 靜

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000）

馬腺疫（strangles）是由馬鏈球菌馬亞種（Streptococcus equisubsp.equi，SEE）引起的一種以發(fā)熱、精神沉郁、頜下及咽喉淋巴結(jié)膿腫等的臨床癥狀[1]，且具有種屬特異性的急性上呼吸道傳染病，是最常見(jiàn)的馬屬動(dòng)物的傳染病之一[2-3]。馬鏈球菌馬亞種為鏈球菌屬C群成員，革蘭氏陽(yáng)性，β溶血性鏈球菌，毒力基因包括透明質(zhì)酸、肽聚糖、鏈球菌溶血素S等[4-6]，其中SeM蛋白是馬鏈球菌馬亞種重要的毒力因子，是細(xì)菌逃避吞噬作用和宿主免疫的重要保護(hù)性抗原，特異性高且高度保守，常被用來(lái)鑒定馬鏈球菌馬亞種[7-10]。

科學(xué)養(yǎng)殖、安全防控知識(shí)的缺乏導(dǎo)致驢感染馬鏈球菌馬亞種的病例時(shí)有發(fā)生[11]。現(xiàn)代規(guī)?；H場(chǎng)對(duì)于疫病的防控除了對(duì)病原體檢測(cè)和發(fā)病動(dòng)物隔離治療等措施外，場(chǎng)區(qū)內(nèi)外的環(huán)境消毒及進(jìn)出人員和動(dòng)物的消毒是防控疫病發(fā)生最主要的措施之一[12]。消毒劑按殺菌效果分為高效消毒劑、中效消毒劑和低效消毒劑[13]。高效消毒劑包括鹵素類(lèi)消毒劑、氧化劑類(lèi)消毒劑、醛類(lèi)消毒劑；中效消毒劑包括含碘消毒劑、醇類(lèi)消毒劑、酚類(lèi)消毒劑；低效消毒劑包括季銨鹽類(lèi)消毒劑[14]。高效消毒劑可殺滅各類(lèi)微生物，包含其芽孢；中效消毒劑可殺滅細(xì)菌繁殖體以及多數(shù)病毒和真菌；低效消毒劑可殺滅親脂性病毒以及細(xì)菌繁殖體[15]。消毒劑的種類(lèi)不同，殺菌機(jī)制也復(fù)雜多樣。如何科學(xué)選擇、使用消毒劑對(duì)于疫病防控極為重要。

2019年4月新疆石河子地區(qū)驢場(chǎng)發(fā)生一起疑似馬腺疫疫情，為明確病原，了解驢源馬鏈球菌馬亞種的環(huán)境適應(yīng)性及對(duì)消毒劑的敏感性。本研究對(duì)石河子地區(qū)發(fā)病驢場(chǎng)病原菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)分離株在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特性及常用消毒劑的敏感性進(jìn)行測(cè)定，以期對(duì)規(guī)模化驢場(chǎng)防控馬腺疫提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

新疆石河子某驢場(chǎng)臨床感染的驢及死亡驢頜下膿汁6份、肺部膿汁6份。

1.2 試驗(yàn)試劑

BHI培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技海博生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、牛血清白蛋白、卵磷脂購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；PBS、新潔爾滅、來(lái)蘇水、碘附、84消毒液、吐溫80、硫代硫酸鈉購(gòu)自北京市慶盛達(dá)化工技術(shù)有限公司；瓊脂粉購(gòu)自上海索萊寶科技有限公司；革蘭氏染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；革蘭氏陽(yáng)性菌GP鑒定卡購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自北京慶盛達(dá)化工技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HVA-85 Hirayama高壓滅菌器購(gòu)自山東博科生物產(chǎn)品有限公司；48230V LabeyderPCR儀購(gòu)自廣州市粵行儀器有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；IS-RDV1立式單門(mén)雙層全溫振蕩器購(gòu)自廣州市深華生物技術(shù)有限公司；VITEK2-compact30全自動(dòng)微生物鑒定儀購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 病原菌分離純化及生化鑒定

取臨床感染的驢和死亡驢肺部及頜下膿汁直接接種于含5%脫纖維羊血BHI培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取產(chǎn)生典型β溶血的菌落進(jìn)行純化。

1.4.1.1 革蘭氏染色

挑取鮮血培養(yǎng)基β溶血菌落，使用生理鹽水制成細(xì)菌懸液，進(jìn)行革蘭氏染色。在油鏡下鏡檢，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色特性。

1.4.1.2 生化鑒定

挑取純培養(yǎng)物，采用GP鑒定卡及VITEK2-compac全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。

1.4.2seM測(cè)序鑒定

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離株DNA，引物參考《馬腺疫檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 2977—2011）擴(kuò)增馬鏈球菌馬亞種seM基因。F5′-CAGAAAACTAAGTGCCGGTG-3′，R5′-ATTCGGTAAGAGCTTGACGC-3′，由北京華大基因科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系（總體積為20μL）：Premix Taq10μL、DNA模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、超純水6μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，61.7℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段大小的確定，并進(jìn)行回收測(cè)序。

1.4.3 不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取純化后的細(xì)菌液體培養(yǎng)，菌液濃度達(dá)到1×108~5×108CFU/mL。取200μL的菌液和20 mL添加5%牛血清的THB液體培養(yǎng)基于錐形瓶中，在不同培養(yǎng)溫度（25、37、42℃）、培養(yǎng)基pH值（4~9）、鹽濃度（1%~5%）條件下測(cè)定0、2、4、6、8、10、12、14 h菌液OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.4 常用消毒劑中和劑的篩選

將0.5%碘伏的中和劑設(shè)為0.5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+1%吐溫80和0.5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+3%吐溫80；0.2%新潔爾滅中和劑設(shè)為1%卵磷脂+1%吐溫80和1%卵磷脂+2%吐溫80；1 000 mg/L的84消毒液中和劑設(shè)為5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+1%吐溫80和1%硫代硫酸鈉+2%卵磷脂+3%吐溫80；5%來(lái)蘇水中和劑設(shè)為3%吐溫80[16]。參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[17]，設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組，分別為：消毒劑+菌懸液、消毒劑+菌懸液、中和劑+菌懸液、消毒劑+中和劑+菌液、稀釋液+菌懸液（陽(yáng)性對(duì)照）、稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基（陰性對(duì)照）。試驗(yàn)結(jié)果需符合第1組無(wú)菌生長(zhǎng)，或僅有極少數(shù)分離株菌落生長(zhǎng)；第2組有菌落生長(zhǎng)，且較第1組為多，但較第3，4，5組少；第3~5組有相似量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過(guò)15%；第6組無(wú)菌生長(zhǎng)[18]。

1.4.5 常用消毒劑對(duì)驢源馬鏈球菌馬亞種殺菌率的檢測(cè)

取0.5 mL菌懸液、0.5 mL 3%牛血清白蛋白加入試管，混勻，置20℃水浴5 min后，加入不同濃度消毒液4.0 mL注入其中，迅速混勻并立即計(jì)時(shí)。至各預(yù)定時(shí)間后分別吸取0.5 mL混合液加于4.5 mL中和劑，混勻。作用10 min后，吸取1.0 mL混合液，按平板計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管混合液接種2個(gè)培養(yǎng)基。陽(yáng)性對(duì)照組用稀釋液代替消毒劑溶液，所得結(jié)果代表菌液原有濃度。消毒劑試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。消毒劑殺菌率的計(jì)算公式如下：

表1 消毒劑試驗(yàn)分組Tab.1 Disinfectant test group

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離純化及生化特性（見(jiàn)圖1、表2）

從發(fā)病驢和死亡驢的下頜膿汁和死亡驢肺部膿汁共分離到4株菌，XJ201901為死亡驢下頜膿汁分離，XJ201902為死亡驢肺部分離，XJ201903和XJ201904為發(fā)病驢下頜膿汁分離。

由圖1可知，4株菌均為革蘭氏陽(yáng)性，長(zhǎng)鏈狀球菌，β溶血。

圖1 分離菌鏡檢及血平板培養(yǎng)情況Fig.1 Microscopic examination of isolates and blood plate culture

由表2可知，4株分離菌生化鑒定結(jié)果均為馬鏈球菌馬亞種，置信度94%。

表2 分離株生化鑒定結(jié)果Tab.2 Isolate biochemical identification results

2.2 PCR鑒定結(jié)果（見(jiàn)圖2）

圖2 seM基因PCR鑒定Fig.2 PCR amplification of SeM gene for isolates

4株分離菌提取基因組DNA后，用seM基因特異性引物擴(kuò)增seM基因片段。由圖2可知，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳后可觀察到1條長(zhǎng)約542 bp的片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序?qū)Ρ确治?，結(jié)果顯示其序列與NCBI中登錄的驢源馬鏈球菌馬亞種seM基因序列（MH973488.1）同源性均超過(guò)99%，說(shuō)明4株分離菌株均為馬鏈球菌馬亞種。

2.3 分離菌株不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特性（見(jiàn)圖3~圖5）

由圖3可知，4株分離菌在不同溫度下生長(zhǎng)情況明顯不同，37℃條件下細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期并在8 h達(dá)到高峰，菌量可達(dá)108CFU/mL，8~14 h基本處于平臺(tái)期。25℃條件下細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)10 h后才有明顯生長(zhǎng)。42℃條件下，分離株比37℃早一步進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在6 h達(dá)到高峰，但總菌量低于37℃，平臺(tái)期維持時(shí)間較短，8 h之后快速進(jìn)入衰亡期。

圖3 不同溫度條件下4株分離菌生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of four isolates at different temperatures

由圖4可知，4株分離菌在4%及5%鹽濃度時(shí)不生長(zhǎng)。1%和2%鹽濃度4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，8~12 h處于平臺(tái)期，12 h后細(xì)菌開(kāi)始衰亡，生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，但是2%鹽濃度下細(xì)菌總量低于1%鹽濃度3%鹽濃度條件下細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢12~14 h才達(dá)到其最大值。

圖4 不同鹽濃度條件下4株分離菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of four isolates at different salt concentrations

由圖5可知，4株分離菌在pH值為4、5、9時(shí)不生長(zhǎng)；pH值為7、8時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)情況基本一致；但pH值為8條件下，細(xì)菌在衰亡期的下降要快于pH值為7的條件；pH值為6時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，菌量始終顯著低于pH值7、8。

圖5 不同pH值條件下4株分離菌生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of four isolates at different pH values

2.4 常用消毒劑中和劑的篩選（見(jiàn)表3）

由表3可知，含1%卵磷脂和2%吐溫80的PBS溶液可有效中和0.2%新潔爾滅，含1%卵磷脂、3%吐溫80及0.5%硫代硫酸鈉的PBS溶液可有效中和0.5%碘伏，3%吐溫80的PBS溶液可有效中和5%來(lái)蘇水，含3%卵磷脂、2%吐溫80及1%硫代硫酸鈉的PBS溶液可有效中和1 000 mg/L的84消毒液。

表3 中和劑篩選試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of neutralizer identification test

2.5 消毒劑對(duì)驢源馬鏈球菌馬亞種殺菌率的影響（見(jiàn)表4、表5）

分離鑒定表明，4株分離菌均為馬鏈球菌馬亞種且生長(zhǎng)情況一致，試驗(yàn)選取菌株XJ201901對(duì)殺菌率的測(cè)定。由表4、表5可知，0.5%碘伏、1∶15新潔爾滅、1 000 mg/L 84消毒液以及5%來(lái)蘇水溶液對(duì)驢源SEE的殺菌作用均達(dá)到100%。0.2%碘伏和500 mg/L消毒液的殺菌效果也可達(dá)到100%。0.05%碘伏、1%來(lái)蘇水、200 mg/L 84消毒液對(duì)驢源SEE的殺滅作用達(dá)到90%以上。而在稀釋更高倍數(shù)時(shí)1∶200新潔爾滅以及0.5%來(lái)蘇水溶液的殺菌率下降到64%~76%，且消毒時(shí)間并不能增強(qiáng)消毒效果。

表4 消毒劑殺菌率Table 4 Germicidal efficacy of disinfectants 單位：%

表5 消毒劑殺菌率Table 5 Germicidal efficacy of disinfectants 單位：%

3 討論

馬鏈球菌馬亞種對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，在水中可存活1 w，在干燥條件下可生存數(shù)周；對(duì)于熱的抵抗能力不高，煮沸即死[19-20]；在陽(yáng)光直射下的木材、橡膠和金屬表面存活不到24 h；潮濕寒冷的環(huán)境可以提高SEE的生存能力[21]。本研究中，石河子發(fā)病驢場(chǎng)的驢在半露天圍欄中飼養(yǎng)，圍欄內(nèi)躺臥位置沒(méi)有墊草，發(fā)病前石河子氣溫較低，小雨，雨后露天圍欄出現(xiàn)積水，有些驢躺臥在泥水中，種種因素導(dǎo)致驢機(jī)體抵抗力降低，陸續(xù)開(kāi)始發(fā)病。本研究從臨床發(fā)病及死亡驢頜下及肺部濃汁分離得到4株馬鏈球菌馬亞種，且此前驢場(chǎng)無(wú)其他發(fā)病史和感染情況，同時(shí)在發(fā)病驢體內(nèi)未分離到其他致病菌，表明此次驢場(chǎng)發(fā)病由馬鏈球菌馬亞種導(dǎo)致。通過(guò)對(duì)4株驢源馬鏈球菌馬亞種在不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)特性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)分離菌在高溫和偏堿環(huán)境中生長(zhǎng)速度和細(xì)菌衰亡加快，室溫、3%NaCl、pH值6的條件下細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，表明驢源馬鏈球菌馬亞種對(duì)高溫及酸性環(huán)境敏感。石河子地處北疆中段，冬季嚴(yán)寒，夏季炎熱。因此，提示在石河子重點(diǎn)做好冬季和冬春的消毒保健能起到事半功倍的防控效果。

本試驗(yàn)研究的4種常用消毒劑，84消毒液屬于鹵素類(lèi)消毒劑，高效消毒劑。來(lái)蘇水屬于酚類(lèi)消毒劑，碘伏屬于含碘消毒劑，均為中效消毒劑。新潔爾滅屬于季銨鹽類(lèi)消毒劑，低效消毒劑[22]。84消毒劑在一般物體表面消毒時(shí)推薦使用濃度為1 000 mg/L。有效碘含量5 g/L的碘伏在注射、外科洗手及手術(shù)部位擦拭消毒時(shí)均使用其5%原液[23]。中效消毒劑來(lái)蘇水推薦使用濃度在5%~1%之間；低效消毒劑新潔爾滅推薦皮膚及創(chuàng)面等消毒稀釋比1∶15，器械沖洗消毒稀釋比為1∶500[24]。試驗(yàn)結(jié)果表明，4種常用消毒劑在推薦使用濃度下均可以有效殺滅驢源馬鏈球菌馬亞種。84消毒劑和來(lái)蘇水低于推薦使用濃度的5倍、碘伏低于使用濃度的10倍、新潔爾滅低于推薦使用濃度的7倍時(shí)，其殺菌效果將達(dá)不到預(yù)期效果。

4 結(jié)論

綜上所述，石河子地區(qū)驢場(chǎng)此次發(fā)病由馬鏈球菌馬亞種導(dǎo)致，對(duì)于馬腺疫的防控需嚴(yán)格按照消毒劑推薦使用劑量進(jìn)行定期消毒，同時(shí)結(jié)合石河子氣候條件，利用夏季高溫晾曬，鹵素類(lèi)消毒劑對(duì)驢舍進(jìn)行全面消毒，提高馬腺疫的防控效果。