王佳雯，盧 潔，姚 托，葉靈通，王江勇

（1. 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384； 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300； 3. 惠州學(xué)院，廣東 惠州 516007）

環(huán)境脅迫會影響貝類代謝及能量收支平衡，使免疫相關(guān)酶活性下降，降低機體免疫防御能力，影響貝類的生長和存活[1-2]。氨氮是貝類蛋白質(zhì)代謝的分解產(chǎn)物，當(dāng)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度過高時，容易對水生動物體內(nèi)的酶起到催化作用。氨氮常以離子氨和非離子氨的形式存在于水體中，非離子氨具有脂溶性能夠穿過細(xì)胞膜[3]，因此還會影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使貝類生長受到抑制[4]。鹽度是影響水生動物生理代謝、分布等的重要環(huán)境因子之一[5]。貝類能適應(yīng)一定的鹽度范圍，并根據(jù)鹽度的高低來調(diào)節(jié)自身滲透壓，從而保持正常的生長繁殖，若超出適應(yīng)范圍，則會影響其正常的生理代謝[6]。弧菌是普遍存在的海洋細(xì)菌[7]，水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害最大的細(xì)菌性疾病是由弧菌屬細(xì)菌引起的[8]，其胞外產(chǎn)物是主要的致病因子[9]。脂多糖 (LPS) 是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成部分，具有免疫調(diào)節(jié)作用，是貝類非特異性免疫的重要激活劑[10]，可激活巨噬細(xì)胞活性增強機體吞噬能力。干露會影響貝類生長代謝，離開水體后，貝類的呼吸功能受到抑制[11]，長期暴露在空氣中會導(dǎo)致貝類氧化應(yīng)激[12]，甚至死亡。與其他不利環(huán)境條件一樣，干露可引起活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 過量，造成脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[13-14]，還會影響細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)酶活性的變化。

中國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國，2019年貝類總產(chǎn)量約 1 439×104t，其中牡蠣產(chǎn)量居貝類總產(chǎn)量之首，約 522×104t[15]。香港牡蠣 (Crassostrea hongkongensis) 主要分布在長江以南[16]，是我國南方海域重要的養(yǎng)殖品種，其含有豐富的蛋白質(zhì)，肉味鮮美，具有較高的醫(yī)藥價值[17-18]。香港牡蠣在我國牡蠣養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位[16]，是兩廣地區(qū)牡蠣養(yǎng)殖中最主要的種類。在養(yǎng)殖或運輸過程中，降雨干旱導(dǎo)致的生理環(huán)境急劇變化，長時間的空氣暴露和溫度波動等均會使牡蠣受到多種環(huán)境壓力。急性的物理應(yīng)激會影響牡蠣的免疫功能，造成免疫酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致其成活率下降，這是牡蠣大規(guī)模死亡的原因之一[19-20]。

研究證實，鹽度[21]、氨氮[22]的改變，干露狀態(tài)[23]及弧菌感染[24]等應(yīng)激刺激會引起貝類體內(nèi)代謝發(fā)生重要變化，對其免疫指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響。免疫相關(guān)酶活性是評估環(huán)境應(yīng)激下貝類健康狀態(tài)的重要指標(biāo)[25]，可反映貝類氧化應(yīng)激水平的免疫反應(yīng)，對于了解貝類的健康狀況及其對外界環(huán)境的適應(yīng)性具有重要意義。為探究環(huán)境因子脅迫對香港牡蠣免疫指標(biāo)的影響，本研究采用氨氮、干露、鹽度脅迫和弧菌感染香港牡蠣，測定了各種脅迫條件下香港牡蠣肝胰腺組織中超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、堿性磷酸酶 (AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、總抗氧化能力 (T-AOC)、一氧化氮合酶(NOS)、過氧化物酶 (POD) 活性與丙二醛 (MDA)含量的變化，旨在找出香港牡蠣對環(huán)境因子變化敏感的1～2個免疫指標(biāo)，揭示香港牡蠣在適應(yīng)環(huán)境因子脅迫過程中免疫指標(biāo)的變化規(guī)律，監(jiān)測香港牡蠣的生態(tài)健康養(yǎng)殖，為其養(yǎng)殖推廣提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用香港牡蠣購于廣州市黃沙水產(chǎn)市場，實驗個體為同一環(huán)境條件下養(yǎng)殖的牡蠣，體質(zhì)量為(115.18±16.45) g。實驗在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所進(jìn)行。實驗前牡蠣在水族缸暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)溫度為 (25±1) ℃，鹽度為20，氨氮質(zhì)量濃度低于 0.05 mg?L–1，pH 為 8.1±0.1，暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每天定時投餌、換水。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨氮脅迫實驗設(shè)計 通過預(yù)實驗，在確定香港牡蠣 96 h 氨氮脅迫半致死濃度為 60 mg?L–1的基礎(chǔ)上，設(shè)置 0 mg?L–1(對照組)、6 mg?L–1(低氨氮組) 和 60 mg?L–1(高氨氮組) 3個濃度梯度。向各實驗組添加氯化銨 (NH4Cl)，使水體氨氮終濃度與實驗設(shè)置濃度相同。每隔8 h使用E-1456水質(zhì)分析儀 (德國 Dechem-Tech.GmbH 公司) 檢測各水體的氨氮濃度，將其調(diào)整為實驗設(shè)計的氨氮濃度。每個濃度設(shè)3個平行，每組15只香港牡蠣，進(jìn)行24 h的脅迫實驗。所有組的水溫、鹽度、充氣量等養(yǎng)殖條件均與暫養(yǎng)期間相同。

1.2.2 鹽度脅迫實驗設(shè)計 實驗設(shè)置 3個鹽度梯度[26]，其中鹽度20為對照組，鹽度30為高鹽組，鹽度3為低鹽組，每個鹽度均設(shè)3個平行，每個平行15只香港牡蠣。實驗水體由自來水加海水晶混勻調(diào)制，實驗前水體均充分曝氣。牡蠣在鹽度脅迫后的72 h隨機取樣。所有組的水溫、pH、充氣量等養(yǎng)殖條件均與暫養(yǎng)期間相同。

1.2.3 免疫感染實驗設(shè)計 實驗設(shè)置哈維弧菌(Vibrio harveyi) 組、LPS組、對照組，對照組注射無菌養(yǎng)殖海水50 μL，實驗組分別注射50 μL哈維弧菌 (107CFU?mL–1) 菌液和 LPS (0.5 mg?L–1) 溶液，進(jìn)行24 h感染實驗。每組均設(shè)3個平行，每個平行15只香港牡蠣。所有組的水溫、pH、充氣量等養(yǎng)殖條件均與暫養(yǎng)期間相同。

1.2.4 干露脅迫實驗設(shè)計 將香港牡蠣分別置于25和4 ℃下干露處理7 d，并在第0、第1、第3、第5和第7天取樣。2個溫度均設(shè)3個平行，每個平行50只香港牡蠣。溫度25和4 ℃分別由培養(yǎng)箱和冰箱控制。

1.3 樣品采集與保存

4個脅迫實驗均采用同一方法取樣，即從每個平行中隨機取出3只香港牡蠣，每組共9只，分離出肝胰腺，液氮速凍后于?80 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 樣品處理 將所取樣品與勻漿介質(zhì)(0.86% 的生理鹽水) 以質(zhì)量∶體積=1∶9 (g·mL–1)比例在冰水浴條件下機械勻漿，制備成10%的組織勻漿。之后 2 500 r·min–1離心 10 min，取上清液進(jìn)行相關(guān)免疫指標(biāo)測定。免疫酶活的測定均采用南京建成科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒，實驗操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 ACP和 AKP活性測定 以微量酶標(biāo)法測定 ACP (貨號 A060-2) 和 AKP (A059-2) 活性，ACP和AKP分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測定酶活性的高低。

1.4.3 MDA 含量測定 用硫代巴比妥酸法(TBA法) 測定MDA含量 (A003-1)，過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，可計算出MDA含量。

1.4.4 SOD 活性測定 以羥胺法測定 SOD 活性(A001-3)，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生?O2?，?O2?與羥胺反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)顯色劑作用呈紫紅色，而SOD對?O2?專一性抑制，利用實驗組與對照組的吸光值差異，即可計算出樣品的SOD活性。

1.4.5 T-AOC 活性測定 以微板法 (ABTS法) 測定 T-AOC (A015-1-1)，2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 (ABTS) 在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的 ABTS·+，在抗氧化物存在時，ABTS·+的產(chǎn)生會被抑制，在405或734 nm處測定ABTS·+的吸光度即可測定比計算出樣品T-AOC。

1.4.6 CAT 活性測定 以可見光法測定 CAT 活性(A007-1-1)，CAT 分解過氧化氫 (H2O2) 的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，通過A-5082 TACAN 酶標(biāo)儀 (奧地利 Tecan 有限公司) 在 405 nm處測定其生成量，可計算出CAT的活性。

1.4.7 NOS活性測定 以比色法測定 NOS活性(A014-2)，NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成一氧化氮(NO)，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長下測定吸光度，根據(jù)吸光度的大小可計算出NOS活性。

1.4.8 POD 活性測定 以比色法測定 POD 活性(A084-1-1)，利用POD催化H2O2反應(yīng)的原理，通過測定420 nm處吸光度單獨變化得出其酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對免疫指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)。組間差異采用 Duncan's多重比較分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 氨氮脅迫下香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的變化

方差分析表明氨氮脅迫對香港牡蠣ACP活性具有顯著影響 (圖1-a)，高濃度組和低濃度組中香港牡蠣ACP活性均顯著高于對照組 (P<0.05)，SOD活性與ACP活性變化一致 (圖1-d)。對照組MDA顯著高于低氨氮組 (P<0.05，圖1-c)。POD活性隨氨氮濃度升高而降低 (圖1-h)，T-AOC也有相似的變化趨勢 (圖1-e)，但均無顯著差異 (P>0.05)。此外，CAT活性隨氨氮濃度的增加而下降，高濃度氨氮組CAT活性顯著低于對照組 (P<0.05，圖 1-f)。

2.2 鹽度脅迫下香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的變化

在不同鹽度的環(huán)境中，香港牡蠣肝胰腺中ACP、AKP、T-AOC和POD活性及MDA含量均無顯著變化 (P>0.05，圖2)。在高鹽度脅迫下，SOD活性顯著高于對照組 (P<0.05，圖2-d)，高鹽度也顯著誘導(dǎo)NOS活性上升 (P<0.05，圖2-g)。與其他酶活相比，無論是在低鹽度還是高鹽度中，實驗組CAT活性均顯著高于對照組 (P<0.05，圖2-f)。

圖2 鹽度脅迫對香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的影響Figure 2 Effects of salinity stress on immune enzyme activity in hepatopancreas of C. hongkongensis

2.3 免疫感染后香港牡蠣肝胰腺免疫酶活性的變化

ACP、SOD活性及MDA含量在2種免疫刺激過程中均無顯著變化 (圖3)。LPS組的AKP活性顯著高于哈維弧菌組 (P<0.05，圖3-b)。哈維弧菌免疫感染組T-AOC活性顯著低于對照組和LPS組(P<0.05，圖3-e)，LPS組NOS活性顯著高于對照組和哈維弧菌組 (P<0.05，圖3-g)。此外，2種免疫刺激均顯著降低了香港牡蠣肝胰腺組織中CAT活性 (P<0.05，圖3-f)。對照組POD活性均高于2個實驗組，且顯著高于LPS組 (P<0.05，圖3-h)。

圖3 免疫刺激對香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的影響Figure 3 Effects of immune stimulation on immune enzyme activity in hepatopancreas of C. hongkongensis

2.4 干露條件下香港牡蠣肝胰腺中CAT活性的變化

干露實驗前后，香港牡蠣肝胰腺中CAT活性有顯著差異，即干露初期 (0 d) 與干露后期 (7 d) 相比顯著下降 (P<0.05)。25 ℃干露第3天，CAT活性顯著低于干露第0和第5天 (P<0.05，圖4-a)。溫度為4 ℃，隨著干露時間持續(xù)，CAT活性有顯著差異 (圖4-b)。香港牡蠣肝胰腺中CAT活性在第1和第7天時顯著低于干露初期 (P<0.05)，在第3天，與干露第7天相比CAT活性又有顯著上升(P<0.05)。

圖4 25 ℃ (a) 和4 ℃ (b) 干露條件對香港牡蠣肝胰腺中免疫酶活性的影響不同小寫字母代表各時間點實驗組間存在顯著差異 (P<0.05)Figure 4 Effects of air exposure conditions at 25 ℃ (a) and 4 ℃ (b) on immune enzyme activity in hepatopancreas of C. hongkongensisDifferent lowercase letters indicate significant difference between the experimental groups at different time (P<0.05).

3 討論

代謝過程中，環(huán)境脅迫導(dǎo)致生物機體的生理環(huán)境發(fā)生變化，使其體內(nèi)自由基數(shù)量增加。自由基可以通過各種還原反應(yīng)保護(hù)有機體，但過量則造成機體損害，導(dǎo)致組織損傷[27]?？寡趸?(T-AOC、CAT、SOD) 參與機體對自由基的初級抗氧化保護(hù)，這些酶在免疫應(yīng)答和代謝過程中產(chǎn)生，以防止脂肪酸氧化，減少ROS對機體的毒性作用，并保護(hù)生物體免受氧化損傷[28]。

貝類因缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，其防御機制主要依賴于先天免疫反應(yīng)。ACP和AKP均為水生動物中重要的溶酶體酶，既可參與非特異性免疫作用[29]，也可參與各種代謝過程，如解毒、代謝、大分子生物合成等。本研究中各種濃度氨氮均誘導(dǎo)了ACP活性顯著升高 (P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)的氨氮脅迫會誘導(dǎo)中華小長臂蝦 (Palaemonetes sinensis)體內(nèi)ACP活性顯著上升[30]。粟志民等[22]報道在低濃度氨氮 (1.25～10 mg?L–1) 條件下，馬氏珠母貝(Pinctada martensii) 血清中ACP活性隨氨氮濃度的增加而升高，從而有效提高了機體的抗病力和免疫力，這與本實驗結(jié)果一致；但在高濃度氨氮 (20～40 mg?L–1) 下，馬氏珠母貝的 ACP活性隨氨氮濃度增加而急劇下降，這與本研究中高濃度氨氮組的變化有所不同。原因可能是本實驗的采樣時間點(24 h) 與前者 (72 h) 不同，短時間的氨氮脅迫不會使香港牡蠣出現(xiàn)免疫疲勞，故未觀察到下降趨勢。因此，肝胰腺中ACP活性增加可能是香港牡蠣為維持自身酸堿平衡和離子平衡而通過去磷酸化應(yīng)激反應(yīng)來主動調(diào)節(jié)和適應(yīng)短期氨氮脅迫的結(jié)果。AKP是非特異性磷酸單酯酶，主要作用于細(xì)胞跨膜運輸過程，是所有動物細(xì)胞所固有的質(zhì)膜酶，但在氨氮、鹽度及免疫刺激下，牡蠣肝胰腺組織中AKP活性變化均不顯著。王帥等[31]研究表明低鹽脅迫對中國血蛤 (Hiatula chinensis) AKP的影響不顯著。本研究中，可能是由于過大的環(huán)境壓力致使香港牡蠣的AKP活性受到抑制，而誘導(dǎo)需要一定的反應(yīng)時間，也可能是由于機體免疫系統(tǒng)受到了嚴(yán)重?fù)p害。

MDA含量可以反映機體的脂質(zhì)過氧化速率和強度，也能間接反映組織過氧化損傷程度，是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)。氨氮脅迫下香港牡蠣體內(nèi)MDA含量顯著下降 (P<0.05)，SOD活性顯著上升。本研究結(jié)果與Florence等[32]報道的金屬對紫貽貝 (Mytilus edulis) 和長牡蠣 (C. gigas) 脂質(zhì)過氧化影響的結(jié)果相似，這可能是因為包括SOD在內(nèi)的體內(nèi)抗氧化酶體系增強，限制了MDA的生成。

SOD廣泛存在于機體中，可以將?O2?轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，在機體氧化應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用。本研究中，低氨氮組和高氨氮組SOD活性均呈現(xiàn)顯著誘導(dǎo)作用 (P<0.05)，與方斑東風(fēng)螺 (Babylonia areolata)[33]的研究結(jié)果相似；在鹽度脅迫下，高鹽度組牡蠣肝胰腺中的SOD活性顯著升高 (P<0.05)，這與馬氏珠母貝[22]的研究結(jié)果一致。因此，SOD活性升高可能是因為氨氮或鹽度等環(huán)境脅迫因子使牡蠣體內(nèi)?O2?生成增加，進(jìn)而誘導(dǎo)了牡蠣自身機體的免疫防御機制，使SOD活性顯著上調(diào)，催化?O2?發(fā)生歧化反應(yīng)以保持體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡。

T-AOC主要用于清除體內(nèi)過量的ROS，從而保護(hù)機體免受損害，是反映機體總抗氧化能力的重要綜合性指標(biāo)。在感染哈維弧菌后，香港牡蠣肝胰腺的T-AOC活性顯著下降 (P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，金屬蛋白酶的脅迫會使大菱鲆 (Scophthalmus maximus) T-AOC活性顯著降低[34]。金屬蛋白酶屬于毒力因子，有較強致病性，哈維弧菌中也存在該蛋白酶。由此推測，哈維弧菌中金屬蛋白酶的脅迫使得香港牡蠣體內(nèi)積累了過量的ROS，導(dǎo)致其肝胰腺中T-AOC活性受到抑制，進(jìn)而抑制了香港牡蠣機體的抗氧化系統(tǒng)。

NOS催化L-精氨酸合成NO，NO具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用，參與機體免疫調(diào)控[35]。在高鹽度脅迫下，NOS活性顯著升高 (P<0.05)。與對照組相比，LPS組的NOS活性也顯著升高 (P<0.05)。LPS可誘導(dǎo)炎癥因子并通過NF-kB等轉(zhuǎn)錄途徑激活大量基因，實現(xiàn)機體的免疫應(yīng)答[36]。Shen等[37]研究表明LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞中NOS的表達(dá)和NO的產(chǎn)生，能夠刺激細(xì)胞中的NF-kB通路。蔣秋芬[38]對貝類NO系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激下NOS活性與NO含量顯著升高，進(jìn)一步證實了NO系統(tǒng)參與貝類的免疫防御過程。因此，本研究中NOS在被誘導(dǎo)后合成大量的NO，參與到LPS誘發(fā)的免疫防御調(diào)節(jié)。

POD作為一種抗氧化酶，可以催化H2O2和其他底物反應(yīng)，消耗H2O2，在機體氧化應(yīng)激條件下發(fā)揮重要作用。本研究中，LPS明顯抑制了POD活性 (P<0.05)，而哈維弧菌組卻無顯著變化。Saleem等[39]發(fā)現(xiàn)牡蠣具有識別不同微生物抗原的能力，且能作出不同的機體反應(yīng)，原因可能是香港牡蠣在分別注射LPS和哈維弧菌后免疫酶活性存在差異。在鹽度脅迫下，POD活性較其他抗氧化酶敏感性較低，這一結(jié)果與Liu等[40]的相似。

不同于POD，CAT主要催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，從而達(dá)到消耗H2O2的目的[41]，保持體內(nèi)代謝平衡。本研究表明，氨氮脅迫和免疫刺激均使CAT活性下降，但鹽度脅迫導(dǎo)致CAT活性上升。隨著氨氮濃度的增加，香港牡蠣SOD和ACP活性呈升高趨勢，高氨氮組CAT活性顯著降低 (P<0.05)，對方斑東風(fēng)螺[33]的研究也有相似結(jié)果，這可能是由于氨氮濃度上升，使機體大量產(chǎn)生?O?2等超氧化產(chǎn)物，誘導(dǎo)SOD活性升高將其轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，但?O?2對機體也存在抑制作用，大量?O?2使CAT活性難以升高甚至降低；金屬蛋白酶具有抑制大菱鲆血清CAT活性的作用[34]，這與本研究中哈維弧菌感染實驗的結(jié)果一致，原因可能是蛋白酶破壞了香港牡蠣體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，并誘導(dǎo)ROS在體內(nèi)積累使CAT活性下降。LPS也可以導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激。本研究中LPS誘導(dǎo)的ROS含量超過了機體的耐受程度，因未能及時清除使得CAT活性降低。在鹽度脅迫下，實驗組中CAT活性均顯著高于對照組 (P<0.05)。李庭古[42]研究指出，鹽度會影響蝦蟹類的滲透壓，蝦蟹類主要通過改變代謝狀況來適應(yīng)不同的鹽度環(huán)境。本實驗與上述研究結(jié)果相似，在滲透壓主動調(diào)節(jié)過程中，需要排出多余的鹽分或水分來調(diào)節(jié)透滲壓。此外，當(dāng)機體內(nèi)外存在較高滲透壓梯度時，呼吸器官首先受到損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量增加，這時需要更多的CAT來減少氧自由基對機體造成的損害。

通過上述3個脅迫實驗，可以推測香港牡蠣在受到環(huán)境因子脅迫時，CAT可能適合作為環(huán)境監(jiān)測的潛在生物標(biāo)記物。為了驗證這一個假設(shè)，本研究檢測了不同溫度與不同時間點干露脅迫下香港牡蠣肝胰腺中CAT活性的變化，發(fā)現(xiàn)長時間干露脅迫會降低香港牡蠣的非特異性免疫力，使CAT活性發(fā)生顯著變化，這與Cui等[23]對白仿刺參 (Apostichopus japonicus) 的研究結(jié)果類似。從本實驗結(jié)果可以看出2個溫度的干露脅迫CAT 活性均呈下降、恢復(fù)、再下降趨勢，雖然大體變化趨勢相近，但存在時間上的差異變化。在4 ℃干露實驗組中，由于溫度驟變使CAT活性在第1天顯著降低；25 ℃干露實驗組在第3天CAT活性才顯著降低，原因可能是當(dāng)機體處于不利環(huán)境因素條件下，體內(nèi)抗氧化酶活性受到限制。表明極端溫度的干露脅迫對香港牡蠣機體的損傷程度更高，因為25 ℃是香港牡蠣適宜生存的溫度，即使是在干露條件下其體內(nèi)酶活性也并未從開始就劇烈變化，而是有一個延緩的趨勢。不利因素在時間的加持下逐漸激發(fā)體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，致使CAT活性上升。4 ℃實驗組第3與第7 天相比CAT活性差異顯著，25 ℃實驗組第3天CAT活性顯著高于第5天。隨著時間延長，牡蠣體內(nèi)自由基的清除速率不及產(chǎn)生速率，致使自由基大量積累，破壞了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡，導(dǎo)致CAT活性下降。這可能是7 d干露后CAT活性比0 d顯著降低的主要原因。CAT活性在不同溫度與時間的干露脅迫下表現(xiàn)出敏感性，驗證了CAT適合作為環(huán)境監(jiān)測的潛在生物標(biāo)記物這一觀點。

4 結(jié)論

本研究表明，抗氧化酶是香港牡蠣在外界因子脅迫下一種敏感的生理指標(biāo)。環(huán)境因子脅迫會增加體內(nèi)的自由基含量，刺激機體產(chǎn)生抗氧化防御反應(yīng)，而自由基在體內(nèi)積累過度會產(chǎn)生毒害作用。由此得出結(jié)論，香港牡蠣肝胰腺的CAT適合作為監(jiān)測環(huán)境因子脅迫的潛在生物標(biāo)記物，用于監(jiān)測環(huán)境因子脅迫下香港牡蠣的氧化應(yīng)激反應(yīng)。