曾祥兵，董宏標(biāo)，韋政坤，段亞飛，陳 健，張 慧，孫彩云，許曉東，張家松

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 (上海海洋大學(xué))，上海 201306； 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，廣東 深圳 518121； 4. 陽(yáng)江市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣東 陽(yáng)江 529500；5. 珠海德洋水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，廣東 珠海 519000）

尖吻鱸 (Lates calcarifer) 屬尖吻鱸科、尖吻鱸屬，又名金目鱸、盲鰽，廣泛分布于琉球至印度洋海域，具有生長(zhǎng)快、廣鹽性、養(yǎng)殖成活率高、肉質(zhì)鮮美、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，頗受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者青睞[1-2]。廣東珠三角地區(qū)是我國(guó)尖吻鱸主養(yǎng)區(qū)域，在追求集約化、高效益的同時(shí)亦伴隨著諸多問(wèn)題。高密度養(yǎng)殖系統(tǒng)中，由于較高的投放密度、單一的人工飼料投喂、較為簡(jiǎn)單的生態(tài)系統(tǒng)以及過(guò)低的環(huán)境承載力極易造成水質(zhì)惡化、病害頻發(fā)，其中消化道疾病一直是近年來(lái)的主要病癥之一[3-6]。

天然中草藥的多功能性、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)使其作為水產(chǎn)飼料添加劑越來(lái)越受到重視[7]。雞內(nèi)金(Endothelium corneum gigeriae galli) 為脊索動(dòng)物門雉科動(dòng)物家雞 (Gallus gallus domesticus) 的干燥砂囊內(nèi)壁，即雞的胃內(nèi)膜，其富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等生物活性物質(zhì)，具有消食健胃、固精止遺和通淋化石等一系列藥食兩用功能[8-9]。雞內(nèi)金多糖(Polysaccharide from E. corneum gigeriae galli, PEGG)為雞內(nèi)金經(jīng)一系列工藝提取而成，大量研究表明絕大多數(shù)天然多糖在抗氧化、抗衰老、降血脂、提高機(jī)體免疫力等方面療效顯著[10-13]。蔣長(zhǎng)興等[14]發(fā)現(xiàn)PEGG能夠調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠 (Rattus norvegicus)的代謝紊亂，提高其機(jī)體脂代謝能力，改善血液流變學(xué)指標(biāo)和緩解氧化應(yīng)激水平。目前，有關(guān)PEGG在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用研究尚未見報(bào)道，本研究探討了PEGG對(duì)尖吻鱸幼魚生長(zhǎng)性能、消化能力、腸道抗氧化能力和血清生化指標(biāo)的影響，以期為PEGG在尖吻鱸健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

實(shí)驗(yàn)所用PEGG購(gòu)自湖北天門恒昌化工有限公司 (純度35%)?；A(chǔ)飼料為鱸膨化配合飼料 (珠海海龍生物科技有限公司)，營(yíng)養(yǎng)成分 [質(zhì)量分?jǐn)?shù)：粗蛋白質(zhì)≥41.0%、粗纖維≤3.0%、粗灰分≤18.0%、總磷≥1.20%、粗脂肪≥5.0%、賴氨酸≥2.10%、鈣 (Ca) 0.80%～4.00%、水分≤10.0%]。將 PEGG 溶于蒸餾水配置成母液，按 0、5、20和 80 g·kg?1PEGG設(shè)4個(gè)梯度，高壓噴壺均勻噴涂于飼料表面，經(jīng)30 ℃鼓風(fēng)干燥箱完全烘干后，4 ℃冷藏備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)管理

實(shí)驗(yàn)魚取得、暫養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)開展均在廣東珠海德洋水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)魚先于室內(nèi)方形水泥池 (4 m×2.5 m×1 m) 中暫養(yǎng) 14 d，期間每天07:00和18:00飽食投喂2次基礎(chǔ)飼料，日換水1次，換水率30%。暫養(yǎng)期間水溫 (30±1) ℃、鹽度≤3、溶解氧質(zhì)量濃度≥7 mg·L?1、自然光周期。暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取體表無(wú)損傷、規(guī)格相近的健康尖吻鱸幼魚[(11.85±1.66) g]共240尾，分為 4組，即對(duì)照組 (0 g·kg?1)、低劑量 (5 g·kg?1)、中劑量 (20 g·kg?1) 和高劑量組 (80 g·kg?1)。每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾，養(yǎng)殖于16個(gè)玻璃纖維黑桶中 (300 L)。分別投喂對(duì)應(yīng)劑量飼料，日投喂2次 (7:00和18:00)，日投餌量為魚體質(zhì)量的1%～3%，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周，日常管理和環(huán)境參數(shù)與暫養(yǎng)期間相同。

1.3 樣品采集

分別在第0、第4和第8周取樣，取樣前停喂1 d，每個(gè)重復(fù)組隨機(jī)取1尾實(shí)驗(yàn)魚，合計(jì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組共 4尾魚。實(shí)驗(yàn)魚經(jīng) 200 mg·L–1MS-222浸泡麻醉后，測(cè)其體質(zhì)量和體長(zhǎng)，再經(jīng)1.5 mL無(wú)菌注射器尾靜脈取血，全血樣品在4 ℃下靜置1 h，待血液分層后，3 000 r·min–1離心 10 min，收集血清于1.5 mL離心管，?80 ℃保存。實(shí)驗(yàn)魚采血后，置于冰盤上解剖，稱量?jī)?nèi)臟團(tuán)質(zhì)量，取腸道和胃于 2 mL 離心管中，?80 ℃ 保存。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)以下公式計(jì)算增重率 (WGR)、特定生長(zhǎng)率 (SGR)、臟體比 (VSI)、肥滿度 (CF)：

其中Wt、W0分別為實(shí)驗(yàn)尖吻鱸幼魚的終末體質(zhì)量和初始體質(zhì)量，Wv為魚的內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量；t為實(shí)驗(yàn)天數(shù) (56 d)；L為魚體長(zhǎng) (cm)。

1.4.2 腸道組織切片制備及觀察 腸道組織切片制作與HE染色參照魏杰等[15]方法進(jìn)行。將腸道分為前、中、后3段于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)流水沖洗、梯度乙醇脫水和二甲苯透明，然后進(jìn)行石蠟切片，厚度為5～7 μm，HE染色，中性樹脂封片，于顯微鏡觀察并拍照后，測(cè)量皺襞長(zhǎng)度、皺襞寬度和肌層厚度，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)以上的長(zhǎng)直皺襞進(jìn)行長(zhǎng)度和寬度測(cè)量，取平均值為每個(gè)重復(fù)樣品的測(cè)定值。肌層厚度測(cè)量與統(tǒng)計(jì)方法同上。

1.4.3 抗氧化指標(biāo)和消化酶活性測(cè)定 腸道中超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px)、谷胱甘肽 (GSH)、總抗氧化能力 (T-AOC) 和丙二醛 (MDA) 及胃腸道中胃蛋白酶 (Pep)、胰蛋白酶 (Tryp)、脂肪酶 (LPS) 和淀粉酶 (AMS) 的測(cè)定均采用商業(yè)試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，具體方法參照說(shuō)明書。

1.4.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定 血清中總蛋白 (TP)、總膽固醇 (TC)、甘油三酯 (TG)、血糖 (GLU)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 和谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST) 等指標(biāo)，采用商業(yè)試劑盒 (深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司) 全自動(dòng)生化分析儀 (BS200) 檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果

2.1 PEGG對(duì)尖吻鱸幼魚生長(zhǎng)性能的影響

與對(duì)照組相比，各處理組尖吻鱸幼魚終末體質(zhì)量、增重率和特定生長(zhǎng)率均有升高。其中，高劑量組差異顯著 (P<0.05)；中劑量組肥滿度顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)。各處理組的臟體比均有提高，但無(wú)顯著性差異 (P>0.05，表 1)。

表1 飼料中添加雞內(nèi)金多糖對(duì)尖吻鱸幼魚生長(zhǎng)性能的影響Table 1 Effect of dietary PEGG level on growth performance of juvenile L. calcarifer

2.2 PEGG對(duì)尖吻鱸幼魚消化能力的影響

2.2.1 PEGG 對(duì)腸道組織形態(tài)的影響 與對(duì)照組相比，各處理組腸道完整性增加，腸絨毛排列更加完整致密，杯狀細(xì)胞分布規(guī)律，且以中劑量組最佳(圖1)；各處理組前中腸皺襞高度、前腸皺襞寬度和肌層厚度均顯著增加，中劑量和高劑量組后腸皺襞高度和肌層厚度顯著提高 (P<0.05，圖2)。

圖1 第8周飼料中添加雞內(nèi)金多糖對(duì)尖吻鱸幼魚腸道組織形態(tài)的影響 (10×10倍)F. 前腸；M. 中腸；H. 后腸；V. 絨毛；GC. 杯狀細(xì)胞；ML. 肌層Figure 1 Effects of dietary PEGG level on intestinal histological structure of L. calcarifer on 8th week (10×10 times)F. Foregut; M. Midgut; H. Hindgut; V. Villus; GC. Goblet cell; ML. Muscular layer

圖2 第8周飼料中添加雞內(nèi)金多糖對(duì)尖吻鱸幼魚腸皺襞長(zhǎng)寬和肌層厚度的影響相同橫坐標(biāo)點(diǎn)上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)；后圖同此Figure 2 Effects of dietary PEGG level on intestinal fold height, fold width and muscular thickness of L. calcarifer on 8th weekValues with different letters for the same abscissa point have significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.

2.2.2 PEGG 對(duì)消化酶活性的影響 與對(duì)照組相比，處理組尖吻鱸幼魚胃組織消化酶活性均顯著升高 (圖3)。其中，低劑量組的Pep和胃LPS在第4周、中劑量組和高劑量組Pep和胃LPS在第8周顯著升高 (P<0.05)；低劑量和中劑量組AMS活性在第4周顯著高于其他組，各處理組AMS在第8周顯著升高，以中劑量組最高 (P<0.05)。

圖3 飼料中添加雞內(nèi)金多糖對(duì)尖吻鱸幼魚胃消化酶活力的影響Figure 3 Effects of dietary PEGG level on gastric digestive enzymes of L. calcarifer

與對(duì)照組相比，各處理組尖吻鱸幼魚腸道消化酶活性均有提升 (圖4)，其中，低劑量和中劑量組Tryp在第4周顯著升高，低劑量和高劑量組Tryp在第8周顯著升高 (P<0.05)；低劑量和中劑量組AMS在第8周顯著升高；各處理組LPS在第4周顯著升高，低劑量和中劑量組LPS在第8周顯著升高 (P<0.05)。

圖4 飼料中添加雞內(nèi)金多糖對(duì)尖吻鱸幼魚腸消化酶活力的影響Figure 4 Effects of dietary PEGG level on intestinal digestive enzymes of L. calcarifer

2.3 PEGG對(duì)尖吻鱸幼魚腸道抗氧化能力的影響

與對(duì)照組相比，拌喂PEGG后各處理組尖吻鱸腸道中CAT、SOD、GSH-Px的活性、GSH的濃度和T-AOC較對(duì)照組均顯著上升 (P<0.05)。其中，低劑量組SOD和高劑量組GSH-Px在第4周最高，隨著PEGG添加量的增加，第4周中CAT、GSH、T-AOC和第8周中各抗氧化指標(biāo)呈先增加后下降的趨勢(shì)，其中中劑量組最高；低劑量和中劑量組MDA濃度較對(duì)照組顯著降低(P<0.05，圖 5)。

圖5 飼料中添加雞內(nèi)金多糖對(duì)尖吻鱸幼魚腸抗氧化能力的影響Figure 5 Effects of dietary PEGG level on intestinal antioxidant capacity of L. calcarifer

2.4 PEGG對(duì)尖吻鱸幼魚血清生化指標(biāo)的影響

各處理組的血清TC濃度顯著低于對(duì)照組(P<0.05，表2)，其中以高劑量組最低；中劑量組ALT活性顯著低于對(duì)照組 (P<0.05)；低劑量和中劑量組的AST活性顯著低于對(duì)照組；低劑量和高劑量組的GLU濃度顯著高于對(duì)照組；各組間TP和TG濃度無(wú)顯著性差異 (P>0.05)。

表2 第8周飼料中添加雞內(nèi)金多糖對(duì)尖吻鱸幼魚血清生化指標(biāo)的影響Table 2 Effect of dietary PEGG level on serum biochemical indices of juvenile L. calcarifer on 8th week

3 討論

多糖是由多個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵相連形成的大分子化合物，存在于動(dòng)物、植物和微生物中。大量研究表明多糖具有促進(jìn)魚類生長(zhǎng)的作用，飼料中添加一定的枸杞多糖能夠顯著提高黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco)[16]的增重率，添加黃芪多糖能夠增加雜交鱧 (Channa maculate♀×C. argus♂)[17]的增重率和齊口裂腹魚 (Schizothorax prenanti)[18]的生長(zhǎng)性能。本研究中，各處理組的終末體質(zhì)量、增重率和特定生長(zhǎng)率均高于對(duì)照組，其中高劑量組差異顯著 (P<0.05)，表明PEGG對(duì)尖吻鱸幼魚生長(zhǎng)性能具有一定的促進(jìn)作用。

腸道的發(fā)育狀況和完整性是腸道健康和消化能力的直觀反映[19]。有研究表明，配合飼料會(huì)對(duì)魚類腸道組織形態(tài)造成一定損傷[20-21]。本研究通過(guò)對(duì)腸組織形態(tài)的分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組絨毛排列疏短，破損脫落，而各處理組尖吻鱸腸道完整性增加，腸絨毛和杯狀細(xì)胞排列更加規(guī)律整齊，且腸道各部位的皺襞長(zhǎng)度、皺襞寬度和肌層厚度均有不同程度改善。遲玉森等[22]發(fā)現(xiàn)雞內(nèi)金提取物能夠促進(jìn)小鼠腸道蠕動(dòng)，說(shuō)明PEGG可能通過(guò)促進(jìn)消化，增加腸道蠕動(dòng)，使得尖吻鱸腸道的皺襞和肌層厚度上升，從而增強(qiáng)魚體腸道的消化屏障。

此外，飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分能夠改變魚類消化道中消化酶的特性和濃度[23]。劉成榮[24]發(fā)現(xiàn)枇杷多糖能夠顯著提升金魚 (Carassius auratus) 消化酶活性；Chen和Zhang[25]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加適量的海帶多糖能夠增加草魚 (Ctenopharyngodon idella) 消化酶活性。本研究處理組胃中Pep、AMS、LPS活性和腸中Tryp、AMS、LPS活性均有提高，其中，中劑量組的消化酶活性提升最大 (P<0.05)，表明拌喂一定劑量的PEGG能夠提高尖吻鱸幼魚的消化能力，這可能與雞內(nèi)金中的活性物質(zhì)如胃激素、類角蛋白和胃蛋白酶等[26]能夠促進(jìn)消化有關(guān)。

PEGG具有清除自由基、螯合Fe2+和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的功能[27]。Xiong等[28]發(fā)現(xiàn)PEGG灌胃能夠提升小鼠 (Mus musculus) 心肌組織中的SOD活性，同時(shí)降低MDA濃度；蔣長(zhǎng)興等[14]亦發(fā)現(xiàn)PEGG能夠顯著提升高脂血癥大鼠的總抗氧化能力。SOD和CAT是抗氧化酶系統(tǒng)中的2種關(guān)鍵酶，較高的SOD和CAT活性水平意味著細(xì)胞具備較高的自由基清除能力[29-30]，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化最主要的標(biāo)志物[31]。本研究顯示，低劑量和中劑量組腸道SOD的活性均顯著高于對(duì)照組，各處理組CAT活性顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)，而低劑量和中劑量組MDA濃度顯著低于對(duì)照組 (P<0.05)，說(shuō)明PEGG可以消除腸道中的自由基并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。GSH是細(xì)胞中重要的非酶抗氧化劑，可以中和自由基或氧化劑；GSH-Px也在清除自由基、活性氧 (ROS) 和減少脂質(zhì)過(guò)氧化等方面發(fā)揮著重要作用[32-34]；T-AOC從總體上反映了機(jī)體對(duì)自由基和活性氧類物質(zhì)抵抗能力。本研究中處理組GSH、GSH-Px和T-AOC顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)，表明PEGG可以提高尖吻鱸腸道的抗氧化能力。

血清生化指標(biāo)是反映機(jī)體健康、營(yíng)養(yǎng)和代謝的重要指標(biāo)[35-36]。血清TC和TG濃度能夠反映機(jī)體的脂類代謝程度[37]。蔣長(zhǎng)興等[14]發(fā)現(xiàn)PEGG灌胃能夠降低高脂血癥大鼠血清TG和TC的濃度。本研究中各實(shí)驗(yàn)組間TG濃度無(wú)顯著差異，而拌喂PEGG組中血清TC濃度顯著低于對(duì)照組，其中高劑量組最低 (P<0.05)，表明PEGG對(duì)尖吻鱸幼魚具備一定降血脂的功能，TG濃度無(wú)顯著性變化可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象不同有關(guān)。魚類GLU濃度在一定范圍內(nèi)升高表示魚體消化吸收作用加強(qiáng)[38]。本研究中各處理組GLU濃度均有顯著升高 (P<0.05)。血清ALT和AST是臨床上普遍接受的分析肝臟健康的標(biāo)志酶，而AKP在堿性條件下分解各種磷酸酯，其活性與細(xì)胞損傷有關(guān)[39-40]。本研究表明，適量的PEGG可以降低尖吻鱸血清中ALT和AST活性且不改變AKP活性，表明飼料中添加適量PEGG有利于肝臟健康，但過(guò)量添加又會(huì)導(dǎo)致ALT和AST活性升高，說(shuō)明多糖的添加量并不是越高越好，這與譚連杰等[41]和汪成竹等[42]的研究結(jié)果相似。

綜上，PEGG本身具備一定的促進(jìn)消化能力，其抗氧化功能起到改善腸道的作用，此外PEGG還有一定護(hù)肝和降血脂功效。拌喂適量的PEGG能顯著增強(qiáng)尖吻鱸幼魚的消化能力和腸道抗氧化能力，并改善血清生化指標(biāo)，提高尖吻鱸幼魚生長(zhǎng)性能。在本實(shí)驗(yàn)條件下，PEGG 的最適拌喂量為 20 g·kg?1。