翟詩翔 ,李文軍 ,李莉莉 ,王 莉,秦 松

(1.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003; 2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049; 3.煙臺市奇山醫(yī)院,山東 煙臺 264001; 4.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心,山東 青島 266071)

肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟在受到刺激反復(fù)或連續(xù)損傷時肝臟細(xì)胞對這些損傷的修復(fù)反應(yīng)。當(dāng)長期傷害或炎癥導(dǎo)致肝臟中過多的疤痕組織積聚,就會發(fā)生肝纖維化。肝纖維化是所有慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的必經(jīng)階段,晚期肝纖維化會發(fā)展為肝衰竭甚至肝癌[1]。目前肝臟疾病在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都很高,這與日益增加的經(jīng)濟(jì)和社會影響有關(guān)。而目前缺乏治療肝纖維化的有效療法。

由于肝纖維化的發(fā)生涉及多個因素多條通路的參與,肝纖維化的防治也比較困難。目前在肝纖維化的治療上還沒有特效藥,僅有鱉甲軟肝片和扶正化瘀片這兩種中藥被批準(zhǔn)用來治療肝纖維化[2]。最近很多研究表明肝臟疾病和腸道微生物相關(guān)。腸道和肝臟能通過膽道、門靜脈和體循環(huán)進(jìn)行物質(zhì)交換。腸道中宿主和微生物的代謝物,能通過門靜脈易位至肝臟,影響肝臟中的膽汁酸合成,葡萄糖和脂質(zhì)代謝。如芳香族的氨基酸的微生物代謝產(chǎn)物苯乙酸在非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)病進(jìn)展中起著關(guān)鍵的作用[3]。腸道微生物產(chǎn)生的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)也能通過腸屏障,經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入到肝臟中,激活肝臟巨噬細(xì)胞,產(chǎn)生促炎因子,造成肝臟損傷及纖維化[4-5]。因此,腸道微生物的穩(wěn)態(tài)能影響肝臟的健康,臨床上觀察到肝臟疾病患者體內(nèi)存在腸道微生物失調(diào)的多種情況[6]。

藻藍(lán)蛋白(phycocyanin,PC)是一種天然的色素蛋白,通常存在于藍(lán)藻和紅藻中,目前規(guī)?；苽涞腜C大多來自螺旋藻。近年來的研究證明PC具有抗肺纖維化、保肝和調(diào)節(jié)腸道菌群的作用[7-10],同時PC還容易得到,安全無毒。PC的這些優(yōu)良特性表明其可能是一種改善肝纖維化的潛在物質(zhì)。本文探究了 PC對 CCl4誘導(dǎo)造成的肝纖維化的改善效果及對腸道菌群的影響,解釋了腸道菌群在PC抗纖維化過程中的作用機理。

1 材料

1.1 儀器

7500型實時定量 PCR儀(Applied Biosystems,7500 Fast System),Basic電泳儀(Bio-RAD,Power-Pac Basic),凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-RAD,Chemi-Doc XRS+),正置顯微鏡(Zeiss,Axio Scope.A1),包埋機(Leica,ARCADIA),石蠟切片機(Leica,RM2235)。

1.2 藥物與試劑

本實驗中所用的 PC(產(chǎn)品單號 C-190430,Amax/A280=3.0)購自福清市新大澤螺旋藻有限公司; RNAiso Plus(Total RNA 提取試劑)、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、TB Green?Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus) 購于Takara公司; HE染色試劑盒和Masson染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠21只,體重130～160 g,購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司,許可證號:SCXK(魯) 2019 0003。飼養(yǎng)于山東國際生物科技園。

2 方法

2.1 實驗動物分組及干預(yù)

飼養(yǎng)條件: 溫度 (23±2) ℃,相對濕度(45±10)%,光照周期為12 h光照/12 h黑暗,自由進(jìn)食和進(jìn)水。適應(yīng)性飼喂一周后,以體重為標(biāo)簽,將 21只大鼠隨機分成3 組,每組7只。分組方式為: 對照組(NC),肝纖維化組(FIB),CCl4+PC干預(yù)組(FIB_PC)。CCl4+PC干預(yù)組每天灌胃100 mg/kg的PC,對照組灌胃同等體積的蒸餾水,持續(xù)4周。用腹腔注射CCl4的方法建立肝纖維化模型,具體方法為: 腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為12.5%的CCl4橄欖油溶液,以0.01 mL/g體重每周注射2次,持續(xù)4周[11]。

2.2 樣本采集

大鼠的糞便于干預(yù)的最后一天采集。將大鼠輕輕抓取起來時大鼠就會排便(若無糞便排出,可用消毒棉簽輕輕刺激大鼠的肛門,即可排便),將剛排出的糞便樣品收集于無菌的凍存管中,然后立即放入液氮中冷凍后,置于-80 ℃ 冰箱進(jìn)行保存。

2.3 大鼠肝臟組織的HE和Masson染色

腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g大鼠),使大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后,取肝臟中的最大葉,置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%的多聚甲醛固定液中固定,在4 ℃冰箱內(nèi)固定24 h后,按說明書的方法進(jìn)行HE染色(蘇木精-伊紅染色,hematoxylin and eosin stain)和 Masson染色(又稱馬森三色染色法,masson’s trichrome stain),通過鑒定肝組織中炎性細(xì)胞和纖維化的程度來判斷肝纖維化的階段。將剩余的肝臟組織于-80 ℃冰箱中保存,以備后續(xù)檢測相關(guān)基因的表達(dá)。

2.4 RT-PCR檢測大鼠肝臟組織中纖維化標(biāo)志物的表達(dá)

每組取3只大鼠肝組織,用RNAiso Plus試劑提取總 RNA。肝纖維化標(biāo)志物 I型膠原蛋白(collagen type I,Co-I)和α-平滑肌肌動蛋白(alphasmooth muscle actin,α-SMA)的擴增引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。序列如下所示:α-SMA_F GCCATCAGGAACCTCGAGAA; α-SMA_R AGCTGTCCTTTTGGCCCATT; Co-I_F GGAGAGA GCATGACCGATGG; Co-I _R GGGACTTCTTGAG GTTGCCA; β-actin_F CGTAAAGACCTCTATGCC AACA; β-actin_R GGAGGAGCAATGATCTTGA TCT。每個樣本設(shè)置2個技術(shù)平行。PCR反應(yīng)條件為: 先 95 ℃預(yù)變性 30 s,進(jìn)入循環(huán),循環(huán) 40 次,循環(huán)條件為 95 ℃變性5 s,60 ℃退火和延伸 30 s。以 β-actin 作為內(nèi)參,用雙德爾塔 Ct法(2-ΔΔCt)計算目的基因的相對表達(dá)量。

2.5 腸道菌群的高通量測序

利用糞便 DNA 提取試劑盒提取大鼠糞便樣本的基因組DNA。以細(xì)菌的 16S 核糖體RNA基因的V3—V4 可變區(qū)引物(338F 5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′和 806R 5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′),將所提取的 DNA 樣本進(jìn)行的 PCR 擴增(ABI GeneAmp?9700型 PCR儀)。2%瓊脂糖電泳檢測擴增樣品,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收 PCR產(chǎn)物,使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit試劑盒(Illumina公司)構(gòu)建MiSeq文庫,并根據(jù)測序流程利用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行測序。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用IBM SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,最終結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)呈現(xiàn),用單因素方差分析檢驗不同組之間的顯著性,用wilcoxon秩和檢驗分析不同組菌群之間的顯著性。P＜0.05表明不同組之間有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 PC對 CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化標(biāo)志物的影響

各組干預(yù)后組織中α-SMA和Co-I的mRNA的相對表達(dá)量如圖1所示。FIB組肝臟中α-SMA和Co-I的表達(dá)量較NC組顯著升高(P＜0.05),而與FIB組相比,FIB_PC組肝臟中α-SMA和Co-I的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。

圖1 PC對α-SMA (a) and Co-I (b)表達(dá)的影響Fig.1 Effects of phycocyanin on the liver expression of alpha-smooth muscle actin (α-SMA) (a) and collagen type I (Co-I) (b).

3.2 大鼠肝臟病理分析

用HE染色和 Masson染色評價大鼠的肝損傷程度。HE染色結(jié)果顯示,NC組中大鼠的肝臟結(jié)構(gòu)正常,FIB組中出現(xiàn)了大量的嗜酸小體和大量空泡樣變性的肝細(xì)胞。FIB_PC組中嗜酸小體和空泡樣變性的肝細(xì)胞較 FIB組都有所減輕。Masson染色結(jié)果顯示,NC組僅在匯管區(qū)存在少量的被染成藍(lán)色的膠原纖維,而 FIB組中匯管區(qū)周圍存在大量的膠原纖維,且膠原纖維連在了一起,形成了纖維間隔,說明此時大鼠出現(xiàn)了肝纖維化的癥狀。FIB_PC組中雖然匯管區(qū)也存在一定量的纖維,但沒有形成纖維間隔,其纖維化程度較 FIB組低(圖2)。結(jié)合圖1的結(jié)果,表明CCl4誘導(dǎo)4周能造成肝臟纖維化,PC干預(yù)具有緩解CCl4造成的肝纖維化的作用。

圖2 各組大鼠肝臟組織染色結(jié)果(放大200倍)Fig.2 Pathological section staining of liver tissue (200×)

3.3 腸道微生物基礎(chǔ)質(zhì)控分析

本次測序21個糞便樣本共產(chǎn)生了1 043 032條有效序列,有效堿基數(shù)目為 505 342 145 bp,有效序列的平均長度為 423 bp。各樣本稀釋曲線Shannon指數(shù)達(dá)到平緩(圖3a),coverage指數(shù)達(dá)到了95%以上(圖3b),且reads數(shù)在35 000以上,說明本次測序的數(shù)據(jù)量足夠反映出大鼠腸道菌群的組成的真實情況。

3.4 對OTUs的影響

對所得的reads以97% 的相似度進(jìn)行聚類,共得到 960個操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)(圖3c),NC組有 760個,FIB組有 830個,FIB_PC組有847個,這些組共有的OTUs有639個,NC組獨有38個,FIB組獨有32個,FIB_PC組獨有52個。

圖3 藻藍(lán)蛋白干預(yù)對腸道微生物組成的影響Fig.3 Phycocyanin intervention modulated composition of gut microbiota

3.5 OTUs聚類分析

對測得的各組腸道微生物進(jìn)行OTUs聚類分析,非加權(quán) unifrac主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)的結(jié)果如圖3d所示,以 95%的置信區(qū)間給圖中各組加上分組橢圓,結(jié)果顯示 NC組、FIB組和 FIB_PC組在圖中對應(yīng)的點分布比較集中,且NC組與FIB組、FIB_PC組的分組橢圓沒有交集,說明PC和CCl4都能改變腸道菌群。與FIB組相比,PC_FIB組的分類橢圓距 NC組遠(yuǎn),可能是因為PC_FIB組是CCl4和 PC雙重干預(yù),且PC是灌胃干預(yù),在消化道中直接與腸道微生物接觸,因此對腸道微生物的影響較大。

在門水平上,將相對豐度小于0.005的門設(shè)為其他組,可以看出大鼠腸道內(nèi)主要的門為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(圖4)。FIB組中,與 NC組相比,CCl4誘導(dǎo)增加了厚壁菌門的相對豐度而減少了擬桿菌門的相對豐度。與FIB組相比,FIB_PC組內(nèi)Firmicutes與Bacteroidetes的比值降低。

圖4 腸道微生物在門水平上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of gut microbiota at the phylum level

在科水平上,CCl4誘導(dǎo)降低了擬桿菌科(Bacteroidaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、坦納菌科(Tannerellaceae)等菌群的豐度,PC加入后這些科的細(xì)菌相對豐度增加。此外,與 NC組相比,FIB_PC組還顯著增加了消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)的相對豐度(圖5)。

圖5 藻藍(lán)蛋白干預(yù)在科水平上對腸道微生物豐度的影響Fig.5 Phycocyanin intervention changed the relative abundance of gut microbiota at the family level

在屬水平上,與 NC組相比,FIB組擬桿菌屬(Bacteroides)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、布勞特氏菌屬(Blautia)的相對豐度顯著降低(P＜0.05)。而與FIB組相比,FIB_PC組中別樣棒菌屬(Allobaculum)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等菌的相對豐度顯著增加(圖6)。

圖6 藻藍(lán)蛋白在屬水平上對腸道微生物豐度的影響Fig.6 Phycocyanin intervention changed the relative abundance of gut microbiota at the genus level

4 結(jié)論和討論

因為CCl4腹腔注射誘導(dǎo)的肝纖維化與真實的化學(xué)物質(zhì)造成的肝損傷類似,所以該肝纖維化模型在實驗室廣泛使用。本實驗中,CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織中肝纖維化標(biāo)志物α-SMA和Co-I顯著增加,病理檢查發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)了纖維化樣病變,說明建模成功。

CCl4能通過多種方式對肝臟造成損傷。CCl4在生物組織中發(fā)生碳鍵的斷裂,形成活性三氯甲烷(CCl3·)自由基和三氯甲烷過氧基(CCl3OO·)自由基,這些自由基攻擊肝臟細(xì)胞,導(dǎo)致了細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化,進(jìn)而引起肝細(xì)胞的持續(xù)損傷[12]。之前的研究表明PC能夠通過抗氧化作用降低 CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。Vadiraja等[13]研究表明,PC能夠清除大鼠肝臟內(nèi)CCl4產(chǎn)生的自由基,從而降低脂質(zhì)過氧化和肝損傷。Ou等[7]證明PC可以通過清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)并增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性來減少CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。此外,PC上的色基藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin,PCB)能顯著提高 CCl4小鼠血清和肝臟中的SOD水平,降低肝損傷[12]。在本研究中,PC干預(yù)降低了 CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織中α-SMA和 Co-I的增加,改善了大鼠肝臟組織的病理狀態(tài),說明PC具有改善肝纖維化的作用。

除了誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化外,CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化還可能與腸道菌群相關(guān)。D’Argenio等[14]用 CCl4誘導(dǎo)了大鼠肝纖維化,發(fā)現(xiàn)纖維化大鼠存在腸道菌群失調(diào)。臨床上也發(fā)現(xiàn)了肝硬化患者存在腸菌失調(diào),Qin等[15]通過定量宏基因組學(xué)的方法揭示了肝硬化患者和健康人菌群之間的差異,和健康人相比,肝硬化患者腸道中Bacteroidetes的豐度降低,而Firmicutes的豐度升高。Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)可以反映腸道微生物的失調(diào)情況。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠糞便中主要的菌門為Firmicutes和Bacteroidetes,這2個菌門占據(jù)大鼠總微生物的 90%以上,數(shù)量上涵蓋了大部分的腸道細(xì)菌。CCl4誘導(dǎo)增加了Firmicutes的豐度,降低了 Bacteroidetes的豐度,說明 CCl4誘導(dǎo)了大鼠的腸道菌群的失調(diào),而PC抑制了CCl4造成的Bacteroidetes的豐度降低和Firmicutes的豐度升高,說明PC能夠改善 CCl4引起的腸道微生物的紊亂,這種改善可能有助于PC緩解肝纖維化。

本研究中CCl4干預(yù)降低了Bacteroides、Parabacteroides、Blautia等的豐度,這些菌都能產(chǎn)生短鏈脂肪酸[16-20]。腸道中短鏈脂肪酸具有抗炎作用,短鏈脂肪酸減少會增加機體的炎癥反應(yīng)[21]。之前的研究觀察到自身免疫性肝炎中Parabacteroides的豐度降低[22],非酒精性脂肪肝患者和纖維化患者體內(nèi)Blautia菌顯著降低[23],Yan等人[24]觀察到 CCl4處理后大鼠腸道中Bacteroides豐度下降,D’argenio 等[14]發(fā)現(xiàn) CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠體內(nèi)腸道菌群發(fā)生了紊亂,促炎細(xì)胞因子水平升高。說明CCl4或許可以通過降低短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的豐度,增加機體炎癥,促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。PC干預(yù)增加了腸道中益生菌Blautia的豐度。Blautia能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),從而發(fā)揮抗炎活性,能改善肝硬化患者的預(yù)后[25]。因此,我們推測PC能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),從而降低肝臟的炎癥水平,緩解肝臟纖維化。

PC對 CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化具有良好的改善作用。本文首次比較了 PC 干預(yù)對 CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠腸道微生物組成與結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明了PC能夠增加大鼠體內(nèi)具有抗炎活性的益生菌的豐度,降低肝纖維化標(biāo)志物的表達(dá)水平,具有緩解 CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化的潛力。但PC在消化道中的代謝及其與機體和腸道微生物相互作用的機理較為復(fù)雜,是PC通過腸道微生物影響肝纖維化,還是 PC通過減弱肝纖維化,進(jìn)一步影響腸道菌群,還需要通過糞菌移植等試驗進(jìn)行驗證。