秦海斌 賀星亮 包喜軍 朱 騫 陳 舒

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，在一定條件下可以分化成為多種功能性細(xì)胞，其分類根據(jù)細(xì)胞發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞（ESC）和成體干細(xì)胞（ASC）；根據(jù)發(fā)育潛能可分為全能干細(xì)胞（如TSC）、多能干細(xì)胞（PSCs）和單能干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等）。干細(xì)胞移植到患者體內(nèi)后，具有各種組織和器官的修復(fù)、再生潛能，對(duì)神經(jīng)、血液、心腦血管、肝臟、腎臟等多個(gè)系統(tǒng)的重大疾病具有明顯療效，正在成為各國政府、科技界和產(chǎn)業(yè)界的戰(zhàn)略必爭領(lǐng)域。

近幾年，犬的患病種類主要包括內(nèi)科疾病、病毒性疾病、皮膚病、外科疾病、寄生蟲病、產(chǎn)科病和老年病等，其中內(nèi)科疾病、病毒性疾病、皮膚病、外科疾病分別約占總發(fā)病數(shù)的38%、20%、18%和10%，而干細(xì)胞治療對(duì)上述疾病均有一定效果。因此，從技術(shù)上來看，干細(xì)胞治療在寵物犬、工作犬醫(yī)療領(lǐng)域具備廣闊的應(yīng)用前景。但與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的蓬勃發(fā)展形成鮮明對(duì)比，干細(xì)胞在寵物犬、工作犬中的研究和應(yīng)用相對(duì)較少，尚未形成明顯的市場和社會(huì)效益。其原因包括干細(xì)胞研究的技術(shù)性較強(qiáng)、原材料不易獲取、法律法規(guī)尚未健全等諸多方面。犬類干細(xì)胞的制備、治療技術(shù)的研究和應(yīng)用亟需開展。

本文以犬干細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)干細(xì)胞的制備方法進(jìn)行了初步的探索，并對(duì)干細(xì)胞制劑在皮膚損傷中的修復(fù)功能進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為工作犬的疾病防控提供一種有效的新技術(shù)、新產(chǎn)品。

一、材料與方法

實(shí)驗(yàn)于2020年10月至2021年6月在警犬技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、公安部南京警犬研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。犬的脂肪組織取自健康實(shí)驗(yàn)用史賓格犬的皮下、腹腔，犬齡1～5歲；脂肪組織無菌采集后，放置于無菌平皿中密封運(yùn)輸，在6小時(shí)內(nèi)完成組織塊處理。

脂肪組織處理過程：酒精棉消毒平皿表面、側(cè)面后，在操作臺(tái)內(nèi)打開平皿，取出脂肪塊，用含青霉素-鏈霉素雙抗的PBS沖洗3～5遍，去除肉眼可見的血管、血塊、紅細(xì)胞，剪碎至1cm3大小，等體積加入Ⅰ型膠原酶（濃度為0.075%），在37℃、200r/min的消化1h，加入等體積的 DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)終止消化，12000r/min離心10min， 去除上層液體、保留底部細(xì)胞沉淀，用5mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，室溫靜置10min，1000r/min離心10min后去除上清液，用含15%FBS血清的DMEM培養(yǎng)基重懸底部細(xì)胞，以100目的銅網(wǎng)濾掉雜質(zhì)后，移入培養(yǎng)皿行原代培養(yǎng)，每隔3天換液1次，直至細(xì)胞長成單層。

細(xì)胞傳代、凍存：原代細(xì)胞融合生長至80%以上表面積時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代、4代細(xì)胞，使用PBS沖洗3次后，體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化，以體積分?jǐn)?shù)含量為10%血清、10%DMSO的DMEM培養(yǎng)基作為凍存液，將細(xì)胞凍存于液氮。6個(gè)月后，復(fù)蘇細(xì)胞，觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長特性。

細(xì)胞因子制備：在細(xì)胞傳代過程中，回收細(xì)胞生長速度快、細(xì)胞形態(tài)好、密度大的的細(xì)胞瓶內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.22μm的濾膜過濾后分裝、凍存于-20℃，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、安全性評(píng)估、有效性評(píng)估。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：本文主要針對(duì)1例動(dòng)物的皮膚外傷，應(yīng)用干細(xì)胞因子的進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，觀察干細(xì)胞因子對(duì)修復(fù)皮膚損傷的和促進(jìn)傷口愈合的功能，治療過程配合抗生素治療，防止化膿性感染。

二、結(jié)果

Ⅰ型膠原酶消化法獲取原代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后，次日在平皿底部可見少量細(xì)胞貼壁，單個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形、星形、三角形等不規(guī)則形態(tài)、細(xì)胞大小不一；約3天后細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞縮短，呈梭型，形態(tài)和大小趨于均一；至第10天后細(xì)胞鋪滿單層，呈現(xiàn)一致的梭型形態(tài)，此時(shí)進(jìn)行第1傳代；2代細(xì)胞6～7天可生長成單層細(xì)胞，在連續(xù)傳代過程中細(xì)胞形態(tài)、傳代速度基本保持不變；生長至7代、8代后生長速度減慢，至10天長成單層，9代、10代細(xì)胞分裂緩慢，約14天長成單層。第3代細(xì)胞凍存6個(gè)月后復(fù)蘇，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，與正常細(xì)胞的生物學(xué)特征基本一致。

取第8代以前的細(xì)胞培養(yǎng)基混合液作為細(xì)胞因子，過濾后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，病例為外傷導(dǎo)致的后肢損傷，初期可見皮膚層附帶皮下肌肉層撕裂、脫落，趾骨暴露，每天用細(xì)胞因子噴霧3次，配合抗生素預(yù)防感染，噴霧后第3天可見皮下肌肉層明顯生長，皮膚創(chuàng)面減小，第12天創(chuàng)面基本愈合，只留小面積的皮膚結(jié)痂。噴霧法治療過程中未見過敏、炎癥、皮膚損傷等明顯損傷，初步判斷外用安全。

圖二：犬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長因子治療皮膚損傷的效果觀察

三、討論

當(dāng)前，工作犬領(lǐng)域干細(xì)胞治療制劑的缺乏，主要原因是因?yàn)楦杉?xì)胞來源、制備技術(shù)存在較高難度所致，在脂肪組織采樣、干細(xì)胞制備、治療方式等各個(gè)環(huán)節(jié)均存在許多技術(shù)難點(diǎn)，例如，在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制備過程中，通常采樣部位主要有腹腔內(nèi)脂肪和皮下脂肪2個(gè)部位，均需進(jìn)行外科手術(shù)，帶來一定的附加成本，而且犬因品種和體況不同，脂肪的堆積厚度存在很大差異，特別是對(duì)于長期訓(xùn)練的工作犬而言，皮下脂肪層很薄、不易獲得，且樣本質(zhì)量不高，干細(xì)胞儲(chǔ)存量較少，因此，本研究中主要采集內(nèi)臟脂肪作為樣本，而且為了兼顧犬的福利制度，脂肪樣本一般在犬進(jìn)行手術(shù)或者絕育時(shí)附帶采集，減少了犬的損傷，提高了樣本的質(zhì)量；脂肪組織的培養(yǎng)，主要有組織塊培養(yǎng)法和Ⅰ型膠原酶消化法2種，以組織塊培養(yǎng)法獲取間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，需要對(duì)組織小塊進(jìn)行微量培養(yǎng)基條件下的貼壁培養(yǎng)，此方法需要每天觀察、添加或更換少量培養(yǎng)基，操作次數(shù)和污染概率大大增加，且組織塊帶來的脂肪滴和組織碎片對(duì)細(xì)胞貼壁造成阻礙，不易形成單層細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)中，改用Ⅰ型膠原酶消化法，雖然在組織處理階段比較煩瑣、獲取原代干細(xì)胞數(shù)量較少，但是后期的細(xì)胞貼壁、增殖效果更好，此方法適合于犬的間充質(zhì)干細(xì)胞的小量制備；干細(xì)胞的治療方式包括細(xì)胞移植和干細(xì)胞因子2種，細(xì)胞移植主要應(yīng)用于體內(nèi)組織器官的再生和功能修復(fù)，干細(xì)胞因子則用于外傷、皮膚及其他局部炎癥的治療，本文中的案例為皮膚外傷，適合于探索干細(xì)胞因子的促生長功能，因此，本文中應(yīng)用過濾后的干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，初步證明了干細(xì)胞因子安全，對(duì)犬的外傷具有切實(shí)的療效。

綜上所述，本文完成了干細(xì)胞制備、凍存、干細(xì)胞因子的分離純化等技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究，并對(duì)干細(xì)胞制劑在皮膚損傷中的修復(fù)功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為干細(xì)胞治療在工作犬中的深入研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。