劉麗娟，王 學(xué)，姜梅杰，趙書平,任玉國

(1. 濟(jì)南市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 271100； 2. 青島市黃島區(qū)西海岸新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 青島 266500； 3. 泰安市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 泰安 271000)

陰溝腸桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染重要的病原菌，可引起呼吸道、傷口、泌尿系統(tǒng)感染和腦膜炎等病癥[1-2]。碳青霉烯類抗生素是治療此類菌株感染的最佳藥物。但隨著碳青霉烯類抗生素應(yīng)用的增加，近年來臨床上耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌的檢出數(shù)也逐年增加，給臨床抗感染治療帶來困難[3-5]。對(duì)我院2019年4—9月檢出的耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌分布、耐藥性及耐藥機(jī)制進(jìn)行分析，為抗感染治療及醫(yī)院感染預(yù)防控制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集本院2019年4—9月住院患者臨床分離到的非重復(fù)耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌(亞胺培南或美羅培南MIC≥2 mg/L)，所有菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用WalkAway 96 PLUS NUC61復(fù)合板進(jìn)行菌種鑒定及藥物敏感性檢測(cè)，用K-B紙片擴(kuò)散法補(bǔ)充檢測(cè)頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢噻肟、厄他培南、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的敏感性，藥敏試驗(yàn)執(zhí)行2018年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。其中替加環(huán)素敏感性試驗(yàn)執(zhí)行美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的標(biāo)準(zhǔn)，頭孢哌酮/舒巴坦敏感性試驗(yàn)執(zhí)行CLSI中頭孢哌酮的標(biāo)準(zhǔn)。M-H瓊脂和藥敏紙片均為英國Oxoid產(chǎn)品。銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

1.3 臨床資料收集 采用回顧性分析方法，收集耐藥菌感染患者的臨床資料，包括標(biāo)本來源、科室分布、基礎(chǔ)疾病、抗菌藥物應(yīng)用、是否有創(chuàng)傷性操作、呼吸機(jī)的應(yīng)用情況等。

1.4 碳青霉烯酶檢測(cè)-改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn) 依據(jù)CLSI M100S-28th文件的改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)mCIM聯(lián)合eCIM試驗(yàn)篩選碳青霉烯酶產(chǎn)酶菌株。

1.5 碳青霉烯耐藥基因檢測(cè)及測(cè)序 煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)方法對(duì)碳青霉烯酶類相關(guān)耐藥基因KPC、IMP、VIM、NDM、SME、IMI、NMC及OXA-23、OXA-24、OXA-48、OXA-51、OXA-58基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，所用引物參考文獻(xiàn)[6-10]報(bào)道。PCR反應(yīng)體系為25 μL，含Taq酶(5 U/μL)0.5 μL,10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1 μL，dNTP mixture(5 mmol/L) 0.5 μL，待檢菌DNA模板2 μL，引物F、R(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。退火溫度參照文獻(xiàn)[6-10]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中的BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行對(duì)比,確定基因型。

1.6 多位點(diǎn)序列分型(MLST) 對(duì)陰溝腸桿菌7個(gè)管家基因片段dnaA-fusA-gyrB-leuS-pyrG-rplB-rpoB通過PCR擴(kuò)增后直接測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在pubMLST數(shù)據(jù)庫中已有管家基因譜進(jìn)行比對(duì)，確定序列類型(ST)。MLST分析所用引物見表1。

表1 MLST引物序列

1.7 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 使用限制性內(nèi)切酶XbaI對(duì)染色體DNA進(jìn)行消化，試驗(yàn)參數(shù)為：14℃，電壓6 V/cm，相對(duì)分子質(zhì)量50～400 kb,電場(chǎng)夾角120℃,脈沖4～40 s，電泳時(shí)間20 h。溴化乙錠(EB)染色30 min后在紫外燈下觀察結(jié)果，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，Bionumeric軟件分析，作出進(jìn)化樹分析菌株親緣性，各菌株間相似性>85%判斷為同一克隆株。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用WHONET 5.6軟件進(jìn)行耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 2019年4—9月共檢出8株非重復(fù)耐碳青霉烯陰溝腸桿菌，5株來自于重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)；4株來源于痰,2株來源于穿刺液,1株來源于血標(biāo)本,1株來源于尿標(biāo)本。見表2。

表2 8例耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌感染患者臨床資料

表3 抗菌藥物對(duì)陰溝腸桿菌的MIC值及改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)結(jié)果

A:0.5麥?zhǔn)蠁挝淮竽c埃希菌(ATCC 5922)標(biāo)準(zhǔn)菌液； B: MEM(10 μg)藥敏質(zhì)控片； C: mCIM陽性結(jié)果； D: eCIM陽性結(jié)果。

2.3 碳青霉烯類耐藥基因檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果 8株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌均攜帶B類碳青霉烯酶，表型篩選和基因檢測(cè)的符合率為100%。其中7株P(guān)CR擴(kuò)增出NDM基因目標(biāo)片段(見圖2)，經(jīng)測(cè)序分析比對(duì)均為NDM-1金屬酶基因(見圖3)；1株P(guān)CR擴(kuò)增出IPM基因片段(見圖4)，經(jīng)測(cè)序分析為IPM-4金屬酶基因(見圖5)。

M:為DNA Marker；陰：為陰性對(duì)照；泳道1—4、6—8為臨床blaNDM-1基因陽性菌株；泳道5為臨床blaNDM-1基因陰性菌株。

圖3 耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌PCR產(chǎn)物NDM-1金屬酶基因測(cè)序圖

M：為DNA Marker；陰：為陰性對(duì)照；泳道5為臨床IPM-1基因陽性菌株；泳道1—4、6—8為臨床IPM-1基因陰性菌株。

2.4 MLST分子分型及PFGE同源性分析結(jié)果 8株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌MLST分子分型結(jié)果顯示，有6個(gè)序列類型，依次為ST596(3株)、ST121(1株)、ST993(1株)、ST91(1株)、ST794(1株)、ST88(1株)，ST596是主要流行的序列類型，均來源于ICU。PFGE同源性分析共分為6個(gè)克隆群，分別為A群(菌株L1、L4、L8)、B群(菌株L6)、C群(菌株L2)、D群(菌株L7)、E群(菌株L5)、F群(菌株L3)。3株A群菌株均為ST596型，均來源于ICU。見圖6。

圖5 耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌PCR產(chǎn)物IPM-4金屬酶基因測(cè)序圖

圖6 8株耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌PFGE聚類分析

3 討論

陰溝腸桿菌已成為醫(yī)院感染的常見病原菌之一，其耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，可同時(shí)產(chǎn)Ampc酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及碳青霉烯酶，從而導(dǎo)致多重耐藥，引起難治性感染。早期研究表明，產(chǎn)頭孢菌素酶并伴有膜蛋白的缺失[11]是陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥主要原因。但是目前報(bào)道陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)A類、B類或D類碳青霉烯酶[12]。

所有菌株mCIM聯(lián)合eCIM碳青霉烯酶篩選試驗(yàn)結(jié)果與PCR結(jié)果一致，均檢出B類碳青霉烯酶，7株為NDM-1金屬酶基因，1株為IPM-4金屬酶基因，說明產(chǎn)B類碳青霉烯酶NDM-1是該段時(shí)間內(nèi)陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要原因。 MLST分子分型及PFGE同源性分析有6個(gè)ST序列類型，6個(gè)克隆群：ST596(3株)均為A群，ST121(1株)為C群，ST993(1株)為F群，ST91(1株)為E群，ST794(1株)為B群，ST88(1株)為D群。其中3株ST596 A群陰溝腸桿菌均來源于ICU，說明5月初至8月底存在此型菌株的播散流行。警示本院感染監(jiān)控部門應(yīng)加強(qiáng)ICU多重耐藥菌患者的管理，特別是要做好轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)出患者的監(jiān)管，預(yù)防醫(yī)院感染暴發(fā)。短時(shí)間內(nèi)新生兒科出現(xiàn)2例多重耐藥陰溝腸桿菌，雖然屬于不同的克隆群，但也應(yīng)分析原因，加強(qiáng)科室醫(yī)院感染防控措施。

本研究顯示，本院ICU存在ST596型A群耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌的播散流行。主要的碳青霉烯類耐藥機(jī)制是產(chǎn)B類金屬酶，以NDM-1為主，呈現(xiàn)出多重耐藥的趨勢(shì)，且出現(xiàn)多粘菌素耐藥菌株。由于研究標(biāo)本時(shí)間跨度短，例數(shù)少，可能存在一定局限性，另本課題是回顧性研究，未對(duì)科室人員、醫(yī)療設(shè)備和周圍環(huán)境等進(jìn)行采樣檢測(cè)，未能查找到引起克隆聚集的感染源，需要進(jìn)一步追蹤研究。