陳小軍，莫德云，連海山

（嶺南師范學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院，廣東湛江 524048）

0 引言

微流控芯片（LOC）可實(shí)現(xiàn)微尺度流體的操控與分析，具有微量、快速、陣列化、高通量等特征，在疾病診斷[1－2]、細(xì)胞篩選[3－4]、材料合成[5]、食品安全等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。濃度梯度微流控芯片作為一個新興的技術(shù)平臺越來越受到關(guān)注。通過建立內(nèi)部可控的穩(wěn)定濃度梯度，改變微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的構(gòu)型設(shè)計(jì)及入口液流濃度和速度，可獲得一系列復(fù)雜的濃度梯度。這種技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)、藥物篩選[6]、化學(xué)合成、細(xì)胞毒性和藥性分析[7－8]等其他技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)[9－10]、制藥學(xué)工程等領(lǐng)域[11]。

最早由Whiteside課題組提出一種“圣誕樹”結(jié)構(gòu)的濃度梯度發(fā)生器（Concentration Gradient Generator，CGG）[12－13]，通過多級橫向通道和縱向蜿蜒通道實(shí)現(xiàn)液流分配與混合功能，實(shí)現(xiàn)不同濃度梯度的溶液，具有十分重要的意義。目前，大多數(shù)科研人員開發(fā)了多種結(jié)構(gòu)濃度梯度發(fā)生器，用于生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)工程等研究領(lǐng)域。如細(xì)胞毒性測試[14]、生物和化學(xué)分析[15]、細(xì)胞高內(nèi)涵篩選[16]、細(xì)胞凋亡[17]、細(xì)胞灌注培養(yǎng)[18]、藥物篩選[19]等?，F(xiàn)在多采用傳統(tǒng)的微加工技術(shù)制作微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對于復(fù)雜的微通道結(jié)構(gòu)制造（尤其是多級互聯(lián)結(jié)構(gòu)）則很困難，因此限制了微流控芯片產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。隨著3D 打印技術(shù)興起，越來越多的研究者采用3D 打印技術(shù)直接制作微流控芯片，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)簡單快速、低成本、高精度等一步式制造。如Bhargava[20]采用3D 打印技術(shù)開發(fā)了一個標(biāo)準(zhǔn)化組件和連接器的樣本庫，形成了可擴(kuò)展和縮小的輸出的可調(diào)濃度生成裝置。Shallan[21]等使用3D 打印技術(shù)制作的濃度梯度生產(chǎn)器，2 個溶液入口，經(jīng)過4 層后生成5 種濃度梯度。根據(jù)文獻(xiàn)研究得知，采用傳統(tǒng)微加工技術(shù)或者3D打印技術(shù)制作的微流控芯片都是在二維平面結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的濃度梯度，如圣誕樹結(jié)構(gòu)[12－13]、T 型結(jié)構(gòu)[22]等。若需要產(chǎn)生更多的濃度梯度則芯片面積增大，微通道變得冗長，結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。雖然能得到穩(wěn)定、可控的濃度梯度，但是芯片延展性差。平面結(jié)構(gòu)的微流控芯片只能進(jìn)行兩個分析物之間的相互混合，對于多個分析物的濃度梯度同時實(shí)現(xiàn)則比較困難。3D打印多級互聯(lián)結(jié)構(gòu)的微流控芯片對多個分析物的濃度梯度的實(shí)現(xiàn)提供了一種有效途徑。多級互聯(lián)結(jié)構(gòu)的微流控芯片在時間和空間上產(chǎn)生的濃度梯度能夠保持穩(wěn)定性，并且梯度分布比較多樣化。在立體空間中多個分析物相互混合分配，有助于建立合適的體外模型，更好地模擬生物體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境，對生命活動進(jìn)行更加精確地研究。這些優(yōu)勢在化學(xué)分析和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中體現(xiàn)得更加明顯。

本文利用3D打印技術(shù)制造了一種新型的微流控濃度梯度生成器，該結(jié)構(gòu)由4層4進(jìn)口、36出口多級互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)微通道組成，可以實(shí)現(xiàn)2 種、3 種或4 種分析物溶液的混合，產(chǎn)生任意曲線的濃度梯度分布?；谶B續(xù)稀釋和層流擴(kuò)散混合原理，對微流控芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和濃度形成進(jìn)行了分析；為驗(yàn)證設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)的合理性，對影響出口溶液濃度的關(guān)鍵參數(shù)如不同液流速度、不同壓力等進(jìn)行了仿真分析。實(shí)驗(yàn)部分從定性和定量2個方面表征了濃度梯度分布，建立了濃度與灰度值的擬合曲線，便于濃度的讀取。多藥物濃度形成可實(shí)現(xiàn)了多股溶液的平均分配和混合，為濃度梯度微流控技術(shù)發(fā)展提供了良好的選擇。

1 多級互聯(lián)結(jié)構(gòu)的微流控芯片

1.1 多級互聯(lián)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)原則

為了提高通量且實(shí)現(xiàn)濃度梯度的大規(guī)模建立，設(shè)計(jì)一種近似仿生結(jié)構(gòu)的多級互聯(lián)微通道流量分配網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，整個芯片結(jié)構(gòu)成階梯狀4層4進(jìn)口、36出口立體構(gòu)型，由不同數(shù)量的樹狀分支結(jié)構(gòu)疊加而成。每一層（1、2、3、4）結(jié)構(gòu)溶液的出口數(shù)量分別為9、16、25、36，溶液的出口數(shù)量成指數(shù)級增長。若芯片層數(shù)記為N（Ni＝1，2，3，…），每層出口數(shù)量記為M，出口數(shù)量M＝(Ni＋2)2，與之前文獻(xiàn)設(shè)計(jì)相比，實(shí)現(xiàn)了溶液出口數(shù)量的成倍增長。微通道網(wǎng)絡(luò)芯片每增加一層，分配通道（分支通道）數(shù)目為上一層混合通道（垂直通道）數(shù)目的4倍，即4×M；混合通道數(shù)目呈指數(shù)增長，即為該層微通道網(wǎng)絡(luò)的出口數(shù)量M＝(Ni＋2)2。如圖1所示。所設(shè)計(jì)的濃度梯度微流控芯片能夠快速建立大規(guī)模穩(wěn)定而可控的濃度梯度，可進(jìn)行芯片上多濃度多藥物的同時篩選和高通量操作。

圖1 3D打印多級互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)通道結(jié)構(gòu)

其中，圖1（a）中1 為溶液進(jìn)口區(qū)，2 為濃度梯度生成區(qū)，3 為溶液濃度出口區(qū)，芯片結(jié)構(gòu)由4 層，4 個進(jìn)口，36個出口組成；圖1（b）中箭頭為流動方向。

該結(jié)構(gòu)混合通道垂直長度4 mm，分配通道分支長度為4.2 mm，分配通道的寬度和直徑設(shè)計(jì)為0.6 mm，微通道橫截面為正方形結(jié)構(gòu)，芯片總體尺寸為23 mm×23 mm×36 mm。由于每層分通道尺寸相同，芯片為Y 軸對稱排布，所以每層分配通道內(nèi)液體流動阻力相同。當(dāng)各個入口處的流速相同，溶液從垂直通道進(jìn)入分配通道，理想狀態(tài)下遵循平均分配原則，具體分配樣式如圖2所示。

根據(jù)溶液稀釋原理[14]，每個分支點(diǎn)的溶液分為4份，單分支通道（如圖2 標(biāo)記為1）溶液濃度為原來溶液的濃度，即為a，b，c，d；兩分支混合通道（如圖2標(biāo)記為2）溶液濃度占原分支通道內(nèi)溶液的1/2，即為(a＋b)/2，(a＋c)/2，(b＋d)/2，(c＋d)/2；四分支混合通道（如圖2 標(biāo)記為3）溶液濃度占原分支通道溶液的1/4，即為(a+b+c+d)/4，直接流入與其正對的下級分支通道；下一層分支通道繼續(xù)上一層分支通道分配方法，利用分子自由擴(kuò)散作用，新增分支通道中的非同源溶液經(jīng)混合擴(kuò)散后最終形成均質(zhì)溶液，具有新的濃度，而且濃度為兩股或四股非同源溶液濃度的中間值。如此進(jìn)行逐級分配和混合過程，進(jìn)行5 次后，得到了M 個系列濃度梯度。對于多層級的微流控芯片，遵循上述計(jì)算方法。

圖2 濃度梯度微流控芯片分配

多級互聯(lián)微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)需要實(shí)現(xiàn)微通道內(nèi)溶液的平均分配，還需要實(shí)現(xiàn)每層新增分支通道中溶液的完全混合，才能獲得新的濃度。在微米尺度下的溶液流動屬于層流，溶液分子主要通過兩相界面的相互自由擴(kuò)散達(dá)到混合。因此在分支通道內(nèi)的完全混合需要考察自由擴(kuò)散和層流的2個因素。在微尺度下溶液分子擴(kuò)散的方程為：

式中：R 為氣體常數(shù)；D 為擴(kuò)散系數(shù)；T 為熱力學(xué)溫度；L 為阿伏加德羅常數(shù)；η為介質(zhì)粘度；d 為溶液分子直徑；t 為擴(kuò)散時間；h為擴(kuò)散距離。

對于已知的溶液擴(kuò)散系數(shù)是確定的，擴(kuò)散距離越小，擴(kuò)散時間越短。本實(shí)驗(yàn)使用羅丹明6G溶液為樣本溶液，分子量為479，擴(kuò)散系數(shù)為3.9×10－10m2/s，初步計(jì)算微通道內(nèi)溶液的擴(kuò)散時間為4 min內(nèi)建立穩(wěn)定的濃度梯度。

1.2 多級互聯(lián)結(jié)構(gòu)微流控芯片制造

3D 打印技術(shù)也稱“增材制造技術(shù)”，通過精密控制光源對光敏樹脂進(jìn)行每層曝光固化成型。濃度梯度微流控芯片采用3D 打印技術(shù)（ProJet?D3510，3D Systems）制造，芯片主體材料為VisiJet?M3 Crystal，輔助材料為VisiJet?S300 蠟質(zhì)支撐材料。如圖3 所示。對于4 進(jìn)口、36 出口的濃度梯度微流控芯片，內(nèi)部微通道復(fù)雜而且互相連通，完成常規(guī)的蠟質(zhì)支撐材料去除過程[23－25]（如烘烤、超聲處理等）后，微通道還會有殘留的支撐材料。為了蠟質(zhì)支撐材料去除得更加干凈，使用蠕動泵連接進(jìn)出口循環(huán)沖洗芯片通道，去除殘留的蠟質(zhì)材料；將清洗干凈的芯片放到烤箱烘烤一段時間，再慢慢冷卻處理得到好的光學(xué)透明性[25]，在實(shí)驗(yàn)時有利于觀察和拍照效果。

圖3 微流控芯片實(shí)體結(jié)構(gòu)

2 濃度梯度微流控芯片的性能分析

由3D打印濃度梯度微流控芯片結(jié)構(gòu)可知，濃度梯度微流控芯片經(jīng)過一系列的分配和混合，在出口處可以得到不同的濃度梯度。改變進(jìn)口溶液的不同配比、液流速度、微通道堵塞口等因素都可能會使微流控芯片出口出現(xiàn)不同的濃度梯度分布。在微米尺度下，其雷諾數(shù)遠(yuǎn)小于1，黏滯力大于慣性力，黏滯力占主導(dǎo)作用，流體流動為層流狀態(tài)。兩相溶液不會相互混合，但在兩相溶液接觸面上會發(fā)生分子的自由擴(kuò)散，隨著兩相溶液向下層流動，分子擴(kuò)散時間增加，兩相溶液在下層形成濃度梯度。濃度梯度的分布情況可以采用對流傳質(zhì)方程解釋[26－27]：

式中：c為溶質(zhì)濃度；D為擴(kuò)散系數(shù)；u為流體速度。

利用多物理場耦合軟件COMSOL 仿真濃度梯度微流控芯片的性能，微流體的液體流動可認(rèn)為是不可壓縮的牛頓流體，假定是無滑移邊界條件，可以用Navier－Stokes 方程來進(jìn)行求解。以下從仿真的角度對濃度梯度微流控芯片產(chǎn)生濃度梯度的可行性和效果進(jìn)行分析，為了簡化模型采用2層4進(jìn)口16出口的模型進(jìn)行仿真，縮短仿真時間。

2.1 濃度梯度分布

濃度梯度分布仿真如圖4 所示。圖中邊長方向繪制，縱坐標(biāo)為溶液濃度，橫坐標(biāo)為微通道出口，（a）、（d）為進(jìn)口A通入樣本溶液濃度，B、C、D 三個進(jìn)口通入水溶液，在出口處形成的線性濃度分布；（b）、（e）為進(jìn)口A、B通入樣本溶液濃度，進(jìn)口C、D通入水溶液，在出口處形成階梯形濃度分布；（c）、（f）為進(jìn)口A、C通入樣本溶液濃度，進(jìn)口B、D通入水溶液，在出口處形成對稱的拋物線分布。

圖4 濃度梯度分布仿真

當(dāng)微通道進(jìn)口A 通入濃度50 mol/m3樣本溶液，微通道入口B、C、D通入水溶液，流速為3 μL/min時，通入的溶液進(jìn)行多次的分配、混合，再分配、再混合的過程，最終在出口處形成16種不同的濃度組成的線性濃度分布，如圖4（d）所示；當(dāng)微通道進(jìn)口A、B通入濃度50 mol/m3樣本溶液，微通道入口C、D 通入水溶液時，微通道出口處形成階梯形濃度梯度曲線，如圖4（e）所示；當(dāng)微通道進(jìn)口A、C 通入濃度50 mol/m3樣本溶液，微通道入口B、D通入水溶液時，濃度梯度呈現(xiàn)近似拋物線對稱結(jié)構(gòu)，如圖4（f）所示。通過設(shè)置微通道進(jìn)口溶液的不同濃度的比值，仿真得到如線性梯度、拋物線梯度、階梯形梯度曲線的濃度梯度分布，該結(jié)構(gòu)生成的濃度梯度具有穩(wěn)定性好、易于定量、精確可控等優(yōu)點(diǎn)。

2.2 混合分析

微流控芯片需要形成穩(wěn)定的濃度梯度，與溶液入口流速關(guān)系密切，溶液入口流速直接影響各垂直微通道的混合效果。當(dāng)設(shè)置入口流速為3 μL/min、30 μL/min、60 μL/min，如圖5 所示，溶液流速小于3 μL/min 時，溶液流速慢，溶液經(jīng)分支通道流入垂直通道后兩種溶液很快相互擴(kuò)散混合，在到達(dá)微通道的L截線之前已經(jīng)混合均勻；當(dāng)溶液濃度為30 μL/min和60 μL/min時，在到達(dá)微通道的L截線之前并未達(dá)到完全混合；此時溶液在垂直通道流速太快，造成溶液在垂直通道擴(kuò)散時間較短，從而沒有形成穩(wěn)定的濃度梯度。仿真采用三層立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的芯片，溶液總的流過距離短，溶液混合距離也短，達(dá)到形成穩(wěn)定的濃度梯度需要時間長。當(dāng)芯片層級越多時，入口速度可以設(shè)置越大，溶液也能在出口處也能達(dá)到完全混合。另外形成穩(wěn)定的濃度梯度，除了與芯片的結(jié)構(gòu)、尺寸有關(guān)系之外，還與微通道里的壓力和流速大小相關(guān)。如圖6所示，溶液在微通道內(nèi)的流速和壓力在不同位置的曲線關(guān)系。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，隨著溶液從上層流到下層時，微通道內(nèi)的流速和壓力都是逐漸減小。表明微通道內(nèi)部不同位置對壓力和流速的影響程度不一樣。微通道殘留的支撐材料或者內(nèi)部粗糙度過大也會影響溶液的壓力和流速。

圖5 不同流速的混合效果

圖6 微流控芯片通道的流速和壓力在不同位置的變化曲線

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)芯片材料的疏水特性以及多級互聯(lián)微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，通入溶液時在微通道內(nèi)極易產(chǎn)生殘存氣泡。殘存的氣泡會阻礙溶液的正常流動，影響出口濃度梯度的形成，故實(shí)驗(yàn)前需解決氣泡問題。簡單的方法一般將制作好的芯片放入真空干燥箱，然后抽真空30 min，接入微量注射泵以100 μL/min的流速快速充滿通道，從而將氣泡排除。

3.1 濃度梯度的定性表征

圖7（a）所示對角線位置的2 個進(jìn)口分別通入藍(lán)色和綠色染料溶液，另一個對角線2個進(jìn)口使用水溶液。溶液呈現(xiàn)對角分布而且有線性梯度，兩相溶液交界處溶液有稀釋效果。如圖7（b）所示，在一個進(jìn)口處通入紅色染料溶液，另外3個對角線進(jìn)口通入水溶液。部分出口溶液得到稀釋，濃度出現(xiàn)線性梯度，通過顏色可以判別兩種溶液的稀釋混合情況。由仿真分析結(jié)果得知，當(dāng)一個進(jìn)口通入樣本溶液，其他入口通入水溶液時，A、B兩列溶液應(yīng)該不會混合樣本溶液。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，A、B 兩列混合了濃度不相等的樣本溶液，主要原因可能是微通道堵塞時液流選擇附近相通的通道流動或者芯片內(nèi)滲透作用導(dǎo)致的。

圖7 定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 濃度梯度的定量表征

為了定量讀取濃度，實(shí)驗(yàn)采用羅丹明6G溶液和去離子水作為混合體溶液來表征溶液的濃度梯度，先配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的羅丹明6G 溶液作為母液，定義為相對100%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再用母液分別配制0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的羅丹明6G溶液，如圖8所示。通過圖像處理軟件對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的羅丹明6G 溶液進(jìn)行圖像處理，獲取相應(yīng)的灰度值，將相應(yīng)的數(shù)值擬合成二次多項(xiàng)式，形成溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與灰度值的對應(yīng)關(guān)系，取得圖片的灰度值后轉(zhuǎn)換成濃度值。如圖9 所示，可以看出灰度值隨羅丹明6G溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而減小。

圖8 不同的溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)本

圖9 灰度值擬合曲線

實(shí)驗(yàn)通入羅丹明6G溶液經(jīng)分配、混合，再分配、再混合的過程，在出口處形成溶液濃度梯度，經(jīng)圖像處理軟件轉(zhuǎn)換成8－bit 灰階圖像，然后獲取虛線框的灰度值。再通過圖9 羅丹明6G溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與灰度值的關(guān)系圖得出虛線框溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再轉(zhuǎn)化為溶液的濃度值。如圖10（d）所示的實(shí)驗(yàn)灰度圖，其中一個入口通入樣本溶液，另外3 個入口通入水溶液。圖10（a）～（c）為9、25、36 個出口的濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果與仿真結(jié)果的濃度曲線（虛線框?yàn)閷?shí)驗(yàn)和仿真分析對象），在溶液出口處呈線性關(guān)系，兩者表現(xiàn)非常好的一致性。通過改變?nèi)芤哼M(jìn)口濃度以及改變?nèi)芤哼M(jìn)口速度，可以得到如拋物線、階梯形等不同曲線的濃度梯度分布。出現(xiàn)誤差的原因有很多種，比如說微通道內(nèi)部還有殘留蠟質(zhì)材料、實(shí)驗(yàn)條件限制及操作人員技術(shù)不熟練等造成的。3D打印微通道內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，去除微通道支撐材料困難，殘留的支撐材料相當(dāng)于在微通道內(nèi)部增加了不規(guī)則的障礙塊。障礙塊影響濃度梯度分布情況，但是加強(qiáng)了液體在微通道的擾動，增強(qiáng)溶液的混合效果，所以一般可以不考慮。針對誤差問題，嘗試重新設(shè)計(jì)微通道結(jié)構(gòu)，將微通道改成圓管型，微通道內(nèi)部變得更加光滑，有利于溶液的流動和支撐材料的去除；也可將微流控芯片分層打印，模塊化集成再裝配成型，此結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的微流控芯片簡單方便，延展性強(qiáng)，適應(yīng)場合多。

圖10 微流控芯片濃度梯度實(shí)驗(yàn)與仿真分析結(jié)果（虛線處分析）

4 結(jié)束語

本文采用3D打印技術(shù)制造了一種新型的微通道多級互聯(lián)結(jié)構(gòu)的濃度梯度微流控芯片。芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為4層4入口、36出口，主要由分支通道和垂直通道疊加組成。通過COMSOL軟件對微流控濃度梯度芯片進(jìn)行了仿真分析，結(jié)果顯示，設(shè)置不同的入口濃度及流速可以生成一系列的濃度梯度分布，如線性濃度、階梯濃度、拋物線形濃度等；入口流速越小，混合效果越好，越能產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，但耗費(fèi)時間長；還分析了堵塞口位置對溶液濃度分布的影響。實(shí)驗(yàn)部分和仿真結(jié)果有很好的一致性，說明此結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理。文中所設(shè)計(jì)的微流控濃度梯度生成器，主要優(yōu)勢如下。

（1）采用3D打印技術(shù)制作多級互聯(lián)結(jié)構(gòu)的芯片。內(nèi)部微通道設(shè)計(jì)成立體網(wǎng)絡(luò)互聯(lián)結(jié)構(gòu)，可以充分的混合兩種或者多種藥物濃度，增加了混合種類及混合效率。傳統(tǒng)圣誕樹、T型結(jié)構(gòu)的濃度梯度生產(chǎn)器只能進(jìn)行溶液的兩兩相互混合。

（2）大規(guī)模濃度梯度的形成。該結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)經(jīng)過4層4個入口，一次性可以生成36種濃度梯度，出口濃度數(shù)量呈指數(shù)增長。傳統(tǒng)圣誕樹、T型結(jié)構(gòu)的濃度梯度生產(chǎn)器，每增加一層只增加一種濃度梯度，如果要生成36種濃度梯度分布，則需要使用6個同樣的芯片疊加而成，然而增加了芯片的面積，不適合大規(guī)模集成。

該濃度梯度微流控芯片具有多藥物濃度形成、延展性好、易于讀取、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于新藥研發(fā)中的藥物篩選、化學(xué)合成；也可集成微流控微泵、微閥、微傳感器等組件形成多功能微流控芯片，進(jìn)行細(xì)胞分析檢測、趨向性研究等。