凌峰 張勇 辛向陽

葡萄膜黑色素瘤(UM)是成人最常見的原發(fā)性眼內惡性腫瘤，惡性程度高、易轉移、預后差[1-2]。UM患者盡管以手術為主的綜合治療局部控制良好，但復發(fā)、轉移仍是術后面臨的主要問題[3]，目前轉移后治療尚無一致意見，且效果差。針對癌基因設計靶向藥物是治療腫瘤的重要途徑之一，因此，深入研究UM發(fā)生發(fā)展的分子機制、尋找新型腫瘤轉移標志物及治療靶點具有重要的科學意義和臨床價值。

紡錘體動粒相關復合體-1(SKA1)是紡錘體和動粒相關復合物(SKA)的重要組成部分(或稱亞基)，參與有絲分裂的調控。破壞SKA1的靈活性，或其微管蛋白結合位點，都能擾亂有絲分裂的正常進程，使有絲分裂阻滯于分裂中期，無法進入后期[4-5]。有文獻報道，SKA1在胃癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6-7]，然而，SKA1在UM組織及細胞中的表達、作用及分子機制目前尚不清楚。本研究首次探討了SKA1在UM發(fā)生發(fā)展過程中的作用，并通過基因表達譜芯片聯合生物信息學分析探尋SKA1的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和細胞培養(yǎng)A-375、MUM-2B和MUM-2C細胞株由天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院孫豐源教授惠贈。細胞培養(yǎng)使用含體積分數10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，并加入10 g·L-1青鏈霉素預防細菌污染，置于37 ℃、含體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中，間隔2～3 d更換培養(yǎng)基。

1.2 篩選SKA1敲減的穩(wěn)轉細胞株重懸A-375、MUM-2B和MUM-2C細胞，細胞濃度均調整為4×104個·mL-1，各吸取2 mL細胞懸液，接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，細胞匯合度達30%～40%時，吸去培養(yǎng)液，以2 mL含體積分數10%FBS的培養(yǎng)液稀釋慢病毒(購自上海吉凱)，包括靶向SKA1敲減慢病毒[shSKA1;敲減靶點序列分別為5’-GGAGATGAGATCATTGTAA-3’(shSKA1-1)、5’-GGATACCAAAGGTCGTTATTT-3’(shSKA1-2)、5’-CAATGCTGCAGACCCTAATAA-3’(shSKA1-3)]以及空載體慢病毒(shCtrl)，加入助轉劑聚凝胺(Polybrene，2 g·L-1)，混勻后加入相應孔中。感染慢病毒48～72 h后，換含嘌呤霉素(2 g·L-1)的培養(yǎng)基進行抗性篩選，計算細胞存活率即陽性感染率，最終篩選出SKA1敲減的穩(wěn)轉細胞株作為SKA1敲減組用于后續(xù)實驗。

1.3 實時熒光定量PCR、Western blot檢測使用Trizol試劑分別提取A-375、MUM-2B和MUM-2C細胞總RNA，依據說明書逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測，反應體系：SYBR premixex Taq 6.0 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1.0 μL、RNase-Free H2O 4.0 μL，以GAPDH 作為內參，SKA1相對表達量通過 2-△△Ct或ΔCt計算獲得。

RIPA細胞裂解液提取SKA1敲減組、對照組(轉染shCtrl)的MUM-2B細胞總蛋白，以BCA試劑盒測定蛋白濃度，取30 μg總蛋白上樣于SDS-PAGE凝膠，電泳后電轉至PVDF膜，分別與SKA1抗體(11000，北京博奧森)和GAPDH(1500，Santa Cruz Biotechnology公司，美國)4 ℃孵育過夜，漂洗后與HRP標記的二抗(12000，Santa Cruz Biotechnology公司，美國)室溫孵育2 h，化學發(fā)光試劑顯影，然后采用Quantity one掃描軟件分析。

1.4 MTT檢測細胞增殖取對數生長期的SKA1敲減組和對照組MUM-2B細胞，于96孔板中按每孔3000個細胞鋪板，在培養(yǎng)后不同時間點(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d)加入20 μL 5 g·L-1的MTT試劑于孔中，反應4 h，持續(xù)振蕩6 min，酶標儀檢測490 nm/570 nm處光密度。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡慢病毒轉染MUM-2B細胞48 h后，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化離心SKA1敲減組和對照組MUM-2B細胞，制成單細胞懸液，細胞濃度為2×104個·mL-1。800 r·min-1離心5 min，棄上清，加5 mL PBS重懸細胞，重復2次后離心，棄上清，最后重懸細胞于0.5 mL PBS中。用低速振蕩器邊振蕩邊加入5 mL預冷的含體積分數70%乙醇，4 ℃過夜。第二日將固定好的細胞以1000 r·min-1離心5 min，棄上清，PBS清洗后重懸細胞。加入5 μL(10 g·L-1)的RNaseA，37 ℃消化1 h，加入終濃度50 g·L-1碘化丙啶，4 ℃避光染色過夜，使用流式細胞儀分析軟件Guava InCyte分析。

1.6 Caspase-3/7法檢測細胞凋亡SKA1敲減組、對照組細胞計數后，按每孔1×104個細胞加入96孔板，細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 d，每孔中加入Caspase-Glo反應液100 μL，500 r·min-1離心30 min，再室溫孵育 1 h，酶標儀檢測儀器測定信號強度。

1.7 基因表達譜芯片分析提取SKA1敲減組和對照組MUB-2B細胞的RNA，反轉錄成cDNA，進行表達譜芯片檢測。再采用R limma包篩選差異表達基因，并對差異基因進行GO(Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，初步探索SKA1促進UM細胞增殖的分子機制。

1.8 SKA1生存分析從TCGA GDC網站(https://portal.gdc.cancer.gov/)分別下載UM轉錄組、臨床數據文件，利用定制化perl腳本將下載的UM樣本文件整理成基因轉錄組矩陣文件、臨床文件；再將轉錄組、臨床文件合并，采用R“survminer”和“survival”包，繪制Kaplan-Meier生存曲線圖。依據SKA1表達中位值將UM樣本分為SKA1高、低表達組，利用基因集富集分析(Gene set enrichment analysis)軟件，解析與SKA1表達水平與各信號通路狀態(tài)(激活、抑制或無變化)的關系。

2 結果

2.1 SKA1敲減序列的篩選以qRT-PCR檢測SKA1在不同黑色素瘤細胞株中的表達，相對表達量以-ΔCt表示，結果顯示，SKA1在A-375、MUM-2B和MUM-2C細胞株的表達豐度均高(圖1A)，但在細胞培養(yǎng)過程中，A-375、MUM-2C生長狀態(tài)差，經檢驗為支原體污染，遂采用MUM-2B細胞用于后續(xù)實驗。qRT-PCR檢測MUM-2B各處理組SKA1表達，結果顯示，與shCtrl組相比，SKA1敲減組表達顯著降低(P<0.01)，shSKA1-1、shSKA1-2、shSKA1-3各敲減組的敲減效率分別為78.86%、62.71%、57.83%。因此，shSKA1-1用于后續(xù)細胞表型功能實驗(圖1B)。

圖1 SKA1在三種細胞株的表達豐度及靶向SKA1敲減序列的篩選 A：SKA1在三種細胞株中的表達豐度；B：SKA1不同敲減靶點的敲減率(**P<0.01)。

2.2 SKA1對MUM-2B細胞增殖的影響MTT檢測結果顯示，對照組MUM-2B細胞培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d時光密度分別為0.20±0.00、0.36±0.01、0.61±0.02、0.98±0.02、1.25±0.03；SKA1敲減組MUM-2B細胞培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 時光密度分別為0.15±0.00、0.20±0.04、0.25±0.02、0.37±0.01、0.41±0.05；與對照組相比，SKA1敲減組MUM-2B細胞培養(yǎng)3 d、4 d、5 d 的光密度均顯著降低(均為P<0.01)，說明SKA1敲減后MUM-2B細胞增殖活性被顯著抑制(圖2)。

圖2 對照組、SKA1敲減組MUM-2B細胞MTT生長曲線 注：與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 SKA1對MUM-2B細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，對照組細胞凋亡率為5.30%±0.45%，SKA1敲減組細胞凋亡率為12.63%±0.04%，SKA1敲減組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)。采用Caspase-3/7法檢測Caspase-3/7活性，結果顯示，與對照組相比，SKA1敲減組細胞Caspase-3/7活性顯著增強(P<0.001)，與流式細胞儀檢測的細胞凋亡情況一致(圖3)。

圖3 對照組、SKA1敲減組MUM-2B細胞凋亡比例圖 A：對照組細胞流式凋亡圖；B：SKA1敲減組細胞流式凋亡圖；C：兩組細胞凋亡統(tǒng)計圖；D：兩組細胞Caspase-3/7熒光強度統(tǒng)計圖。注：**P<0.01，***P<0.001。

2.4 SKA1促進UM細胞增殖的分子機制分別提取對照組和SKA1敲減組MUM-2B細胞的RNA，反轉錄成cDNA，進行基因表達譜芯片檢測(圖4)。采用R“l(fā)imma”包篩選差異表達基因，共篩選出差異表達基因362個，其中高表達176個，低表達186個，高、低表達組分別選取差異最顯著的前15個基因，以熱圖展示(圖4A)；并對所有基因及后續(xù)富集通路中的基因以火山圖展示(圖4B)。經GO和KEGG通路富集分析顯示，362個差異基因顯著富集于P53

圖4 SKA1敲減組、對照組全基因表達譜測序熱圖、火山圖、富集分析柱狀圖以及相應細胞Western blot圖 A：高、低表達組中差異最顯著的前15個基因的熱圖; B：全部基因包含P53信號通路8個差異基因的火山圖； C：差異基因GO柱狀圖; D：差異基因KEGG富集分析柱狀圖;E：各組IGFBP-3表達Western blot圖。

信號通路(圖4C、圖4D)，富集在此通路的基因包括胰島素樣生子因子結合蛋白-3(IGFBP3)、SESN2、TNFRSF10B、CCNG1、CD82、ATR、CCNE、RCHY1。為驗證生物信息學的分析結果，分別提取SKA1敲減組及對照組細胞總蛋白，Western blot檢測結果顯示(圖4E)，SKA1敲減組IGFBP3表達下調，提示SKA1通過負調控IGFBP3抑制P53信號通路，從而促進UM細胞的增殖。

2.5 SKA1的高、低相對表達對UM患者生存期的影響將TCGA數據庫UM樣本按SKA1表達(FPKM)最佳界值(Best cutoff=0.64)分為高、低表達患者，繪制Kaplan-Meier生存曲線，結果顯示，SKA1高表達患者生存率顯著下降(P<0.05；HR=2.55,95%CI:0.92～7.05)(圖5)。

圖5 SKA1的不同表達水平在UM患者中Kaplan-Meier生存曲線圖

3 討論

UM是成人最常見的眼內原發(fā)性惡性腫瘤，對于高?；颊?，可采用的有效治療方案不足1%[8]，手術患者約50%以上出現血行轉移，大部分累及肝臟，最終致肝衰竭而死亡。手術切除既沒明顯改善患者的生活質量，又沒達到根治腫瘤的效果。因此，深入研究UM發(fā)生及轉移的分子機制、尋找腫瘤分子標志物及治療新靶點具有重要意義和臨床應用價值。

有文獻報道，SKA1參與胃癌、肝細胞癌、口腔鱗癌、涎腺腺樣囊性癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、神經膠質瘤、甲狀腺乳頭狀癌、骨肉瘤等惡性腫瘤的轉移[9-14]。然而，SKA1在UM發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機制目前尚不清楚。本研究首次發(fā)現SKA1通過P53/IGFBP3促進UM細胞增殖，抑制其凋亡，具有潛在的臨床應用價值。

SKA1介導的信號通路在不同腫瘤中影響不同表型。Li等[15]通過體外實驗發(fā)現，SKA1除了在有絲分裂中富集于紡錘體微管和動粒外層，也會在培養(yǎng)細胞的中心體富集。在SKA1轉基因裸鼠中，敲除SKA1導致中心體復制障礙，而SKA1過表達導致前列腺上皮細胞的中心體過度擴增，出現多個中心體，導致裸鼠的腫瘤發(fā)生概率增高。Zhang等[16]發(fā)現，SKA1敲減后，口腔鱗狀細胞癌CAL-27細胞的增殖、克隆形成能力下降，凋亡增加，細胞周期被阻滯于G2/M期。Shi等[17]研究發(fā)現，SKA1敲減后，A172、U251神經膠質瘤細胞增殖、侵襲能力減弱等。為進一步研究SKA1在UM的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮了促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用，我們利用qRT-PCR 檢測三種UM細胞株中SKA1表達，并篩選出最有效的敲減序列shSKA1，用于后續(xù)的MTT實驗及流式細胞技術、Caspase-3/7法檢測。結果發(fā)現，敲減了SKA1的MUM-2B細胞增殖活性顯著低于對照組，而細胞凋亡速度顯著高于對照組。間接證明了SKA1在UM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促進增殖、抑制凋亡的作用，這與其他文獻[16-17]所報道結果相一致。

IGFBP3是胰島素樣生長因子(IGFs)系統(tǒng)中的六種高親和力蛋白IGFBPs中作用最主要的調節(jié)蛋白，其主要功能是結合循環(huán)中的IGFs，從而控制它們的生物利用率[18]。研究發(fā)現，IGFBP3可以通過控制IGFs對胰島素樣生長因子受體(IGF1R)的作用，從而發(fā)揮其抑制增殖和抗凋亡的作用[19]。Yang等[20]在體內外實驗中均證實，IGFBP3的過表達均能抑制膠質細胞瘤腫瘤細胞增殖，進而抑制腫瘤生長。有研究表明，IGFBP3是P53調控的靶基因，其表達隨野生型P53的增加而增加，并與IGFBP3啟動子中的DNA反應元件結合[21]。P53誘導IGFBP3表達已被證明與細胞凋亡增加和增殖減少有關[22]。這些都證明 IGFBP3 蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。為探索SKA1影響UM的潛在通路，我們利用KEGG富集分析發(fā)現，SKA1可能通過P53信號通路發(fā)揮作用， Western blot檢測結果顯示，SKA1敲減后P53通路中關鍵分子IGFBP3表達隨之下降，提示SKA1可能通過P53/IGFBP3 來影響UM細胞的增殖及凋亡。

同時，我們還分析了TCGA數據庫UM樣本中SKA1表達與臨床及預后的相關性。由于TCGA數據庫沒有UM癌旁正常組織，我們分析SKA1的表達差異，只能分析其與臨床及預后的關系。結果顯示，SKA1高表達的患者總生存率明顯降低，這與Dong等[23]提出的SKA1是影響甲狀腺乳頭狀癌預后的獨立危險因素一致。

綜上所述，本研究發(fā)現SKA1是影響UM預后的獨立危險因素，通過P53/IGFBP3信號通路促進UM細胞增殖，抑制細胞凋亡。因此，SKA1增殖可能成為UM分子治療的潛在靶點，然而，SKA1直接作用機制，包括與SKA1結合的上、下游蛋白分子及功能域尚不明確，有待進一步研究。