郝力慧，董 彬，朱紹華，馬 進(jìn)

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 南方園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；3. 浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300）

全球變暖導(dǎo)致植物在生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性等方面面臨更加多樣化的挑戰(zhàn)[1]。高溫不僅影響植物表型變化，而且會(huì)引起植物體內(nèi)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，生長(zhǎng)和發(fā)育受到抑制，嚴(yán)重影響觀賞植物的品質(zhì)和產(chǎn)量[2?3]。如芍藥Paeonia lactiflora在遭受高溫脅迫后，植株出現(xiàn)萎蔫、畸形、變色等熱害現(xiàn)象，甚至全株死亡[4]。在牡丹P. suffruticosa中也出現(xiàn)類似的表型現(xiàn)象[5]。另外，經(jīng)過(guò)高溫處理后，牡丹和月季Rosa chinensis植株內(nèi)的脯氨酸、丙二醛、可溶性糖以及相對(duì)細(xì)胞膜透性顯著升高，而凈光合速率、超氧化物歧化酶和可溶性蛋白質(zhì)含量等顯著降低[6?8]。為了深入了解高溫脅迫對(duì)觀賞植物品質(zhì)的影響，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等手段[9]，挖掘關(guān)鍵基因并解析其調(diào)控耐熱的分子機(jī)制，是培育和開(kāi)發(fā)耐熱優(yōu)良品種的重要途徑。對(duì)非洲菊Gerbera jamesonii切花高溫處理后，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)大部分單基因簇(unigene)可注釋到細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程和結(jié)合功能等基因本體(GO)過(guò)程中[10]；全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)中代謝功能途徑中的單基因簇分布最多。在柳枝稷Panicum virgatum中發(fā)現(xiàn)[11]：長(zhǎng)期高溫脅迫條件下大量的基因發(fā)生差異表達(dá)，其中與ATP酶調(diào)節(jié)因子、伴侶結(jié)合和蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的基因顯著上調(diào)，與蛋白質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、磷和氮代謝途徑相關(guān)的基因在熱脅迫后顯著下調(diào)。熱激蛋白(heat shock protein, HSPs)是一類高溫脅迫誘導(dǎo)的主要功能蛋白，其分子量為10～200 kDa，包括HSP60、HSP70、HSP90、HSP100和小分子量熱激蛋白[12](small heat shock protein，sHSP)等 5類。HSPs充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量控制的分子伴侶，作為分子伴侶和折疊催化劑細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的中心成分，在熱應(yīng)激中被誘導(dǎo)并參與熱應(yīng)激過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]；sHSP存在多數(shù)植物葉肉細(xì)胞中，在外界熱誘導(dǎo)條件下的sHSP表達(dá)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[14?16]。在女萎Clematis apiifolia[17]中，高溫處理后熱激蛋白熱脅迫后明顯上調(diào)，而且sHSPs是對(duì)熱脅迫反應(yīng)最強(qiáng)烈的伴侶基因家族。HSPs不僅響應(yīng)高溫變化，還對(duì)水分、鹽滲透和氧化脅迫等[12, 14]有響應(yīng)。牡丹是芍藥科Paeoniaceae芍藥屬Paeonia多年生落葉灌木，中國(guó)傳統(tǒng)名花[18]。目前，關(guān)于牡丹基因的研究多集中于生長(zhǎng)發(fā)育、花色基因挖掘以及抗氧化活性物質(zhì)生物合成等方面[19?22]，相關(guān)耐熱研究報(bào)道較少。牡丹對(duì)高溫較為敏感，夏季高溫嚴(yán)重制約牡丹的生長(zhǎng)和發(fā)育，致使花期縮短，觀賞品質(zhì)降低，因此，挖掘牡丹耐熱基因?qū)δ档崦{迫分子機(jī)制探究，以及牡丹育種和推廣具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料牡丹‘羽紅’P. suffruticosa ‘Yuhong’保存在浙江農(nóng)林大學(xué)智能實(shí)驗(yàn)大棚。取長(zhǎng)勢(shì)一致的1年生幼苗移栽至花盆緩苗，1株·盆?1，正常管理。后轉(zhuǎn)移至人工氣候箱中，在溫度25 ℃，光12 h/暗12 h，光強(qiáng)4 000 lx，濕度80%條件下預(yù)培養(yǎng)2周。處理組和對(duì)照組分別置于40和25 ℃人工氣候箱中處理24 h，選取相同位置的葉片，使用液氮速凍并保存于?80 ℃冰箱于后期備用，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 葉片總 RNA 提取及 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建

使用Trizol試劑盒(天根，北京)提取牡丹葉片總RNA，按照說(shuō)明書(shū)操作。用紫外分光光度計(jì)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA質(zhì)量，質(zhì)量檢測(cè)合格后，經(jīng)百邁客生物科技有限公司(北京)使用Illumina HiSeq2 500對(duì)6個(gè)獨(dú)立樣品進(jìn)行雙端文庫(kù)構(gòu)建以及RNA-Seq測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序獲得的原始序列讀長(zhǎng)(raw data)進(jìn)行過(guò)濾組裝，得到高質(zhì)量的有效序列讀長(zhǎng)(clean reads)，然后使用Trinity進(jìn)行序列組裝[23?24]。所得單基因簇序列用基于BLAST算法的搜索和注釋，對(duì)照非冗余蛋白質(zhì)(Nr)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)、全基因組及代謝途徑(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.genome.jp/kegg/kaas/)、蛋白直系同源簇(COG)數(shù)據(jù)庫(kù) (www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)以及瑞士蛋白質(zhì)序列及注解(Swissprot)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.expasy.ch/SPORT)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。使用Blast2Go軟件(www.blast2go.com/)進(jìn)行基因本體論(GO)功能分析。

1.4 基因表達(dá)量及差異基因分析

使用Bowtie軟件將測(cè)序所得的片段與非冗余基因序列庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)合RSEM(RNA-Seq by Expectation-Maximization)預(yù)估表達(dá)量水平[24?25]。在此基礎(chǔ)上分析高溫脅迫處理前后6組樣本的差異表達(dá)基因，使用RPKM[每百萬(wàn)序列讀長(zhǎng)(Reads)中某基因每千長(zhǎng)度序列讀長(zhǎng)值]統(tǒng)計(jì)基因的表達(dá)量；單基因簇表達(dá)豐度用FPKM值表示，以差異倍數(shù)|log2A|≥2。其中，A表示差異倍數(shù)或變化倍數(shù)(flod change)，且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate)≤0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

使用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量 PCR 引物 (表 1)，Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，北京)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：上下游引物(10 μmol·L?1)各0.4 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.2 μL，SYBR Premix ExTaq5.0 μL?？偡磻?yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 復(fù)性30 s，共38個(gè)循環(huán)。以 2?ΔΔCt法[26?28]計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，其中以牡丹泛素延伸蛋白基因(Ubiquitin)為內(nèi)參基因[29]，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量基因引物信息Table 1 Real-time fluorescence quantitative gene primer information

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝結(jié)果

對(duì)照組(ck1、ck2和ck3)與高溫(40 ℃)處理組(TE1、TE2和TE3)樣本經(jīng)過(guò)測(cè)序后，獲得45.97 Gb的有效序列讀長(zhǎng)，且6個(gè)樣品Q30堿基百分比值均大于等于96.71%(表2)。轉(zhuǎn)錄本序列數(shù)量(transcript number)總計(jì) 151 939條，非冗余基因序列數(shù)量(unigene number)54 935條，有較高的組裝完整性。經(jīng)拼接后片段重疊群N50長(zhǎng)度為1 561 nt，平均長(zhǎng)度為 1 042 nt，長(zhǎng)度為 300～500 nt的單基因簇?cái)?shù)量占組裝總量的 36.1%，有19 834條。長(zhǎng)度500～1000 nt的數(shù)量次之，占總量的28.94%。大于2 000 nt的占總量的13.33%(圖1)。

圖1 單基因長(zhǎng)度分布Figure 1 Demo unigene length distribution

表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of sample sequencing data evaluation

2.2 轉(zhuǎn)錄組單基因簇的數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋

將單基因簇基因序列分別在各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，其中以非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr)獲得注釋的比例最高，達(dá)到98.76%(表3)。

表3 單基因簇的注釋統(tǒng)計(jì)Table 3 Unigene annotation statistics

根據(jù)非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種注釋對(duì)比，做出對(duì)應(yīng)注釋圖和E值分布圖，大部分序列(29.13%)E值為 0～10?150(圖 2A)，25.78% 的序列相似度大于80.00%(圖2B)；另外，22.43%的單基因簇基因可注釋到葡萄Vitisvinifera，6.56%的單基因簇序列可以注釋到歐洲栓皮櫟Quercus suber(圖2C)。

圖2 非冗余蛋白質(zhì)注釋分布Figure 2 Nr annotation distribution

2.3 響應(yīng)高溫脅迫的差異基因功能富集分析

以差異倍數(shù)≥2和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率≤0.01為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選獲得7 673個(gè)差異基因，其中4 220個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，3 453個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。利用Web基因本體論注釋軟件進(jìn)行基因本體富集分析(表4)，有6 443個(gè)差異基因富集于生物過(guò)程，主要集中于代謝過(guò)程(1 702個(gè)，占26.42%，GO：0008152)、細(xì)胞進(jìn)程(1 489個(gè)，占23.11%，GO：0009987)和單一生物進(jìn)程(1 148個(gè)，占17.82%，GO：0044699)；有6 491個(gè)差異基因富集于細(xì)胞組分，主要集中于細(xì)胞(1 316個(gè)，占20.27%，GO：0005623)、細(xì)胞組分(1 302個(gè)，占 20.06%，GO：0044464)和細(xì)胞膜(1 232個(gè)，占 18.98%，GO：0016020)；有 3 812個(gè)差異基因富集于分子功能，主要分布在催化活性(1 719個(gè)，占 39.95%，GO：0003824)、結(jié)合活性(1 523個(gè)，占35.09%，GO：0005488)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性(291個(gè)，占7.63%，GO：0005215)等過(guò)程。

表4 差異表達(dá)基因本體注釋Table 4 Difference expression gene GO annotation statistics

將高溫組(TE1、TE2、TE3)與對(duì)照組(ck1、ck2、ck3)相比，進(jìn)行全基因組及代謝途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)富集分析，共有949個(gè)差異基因(different expression gene set，DEGs)可注釋到全基因組及代謝途徑通路中(表 5)。集中在碳代謝途徑 (carbon metabolism)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工 (protein processing in endoplasmic reticulum)的差異基因數(shù)量較多(99個(gè)和59個(gè))，其次是苯丙烷類生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)和糖酵解/糖異生途徑(glycolysis/gluconeogenesis)。表明在高溫刺激后，牡丹中的多種代謝途徑、生物合成途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工途徑等均發(fā)生變化，積極參與應(yīng)激響應(yīng)。

表5 高溫處理下差異表達(dá)基因的代謝通路分析Table 5 Analysis of metabolic pathways for gene expression of differences under high temperature treatment

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，隨機(jī)選取10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的差異基因，分別是熱激蛋白70(PsHSP70，c65824.graph_c0)、核糖體蛋白S4(PsRPS4，c119988.graph_c0)、酸性黏多糖 (PsAMP1，c120725.graph_c0)、肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PsPPIL1，c111758.graph_c0)、4-香豆酸輔酶A連接酶(Ps4CL1，c114411.graph_c0)、陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5(PsCAT5，c106006.graph_c0)、葉綠素酶 (PsCHL1，c111201.graph_c0)、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(PsCCD4，c97637.graph_c0)、腺苷甲硫氨酸脫羧酶樣原酶 (PsSAMDC，C112526.graph_c0)以及假定蛋白(c120729.graph_c1)，使用qRT-PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證分析(圖3)，兩者在變化趨勢(shì)和差異倍數(shù)總體相符，表明測(cè)序結(jié)果相對(duì)可信。

圖3 差異基因定量表達(dá)及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較Figure 3 Real-time fluorescence quantitative results for differential genes

2.5 高溫脅迫下牡丹‘羽紅’熱激蛋白HSP基因挖掘及表達(dá)分析

分析測(cè)序發(fā)現(xiàn)：17個(gè)熱激蛋白基因在高溫脅迫后顯著上調(diào)表達(dá)(表6)，這些熱激蛋白多定位在細(xì)胞核、線粒體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)等部位。選取6個(gè)PsHSP(PsHSP1、PsHSP2、PsHSP4、PsHSP5、PsHSP7、PsHSP11)分別在25和40 ℃處理下進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析(圖4)。在40 ℃高溫處理下，6個(gè)PsHSP表達(dá)呈上升趨勢(shì)，且全部于24 h達(dá)到最大值，之后便呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；25 ℃條件下，6個(gè)PsHSP表達(dá)變化相對(duì)穩(wěn)定。

表6 牡丹葉片響應(yīng)高溫的差異熱激蛋白基因Table 6 Peony leaves respond to high temperature heat shock DEGs

圖4 高溫處理后不同時(shí)間 HSP的 qRT-PCR 表達(dá)變化Figure 4 qRT-PCR detection of HSP in different time periods after high temperature treatment

3 討論

全球變暖使得世界上許多地區(qū)農(nóng)業(yè)受到不同程度的熱害影響。近年來(lái)，植物耐熱性研究逐漸受到關(guān)注。短期或持續(xù)高溫脅迫引起植物形態(tài)和生理生化方面的改變，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)也導(dǎo)致農(nóng)林經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量下降[1, 30?31]。高溫是限制牡丹生長(zhǎng)的重要因素且嚴(yán)重影響其觀賞性。通過(guò)RNA-Seq測(cè)序發(fā)現(xiàn)：牡丹‘羽紅’高溫脅迫后共有7 673個(gè)基因差異表達(dá)，這些差異基因在基因本體注釋主要集中在代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和單一生物過(guò)程；全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析發(fā)現(xiàn)：大部分DEGs富集在碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的加工途徑；同時(shí)，苯丙烷生物合成、光合生物中的碳固定、糖酵解/糖異生和丙酮酸代謝等途徑均受到高溫脅迫的影響。

極端溫度可以造成植物體內(nèi)蛋白質(zhì)功能障礙導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受限，熱激蛋白HSPs參與植物細(xì)胞膜穩(wěn)定及相關(guān)代謝過(guò)程[12, 30]，在響應(yīng)和調(diào)節(jié)高溫脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[32?34]。芍藥PlHSP70基因過(guò)表達(dá)擬南芥Arabidopsis thaliana發(fā)現(xiàn)，PlHSP70對(duì)擬南芥高溫的耐受性有正向調(diào)節(jié)作用，高溫處理后轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素?zé)晒庵得黠@高于野生型植株，此外還具有更加完整的細(xì)胞膜、葉綠體和淀粉顆粒。百合Lilium brownie LlHSP70基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥，LlHSP70可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的高溫耐性；煙草Nicotiana tabacum Class Ⅰ 類熱激蛋白TLHS1基因在煙草幼苗中的表達(dá)水平與耐熱性有較強(qiáng)的相關(guān)性，TLHS1轉(zhuǎn)至煙草幼苗經(jīng)過(guò)高溫脅迫1～4 h后，子葉開(kāi)張率比轉(zhuǎn)反義轉(zhuǎn)基因煙草幼苗高出1倍以上。本研究發(fā)現(xiàn)：高溫脅迫后，共有17個(gè)PsHSP基因在牡丹中上調(diào)表達(dá)，且PsHSP1、PsHSP2、PsHSP4、PsHSP5、PsHSP7和PsHSP11在高溫處理后表達(dá)上調(diào)3倍以上；同時(shí)PsHSPs時(shí)空表達(dá)也發(fā)現(xiàn)，PsHSP隨熱脅迫時(shí)間增加而表達(dá)量上升，24 h后達(dá)到最大值后便逐漸下降，說(shuō)明PsHSP基因可能在短期內(nèi)迅速響應(yīng)高溫脅迫并參與牡丹的耐熱調(diào)控。綜上，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，高溫顯著影響牡丹的代謝和生物合成等過(guò)程，從而抑制牡丹的生長(zhǎng)和發(fā)育。PsHSP基因可在短期內(nèi)迅速響應(yīng)高溫脅迫并參與牡丹的耐熱調(diào)控。本研究可為進(jìn)一步探究牡丹耐高溫脅迫的分子機(jī)制提供依據(jù)。