李志平，張俊莉，雙少敏，路雯婧*

（1. 山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；2. 山西眾智環(huán)境損害司法鑒定中心，山西 太原 030006）

0 引言

碳基材料由于其突出的優(yōu)點(diǎn)如良好的化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性和低毒性等，受到越來越多的關(guān)注，并因其優(yōu)異的性能被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域［1-2］。其中，由于碳點(diǎn)（CDs）具有可調(diào)的光學(xué)特性、化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性、低毒性、特殊的光電性質(zhì)和催化活性等優(yōu)點(diǎn)，被應(yīng)用于化學(xué)探針、生物傳感器、藥物載體、靶向標(biāo)記物、光電器件等諸多方面［3-8］。碳點(diǎn)作為一種重要的碳基材料，在化學(xué)、生物、環(huán)境、物理等多學(xué)科成為研究熱點(diǎn)。

由于碳點(diǎn)卓越的發(fā)光性能、良好的生物相容性和低毒性，基于熒光碳點(diǎn)的生物成像技術(shù)成為探究生物體內(nèi)微環(huán)境的有效手段之一，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的生物標(biāo)記物進(jìn)行可視化評(píng)估［9-12］。然而，目前報(bào)道的碳點(diǎn)的熒光發(fā)射波長大多集中在藍(lán)光到綠光區(qū)域，這限制了它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)和光電子器件中的進(jìn)一步應(yīng)用。由于生物基體的自發(fā)熒光通常集中在短波長區(qū)域，會(huì)對(duì)生物體成像產(chǎn)生一定干擾。因此，開發(fā)一種簡便的宏量制備長波長（如黃光或紅光）熒光碳點(diǎn)的方法具有一定的應(yīng)用意義［13-17］。

癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。癌癥的早期診斷越來越面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，已成為世界性的重大醫(yī)學(xué)難題和亟待研究解決的科學(xué)問題。因此，尋找有效的癌癥早期診斷方法是預(yù)防并及時(shí)治療惡性腫瘤的關(guān)鍵。光學(xué)成像作為一種新興的影像技術(shù)，在靈敏度和分辨率方面顯示出極大優(yōu)勢(shì)，尤其是基于納米技術(shù)的光學(xué)成像探針的應(yīng)用，使其在癌癥的光學(xué)成像和診斷方面具有良好的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值［18-23］。碳點(diǎn)以其優(yōu)良的光化學(xué)性質(zhì)在細(xì)胞標(biāo)記和活體成像領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。然而，通常制備的碳點(diǎn)在生物體內(nèi)的分布沒有選擇性，無法精確地集中于病灶部位，清晰區(qū)分腫瘤組織與正常組織，導(dǎo)致靶向成像效果不明顯。因此，需要發(fā)展具有腫瘤靶向功能的熒光碳點(diǎn)以滿足生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用需求。在碳點(diǎn)表面修飾靶向基團(tuán)或分子將其進(jìn)行功能化，使其與細(xì)胞內(nèi)/外特定分子進(jìn)行相互作用，是實(shí)現(xiàn)多功能碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞器的靶向成像的重要途徑之一［24-30］。

基于以上原因，本文通過低溫濃酸加熱法制備黃色熒光碳點(diǎn)，該碳點(diǎn)不僅具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性，而且可以避免生物基質(zhì)的自發(fā)藍(lán)色熒光，在生物成像領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。因此，我們通過酰胺化反應(yīng)將其表面修飾葉酸分子，使其具有癌細(xì)胞靶向功能。將葉酸功能化的熒光碳點(diǎn)用于混合細(xì)胞（正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的混合培養(yǎng)）的成像研究中，結(jié)果表明該碳點(diǎn)可以根據(jù)細(xì)胞表面葉酸受體表達(dá)水平的高低，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行靈敏的熒光識(shí)別，從而有望達(dá)到對(duì)癌細(xì)胞的早期診斷效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

1. 主要試劑：葡萄糖、葡萄糖胺、麥芽糖、乳糖、葡聚糖和β-環(huán)糊精購自上海阿拉丁試劑公司。1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、氫氧化鈉和濃磷酸購自天津恒心化學(xué)試劑有限公司。葉酸（FA）購自美國Sigma-Aldrich 化學(xué)試劑公司。所有實(shí)驗(yàn)用藥品和試劑均為分析純，且未經(jīng)額外處理直接使用。實(shí)驗(yàn)用水為超純水由美國Milli-Q 超純水儀制得（電阻率=18.25 MΩ?cm）。

2. 主要儀器：透射電子顯微鏡JEM-2100（日本電子株式會(huì)社JEOL），傅立葉變換紅外光譜儀Cary670（美國安捷倫Agilent 科技公司），X 射線光電子能譜儀ESCALAB 250Xi（美國Thermo Fisher科技公司）。紫外可見吸收光譜儀U-2910 和熒光光譜儀F-4500（日本日立公司），瞬態(tài)/穩(wěn)態(tài)熒光分光光度計(jì)FLS920（英國愛丁堡公司），激光共聚焦顯微鏡FV1000（日本Olympus 公司）。

1.2 黃色熒光碳點(diǎn)的宏量制備

分別稱取0.5 g 不同相對(duì)分子量的單糖和多糖物質(zhì)（葡萄糖、葡萄糖胺、麥芽糖、乳糖、葡聚糖和β-環(huán)糊精），加入于1 mL 超純水中，微熱后使其溶解完全。向溶液中加入1 mL 濃磷酸充分混合后，90 ℃加熱15 min ～ 60 min，最終得到深黃色CDs 溶液。冷卻至室溫后用堿溶液調(diào)至中性將上清液通過（截留分子量，MWCO? 500～1000）透析膜透析72 h。最后，將澄清的淺黃色溶液經(jīng)過冷凍干燥后得到CDs 固體。

1.3 葉酸修飾碳點(diǎn)的制備

葉酸修飾碳點(diǎn)選取以葡萄糖胺為碳源所制得的碳點(diǎn)進(jìn)行修飾，采用EDC/NHS 交聯(lián)法合成FACDs。 分 別 稱 取0.018 g FA、0.0153 g EDC、0.0187 g NHS、0.1 g CDs 于離心管中，依次分別加入5、1、1、2 mL PBS 緩沖溶液（0.01 mol/L，pH=7.4），使其完全溶解。在燒瓶中先后加入FA、EDC、NHS 溶液，攪拌30 min 后再加入CDs 溶液，繼續(xù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)入透析袋（截留分子量，MWCO? 500～1 000）進(jìn)行透析，每隔一定時(shí)間取袋種溶液測(cè)量其紫外-可見吸收光譜，直到吸光度不變。隨后將袋內(nèi)溶液冷凍干燥處理后得到FA-CDs 固體粉末。注：為避免FA 失活，整個(gè)反應(yīng)過程遮光進(jìn)行。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)的細(xì)胞為PC-12、MCF-7 和SMMC 7721 細(xì)胞系。首先，將三種細(xì)胞分別加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5.0% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。隨后，用200 μL 含有不同溶度CDs 或FA-CDs 新鮮的DMEM 培養(yǎng)基再進(jìn)行孵育24 h，記為實(shí)驗(yàn)組，每組至少含有6 個(gè)平行樣本。將未加入細(xì)胞但用CDs 或FA-CDs 處理過的孔記為空白組。隨后在每個(gè)孔內(nèi)加入20 μL，5.0 mg/mL的MTT 試劑并進(jìn)一步孵化5 h。移除含有MTT 的培養(yǎng)基后加入150 μL DMSO 溶液，并且將混合物在室溫下震蕩約10 min。利用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm 處混合物的光密度（OD）。細(xì)胞存活能力用公式（1）估算：

細(xì)胞存活率（%）=（OD 實(shí)驗(yàn)組/OD 對(duì)照組）×100%

（1）OD 實(shí)驗(yàn)組為加入CDs 或FA-CDs 的細(xì)胞光密度，OD 對(duì)照組為未經(jīng)CDs 或FA-CDs 處理的細(xì)胞光密度。

1.5 細(xì)胞成像

將 分 別 鋪 有PC-12、MCF-7 和SMMC 7721 三種細(xì)胞系的共聚焦培養(yǎng)皿中加入含有100 mg/mL CDs 或FA-CDs 的DMEM 培 養(yǎng) 基 后 孵 育3 h，去 除多余培養(yǎng)基，用1.0 mL PBS 緩沖液（pH=7.4）洗滌3 次。將培養(yǎng)皿置于Olympus FV1000 激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光現(xiàn)象。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃色熒光碳點(diǎn)的制備

選取不同相對(duì)分子質(zhì)量的糖類物質(zhì)（例如葡萄糖、葡萄糖胺、麥芽糖、乳糖、葡聚糖和環(huán)糊精）為碳源，通過濃磷酸加熱碳化，經(jīng)純化處理后制備了六種熒光碳點(diǎn)（圖1）。所得碳點(diǎn)均可以發(fā)出明亮的黃色熒光，最佳發(fā)射峰位于535 nm～ 543 nm 之間，熒光產(chǎn)率在18% ～23% 之間，合成產(chǎn)率為11% ～18%。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)前驅(qū)體濃度和加熱溫度相同時(shí)，得到碳點(diǎn)所需的碳化時(shí)間與碳類物質(zhì)的相對(duì)分子量成正相關(guān)，糖類相對(duì)分子質(zhì)量越小，所需碳化時(shí)間越短。我們推測(cè)這一現(xiàn)象是由于雙糖與多糖在濃酸熱解的過程中先被水解成單糖，再經(jīng)過脫水聚合形成碳點(diǎn)。經(jīng)過篩選最佳實(shí)驗(yàn)條件，最終選擇以含有氨基的葡萄糖胺為碳源，不僅可以縮短反應(yīng)時(shí)間，而且制備的碳點(diǎn)表面富含氨基便于進(jìn)一步修飾。通過篩選原料比例、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)長，最終選擇葡萄糖胺濃溶液和濃磷酸的體積比VN-Glu：VSPA為1：1，反應(yīng)溫度為90 ℃，碳化時(shí)間為20 min 時(shí)，所制備的碳點(diǎn)量子產(chǎn)率和合成產(chǎn)率最高。量子產(chǎn)率為23.56%，合成產(chǎn)率為18.11%，以上結(jié)果說明該方法有望實(shí)現(xiàn)宏量制備黃色熒光碳點(diǎn)。

圖1 黃色熒光碳點(diǎn)的合成路線Fig. 1 Schematic of synthesis of yellow fluorescent CDs

2.2 碳點(diǎn)的形貌表征和光譜性質(zhì)

采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察碳點(diǎn)的形貌，TEM 圖（圖2 A）清楚地顯示，CDs 為單分散的納米顆粒，粒徑分布較窄在2 nm～ 7 nm 范圍內(nèi)，平均直徑為4.5 nm（圖2 B）。通過元素分析和傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）對(duì)CDs 進(jìn)行了元素和表面結(jié)構(gòu)分析。通過元素分析可知碳點(diǎn)含有C、O、N 和H 四種元素，對(duì)應(yīng)的含量分別為53.2%、31.1%、7.2%和8.5%。如圖2 C，F(xiàn)T-IR 光譜所示在3 400 cm-1處有一個(gè)寬吸收峰是由O-H 拉伸振動(dòng)引起的。2 967 cm-1、1 651 cm-1和1 423 cm-1處 的 尖 峰 分 別對(duì)應(yīng)于C-H、C=O 和C=C。1 272 cm-1處的吸收峰 歸 因 于C - O 鍵。 此 外，在1 553 cm-1和1 063cm-1的吸收峰的歸因于CDs 的N-H 的面內(nèi)彎曲振動(dòng)和C-N 的拉伸振動(dòng)。這些結(jié)果均表明了氮元素成功摻雜在碳點(diǎn)中，并且以不同形式的含氮結(jié)構(gòu)存在（例如氨基），這為碳點(diǎn)的進(jìn)一步功能化提供有利條件。

圖2 CDs 的TEM 圖（A），粒徑分布（B），F(xiàn)T-IR 光譜（C）Fig.2 (A)TEM image,(B)the size distribution,(C)FT-IR spectra of CDs

利用紫外可見吸收光譜、熒光光譜和熒光量子產(chǎn)率研究CDs 的光學(xué)性質(zhì)。在紫外可見吸收光譜中（圖3A），CDs 在283 nm 和350 nm 出現(xiàn)兩個(gè)明顯的吸收峰。283 nm 處的吸收峰可能是CDs 中C=C鍵的π-π*躍遷，350 nm 處的吸收帶可能是附著在CDs 表面的各種官能團(tuán)，例如C=O 鍵的n-π*躍遷引起的。圖3B 插圖所示，將CDs 置于365 nm 紫外光照射下，可觀察到明亮的黃色熒光。在熒光光譜中，CDs 在最佳激發(fā)波長λex為380 nm 時(shí)的最大發(fā)射波長λem在542 nm，并且其發(fā)射光譜具有激發(fā)獨(dú)立性（圖3B）。此外，以羅丹明B 為參照，計(jì)算出CDs的QY 可達(dá)到23.56%。

圖3 CDs 的紫外吸收及熒光光譜（A），在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射譜（B），插圖：日光（左）和紫外光（右）照下的Y-CD 照片F(xiàn)ig. 3 (A)UV-Vis absorption and FL spectra of the CDs. (B)FL spectra of the CDs under different excitation conditions. Inset:the pictures of Y-CDs under daylight(left)and 365 nm UV light(right)

2.3 葉酸修飾碳點(diǎn)的表征

通過以上對(duì)碳點(diǎn)的表征可知，碳點(diǎn)表面含有豐富的氨基，易與葉酸通過酰胺化反應(yīng)。因此，我們?cè)谔键c(diǎn)表面修飾具有癌細(xì)胞靶向功能的葉酸，制備出葉酸修飾碳點(diǎn)（FA-CDs）用于癌細(xì)胞靶向定位。通過測(cè)定FA、CDs 和FA-CDs 的紫外-可見吸收光譜、紅外吸收光譜和Zeta 電位表征所合成的FACDs。如 圖4A 所 示，F(xiàn)A 在345 nm 有 明 顯 的 吸 收峰。同時(shí)，與CDs 相比，F(xiàn)A-CDs 在353 nm 處的吸收峰明顯增強(qiáng)，表明碳點(diǎn)表面連接有FA 結(jié)構(gòu)。此外，通過FT-IR 光譜（圖4B）可以看出，在1 606 cm-1和1 695 cm-1處，F(xiàn)A-CDs 展現(xiàn)出與FA 相同的紅外吸收峰，對(duì)應(yīng)葉酸中苯環(huán)與蝶呤結(jié)構(gòu)。然而CDs 并未有這些吸收帶。FA-CDs 在1 680 cm-1的吸收峰為酰胺鍵中C=O 的伸縮振動(dòng)。另外，在pH=7 的環(huán)境中，經(jīng)過FA 修飾的碳點(diǎn)的Zeta 電位從-9.6 mV 降到-13.8 mV，這一現(xiàn)象是由于CDs 表面的氨基與強(qiáng)負(fù)電性的FA 發(fā)生相互作用，使得FACDs 的電位下降。以上結(jié)果都證明了FA 被成功地修飾到碳點(diǎn)表面。與此同時(shí)，通過測(cè)定相同濃度的CDs 與FA-CDs 在350 nm 的吸光度，計(jì)算出FA 在CDs 表面的固定量約為132 μg/mg。

圖4 FA、CDs 和FA-CDs 的紫外-可見吸收光譜（A）和FT-IR 光譜（B）Fig. 4 UV-Vis absorption(A)and FT-IR(B)spectra of CDs,FA and FA-CDs

2.4 碳點(diǎn)和葉酸修飾碳點(diǎn)的光穩(wěn)定性

首先，通過熒光光譜考察修飾的FA 是否影響碳點(diǎn)的熒光性質(zhì)。如圖5A 所示，功能化碳點(diǎn)的熒光發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度幾乎不受FA 的影響，F(xiàn)ACDs 作為靶向生物試劑有望實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的靶向成像。另外，通過光照時(shí)間、pH 和離子強(qiáng)度對(duì)兩種碳點(diǎn)熒光性質(zhì)的影響探究了兩種碳點(diǎn)的光學(xué)穩(wěn)定性。結(jié)果表明CDs 和FA-CDs 的相對(duì)熒光強(qiáng)度在pH 值為3～11 范圍內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定（圖5B）。從圖5C 可以看出，即使在高離子強(qiáng)度的溶液環(huán)境中（NaCl，2 M），CDs 和FA-CDs 均具有良好的耐鹽性。如圖5D-E 所 示，CDs 和FA-CDs 在 紫 外 光 和 日 光 連 續(xù)照射6 h 后，兩種碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化非常微弱。另外，當(dāng)兩種碳點(diǎn)在4 ℃冰箱存放30 d 后，其熒光性質(zhì)仍不受影響。以上結(jié)果說明兩種碳點(diǎn)具有良好的發(fā)光穩(wěn)定性。這些優(yōu)異的光學(xué)穩(wěn)定性表明，該方法合成的碳點(diǎn)作為熒光探針在分析復(fù)雜樣品方面具有很大的潛力。

圖5 CDs 和FA-CDs 的熒光光譜圖（A）；不同pH（B）；不同離子強(qiáng)度（C）；在可見光（D）、紫外光連續(xù)照射6 h（E）和低溫存儲(chǔ)不同時(shí)間下（F）CDs 和FA-CDs 的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig. 5 (A)FLspectraof CDs and FA-CDs;(B)Effectof pH;(C)Effectof ionicstrengthonFLintensityof CDs andFA-CDs;(D)Effect of visiblelight,(E)UVlightand(F)cryogenicstoragetimeonFLintensityof CDsandFA-CDs

2.5 碳點(diǎn)和葉酸修飾碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性及生物成像研究

為了驗(yàn)證碳點(diǎn)在生物體系的適用性，首先，我們考察了Na+、K+、Mg2+、Ca2+、葡萄糖、GSH、人血清白蛋白（HSA）、牛血紅蛋白等在活細(xì)胞中多種共存物質(zhì)對(duì)CDs 和FA-CDs 的熒光發(fā)射的影響。如圖6 所示，兩種碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度在引入濃度較高的常見生物相關(guān)物質(zhì)后變化不明顯，幾乎不受共存物的干擾。這說明該熒光探針具有較好的生物穩(wěn)定性滿足生物成像應(yīng)用的要求。其次，我們采用標(biāo)準(zhǔn)MTT 法檢測(cè)兩種碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性，并評(píng)價(jià)其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用潛力。如圖7 所示描述三種不同的細(xì)胞系：神經(jīng)PC-12 細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和人肝癌SMMC 7721 細(xì)胞與不同濃度（10 mg/mL～500 mg/mL）的CDs 和FA-CDs 共同賦予24 h 后，依舊表現(xiàn)出良好的細(xì)胞活性。即使兩種碳點(diǎn)的濃度高達(dá)500 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞的存活率仍然均超過80%。這體現(xiàn)了兩種細(xì)胞的低毒性及其在活細(xì)胞內(nèi)成像的巨大潛力，并且修飾FA 不會(huì)影響CDs 的細(xì)胞毒性。

圖6 共存干擾物對(duì)CDs 和FA-CDs 熒光強(qiáng)度的影響Fig. 6 Effect of potentially interfering substances for CDs and FA-CDs

圖7 不同濃度CDs 或FA-CDs 與（A）PC-12，（B）MCF-7 and（C）SMMC 7721 細(xì)胞共孵育24 h 后細(xì)胞的存活率Fig. 7 Cytotoxicity testing results of CDs and FA-CDs on(A)PC-12,(B)MCF-7 and(C)SMMC 7721 cells viability. The values represent percentage cell viability(mean%±SD,n=6)

選 取PC-12、MCF-7 和SMMC 7721 細(xì) 胞 為 模型細(xì)胞，研究FA-CDs 靶向標(biāo)記葉酸受體（FR）過表達(dá)癌細(xì)胞的能力。將CDs 和FA-CDs 分別與三種細(xì)胞共孵育，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞成像結(jié)果。如圖8 所示，三種細(xì)胞與CDs 共孵育后，可觀察到三種細(xì)胞中均出現(xiàn)黃色熒光，表明CDs 具有良好的細(xì)胞通透性可以進(jìn)入細(xì)胞，然而本身沒有靶向識(shí)別的作用。如圖9 所示，觀察經(jīng)過FA-CDs 共孵育后的三種細(xì)胞，PC-12 細(xì)胞中幾乎無熒光，MCF-7 和SMMC 7721 細(xì)胞呈現(xiàn)出黃色熒光，其中MCF-7 細(xì)胞中的熒光最強(qiáng)，說明FA-CDs 標(biāo)記該細(xì)胞的能力最強(qiáng)，這與三種細(xì)胞表面的FR 受體表達(dá)量有關(guān)，細(xì)胞FR 受體越多，葉酸功能化碳點(diǎn)在細(xì)胞中的積累越多。 因?yàn)椋琍C-12 細(xì)胞無FR 受體，SMMC7721 細(xì)胞表面的FR 受體水平低于MCF-7細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象正與這一規(guī)律相符。此外，將FACDs 與PC-12 和MCF-7 的混合細(xì)胞共孵育后，觀察細(xì)胞成像結(jié)果。如圖10 所示，在混合細(xì)胞中，只有FR 受體高表達(dá)的MCF-7 細(xì)胞中觀察到明亮的黃色熒光，而在PC-12 細(xì)胞中幾乎無熒光，說明FA-CDs 可以在復(fù)雜的混合細(xì)胞體系中準(zhǔn)確識(shí)別出FR 受體高表達(dá)的癌細(xì)胞。FA-CDs 作為熒光標(biāo)記材料在臨床癌癥早期診斷中具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖8 PC-12（A-C）、SMMC 7721（D-F）、MCF-7 細(xì)胞（G-H）分別與CDs 共孵育后的激光共聚焦掃描顯微鏡圖像。（A D G）為暗場(chǎng)；（B E H）為明場(chǎng)；（C F I）為疊加圖像。（標(biāo)尺為20 μm）Fig. 8 Laser scanning confocal microscopy images of PC-12(A-C),SMMC 7721(D-F),MCF-7(G-H)cells incubated with CDs.(A D G)panels are dark field;(B E H)panels are bright field;(C F I)panels are the merged images. All scale bars represent 20 μm

圖9 PC-12（A-C）、SMMC 7721（D-F）、MCF-7 細(xì)胞（G-H）分別與FA-CDs 共孵育后的激光共聚焦掃描顯微鏡圖像。（A D G）為暗場(chǎng)；（B E H）為明場(chǎng)；（C F I）為疊加圖像。（標(biāo)尺為20 μm）Fig. 9 LCMI of PC-12(A-C),SMMC 7721(D-F),MCF-7(G-H)cells incubated with FA-CDs. (A D G)panels are dark field;(B E H)panels are bright field;(C F I)panels are the merged images. All scale bars represent 20 μm

圖10 PC-12 和SMMC 7721 混合細(xì)胞與FA-CDs 共孵育后的激光共聚焦掃描顯微鏡圖像。（A）為暗場(chǎng)；（B）為明場(chǎng)；（C）為疊加圖像。（標(biāo)尺為20 μm）Fig. 10 LCMI of PC-12 and SMMC 7721cells incubated with FA-CDs. (A)panel is dark field;(B)panel is bright field;(C)panel is the merged image. All scale bars represent 20 μm

3 結(jié)論

以一系列不同分子量糖類物質(zhì)為碳源，通過濃酸碳化的方法實(shí)現(xiàn)了黃色熒光碳點(diǎn)的宏量制備。研究結(jié)果表明碳點(diǎn)所需碳化時(shí)間和糖類物質(zhì)的相對(duì)分子量成正相關(guān)。選取葡萄糖胺為前驅(qū)體，通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件可制備出QY 高達(dá)23.56%的黃色熒光碳點(diǎn)。將其表面通過酰胺鍵修飾葉酸分子，成功構(gòu)建了癌細(xì)胞靶向熒光碳點(diǎn)FA-CDs。所制備的FA-CDs 光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，細(xì)胞相容性好，毒性低，并且不受生物體系其他共存物的干擾。其通過FA 與癌細(xì)胞FR 受體相互作用，能夠作為熒光標(biāo)記物在混合細(xì)胞中有效識(shí)別癌細(xì)胞，證明該熒光探針在癌癥的早期診斷中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。