周 青，張晏潔，薛 源，芮建中，周國(guó)華

東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 臨床藥學(xué)科，南京210002

骨肉瘤是臨床常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于兒童與青少年，具有病情進(jìn)展快、肺轉(zhuǎn)移早、病死率高等特點(diǎn)。目前臨床對(duì)骨肉瘤的治療，多以外科治療為主、化療或其他治療為輔[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外發(fā)布的最新的骨肉瘤診療相關(guān)指南均推薦甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作為骨肉瘤的一線化療藥物，而大劑量甲氨蝶呤（HD-MTX）聯(lián)合亞葉酸鈣（CF）解救療法已成為治療骨肉瘤的重要手段，該方案可顯著提高患者的生存率[2]。但由于給藥劑量大，MTX 在體內(nèi)的血藥濃度往往較高，在提高療效的同時(shí)也導(dǎo)致毒副反應(yīng)發(fā)生率相應(yīng)增加，且MTX 在體內(nèi)代謝具有顯著的個(gè)體差異，需密切監(jiān)測(cè)患者血藥濃度，在確保療效的同時(shí)也減少不良反應(yīng)的發(fā)生。此外，越來(lái)越多的研究表明，MTX 體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物7-羥基甲氨蝶呤（7-OH MTX）的血藥濃度與MTX 不良反應(yīng)具有相關(guān)性[3]。因此，同時(shí)監(jiān)測(cè)MTX 及7-OH MTX 的血藥濃度可更為精準(zhǔn)、靈敏地預(yù)判HD-MTX 臨床不良反應(yīng)的發(fā)生，這對(duì)于臨床合理用藥具有重要意義[4]。

本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的LC-MS/MS 定量分析方法，能夠同時(shí)測(cè)定人血清中MTX 和7-OH MTX 的藥物濃度，并應(yīng)用于臨床治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM），同時(shí)為MTX 人體藥動(dòng)學(xué)研究及個(gè)體化用藥實(shí)踐提供方法學(xué)參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；API 4000 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB 公司）；渦旋混合儀（美國(guó)Scientific Industries 公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman 公司）；十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤對(duì)照品（純度99.8%，批號(hào)100138-201606，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；7-羥基甲氨喋呤（7-OH MTX）對(duì)照品（純度97%，批號(hào)4-JSH-16-2，Toronto Research Chemicals）；內(nèi)標(biāo)氨基蝶呤（IS）對(duì)照品（純度≥97%，批號(hào)039M4021V，Sigma）。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；超純水。

人血清（批號(hào)20200508，北京鑫泉永碩科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：含0.1%甲酸的水溶液（A 相）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（B 相）（梯度洗脫：0～0.5 min，95%A；0.5～1.2 min，95%～20%A；1.2～3.5 min，20%A；3.5～3.6 min，20%～95%A；3.6～6.5 min，95%A）；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧源（ESI）；正離子模式；離子源電壓（IS）：5500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；碰撞氣體（CAD）壓力9 psi；氣簾氣（CUR）壓力：25 psi；霧化氣（GS1,N2）壓力55 psi，輔助氣（GS2,N2）壓力55 psi。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）離子對(duì)，MTX、7-OH MTX和內(nèi)標(biāo)氨基蝶呤（IS）的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞能量（CE）、碰撞室出口電壓（CXP）等見表1。

表1 質(zhì)譜條件

2.3 對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液的配置

分別精密稱取MTX、7-OH MTX 對(duì)照品各5.0mg，分別置于10mL 量瓶中，用甲醇（含0.1N NaOH）溶解并定容至刻度，配制濃度均為500μg·mL-1儲(chǔ)備液，于冰箱-80 ℃避光保存。使用時(shí)以甲醇-水（50/50）進(jìn)一步稀釋成所需濃度的MTX 和7-OH MTX 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（濃度分別為MTX：20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10 000 ng·mL-1；7-OH MTX：200、500、1000、2000、5000、10 000、20 000、50 000、100 000 ng·mL-1）。

精密稱取氨基蝶呤對(duì)照品5.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制濃度為500 μg·mL-1儲(chǔ)備液，于冰箱-80 ℃避光保存。最后用甲醇稀釋至濃度為20 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.4 樣品處理

精密吸取血清40 μL，置1.5 mL EP 管中，再加入含氨基蝶呤的內(nèi)標(biāo)工作液（20 ng·mL-1）160 μL，渦旋混勻1 min，12 500 r·min-1離心10 min；取上清液至進(jìn)樣瓶，作LC-MS/MS 分析。

2.5 專屬性考察

在“2.1 和2.2”項(xiàng)檢測(cè)條件下，取空白人血清、空白人血清+MTX+7-OH MTX、骨肉瘤患者M(jìn)TX 化療后血清，分別按“2.4”項(xiàng)下方法處理樣品后，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，MTX、7-OH MTX 和內(nèi)標(biāo)IS 的色譜峰形良好，其保留時(shí)間分別為2.71、2.73 和2.68 min，而空白血清中未發(fā)現(xiàn)有內(nèi)源性物質(zhì)干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，表明該方法專屬性良好。見圖1。

圖1 血清中MTX、7-OH MTX 和IS 的MRM 色譜圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取空白血清90 μL，分別加入10 μL 不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，配制成含MTX 濃度為2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1及含7-OH MTX濃度為20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10 000 ng·mL-1系列血清標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，并按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣2 μL。經(jīng)LC-MS/MS 分析，以樣品峰面積與IS 峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，以血清樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，作線性回歸，經(jīng)“1/X2”權(quán)重得MTX 和7-OHMTX 的回歸方程；分別為：Y=0.0638X-0.0754（r=0.998 5），Y=0.005 3X+0.0452（r=0.998 4）。結(jié)果表明，MTX 及7-OH MTX 分別在2～1000 ng·mL-1及20～10000 ng·mL-1線性關(guān)系良好。

2.7 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別配制MTX 濃度為2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 濃度為20、40、800、8000 ng·mL-1的血清樣品。按“2.4”項(xiàng)下方法處理血清樣品，每個(gè)濃度日內(nèi)平行測(cè)定6 份，連續(xù)測(cè)定3 天，根據(jù)當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果見表2。

表2 血清中MTX 及7-OH MTX 濃度測(cè)定的精密度與準(zhǔn)確度（n=6）

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別配制MTX 濃度為80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 濃度為800、8000 ng·mL-1的血清質(zhì)控樣品。按“2.4”項(xiàng)下方法處理血清樣品，分別考察血清樣本室溫下放置8 h、4 ℃中放置24 h、反復(fù)凍融3 次和-20 ℃冷凍放置7 d 后MTX 和7-OH MTX 的穩(wěn)定性。每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份。結(jié)果表明，兩個(gè)濃度質(zhì)控樣品在4 種儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，結(jié)果見表3。

表3 血清中MTX 及7-OH MTX 濃度測(cè)定的穩(wěn)定性（n=5）

2.9 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

分別配制MTX 濃度為2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 濃度為20、40、800、8000 ng·mL-1的血清樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理血清樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份，進(jìn)樣獲得相應(yīng)峰面積A；另取空白血清，按“2.4”項(xiàng)下方法處理空白血清（其中，內(nèi)標(biāo)工作液換成純甲醇），再用提取的上清液分別配制MTX濃度為2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 濃度為20、40、800、8000 ng·mL-1的樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份，進(jìn)樣獲得相應(yīng)峰面積B；以流動(dòng)相分別配制MTX 濃度為2、4、80、800 ng·mL-1、7-OH MTX 濃度為20、40、800、8000 ng·mL-1的樣品。按“2.4”項(xiàng)下方法處理樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份，進(jìn)樣獲得相應(yīng)峰面積C。計(jì)算MTX、7-OH MTX 及IS 的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率，公式為：基質(zhì)效應(yīng)=（B/C）×100%；提取回收率=（A/B）×100%。結(jié)果見表4。

表4 血清中MTX、7-OH MTX 及IS 濃度測(cè)定的基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率（n=5）

2.10 臨床應(yīng)用

臨床骨肉瘤患者2 例，均為男性，年齡分別為17、19 歲，MTX 化療劑量分別為5.38、6.00 g·m-2。給藥后于不同時(shí)間點(diǎn)（～4 h、～8 h、～24 h、～48h、～72 h）測(cè)定血清中MTX 及7-OH MTX 的濃度，其中，第1、2、3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（～4 h、～8 h、～24 h）的血清，在按照“2.4”項(xiàng)下方法處理樣品前，分別用空白血清稀釋1000、200、10 倍。結(jié)果見表5、表6。

表5 骨肉瘤患者1 的血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果

表6 骨肉瘤患者2 的血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果

3 討論

MTX 是一種抗葉酸類抗腫瘤藥物，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地抑制細(xì)胞中二氫葉酸還原酶的活性，阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸，使得嘌呤、嘧啶核苷酸的合成受阻，從而抑制DNA 的生物合成，最終抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖。大劑量甲氨蝶呤（HD-MTX）聯(lián)合亞葉酸鈣（CF）解救是治療骨肉瘤重要方案之一。

MTX 細(xì)胞毒作用具有非特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)快速分裂的正常細(xì)胞（骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞等）也會(huì)造成一定的細(xì)胞毒作用，而大劑量使用甲氨蝶呤則意味著毒性加劇。臨床上常采用CF 進(jìn)行解救，但CF 解救HD-MTX 引起的不良反應(yīng)的同時(shí)也會(huì)拮抗MTX 的藥理作用，減弱MTX 對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用，從而影響治療效果；并且使MTX 藥代動(dòng)力學(xué)特征存在較大的個(gè)體差異。因此，HD-MTX化療后，需進(jìn)行MTX 血藥濃度監(jiān)測(cè)，適時(shí)、適量地給予CF 解救，在保證HD-MTX 治療效果的同時(shí)，還能防止嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生。有研究表明，MTX體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物7-OH MTX 的血藥濃度與MTX給藥后的不良反應(yīng)（腎毒性、肝毒性等）相關(guān)。因此，本研究選擇同時(shí)測(cè)定MTX 和7-OH MTX 的血藥濃度，為實(shí)行個(gè)體化用藥提供科學(xué)的指導(dǎo)依據(jù)。

目前，臨床常用的治療藥物監(jiān)測(cè)方法有化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）[5]和高效液相色譜法（HPLC）[6，7]。CLIA 法雖然操作相對(duì)簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高；但其配套的試劑盒成本較高，且易受代謝產(chǎn)物的干擾和發(fā)生交叉反應(yīng)，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。HPLC 法雖然靈敏度高、選擇性較好；但存在樣品前處理復(fù)雜、分析時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，難以滿足臨床時(shí)效性和大樣本的快速檢測(cè)。相比而言，LC-MS/MS 法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、檢測(cè)限低等優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，骨肉瘤患者經(jīng)HD-MTX 化療后，進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥是很有必要的。本研究建立了一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度好的LC-MS/MS 檢測(cè)方法，用于同時(shí)監(jiān)測(cè)MTX及其代謝產(chǎn)物7-OH MTX 的血藥濃度，對(duì)臨床實(shí)施個(gè)體化HD-MTX 聯(lián)合CF 治療方案、保障治療效果及用藥安全具有指導(dǎo)意義。