王穎，曾含清，肖軼雯，原海燕，劉文輝，羅芝英*，王峰*（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 410011；2.中南大學(xué)臨床藥理研究所，長沙 410011；.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 410015）

氟康唑是新一代三唑類抗真菌藥物，作為新生兒預(yù)防和治療侵襲性真菌感染的一線用藥，在臨床廣泛使用。但是最近有文獻(xiàn)報道，常規(guī)給藥方案會增加真菌定植的風(fēng)險，并且可能導(dǎo)致新生兒重癥監(jiān)護(hù)室（neonatal intensive care unit，NICU）真菌感染率和耐藥率上升[1-4]；因此對新生兒氟康唑進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測（TDM），可以幫助臨床判斷預(yù)防用藥時體內(nèi)濃度及其濃度變化模型，評估氟康唑臨床療效，降低病房真菌感染率和耐藥率。

新生兒與兒童、成人相比，體表面積更大、皮下脂肪組織更薄、血容量更少[5-6]，考慮到患兒血常規(guī)、肝腎功能、感染指標(biāo)測評等需要一定血樣量，因此能供血藥濃度監(jiān)測的血樣量很少；另外臨床主要采用平臥位采血，患兒血容量多集中于軀干及內(nèi)臟，足末梢的血循環(huán)相對較差，以致需要反復(fù)擠壓或者多次穿刺獲得血標(biāo)本，這樣不僅采血量不足，還增加了感染的風(fēng)險[6-7]。因此建立微量血液的測定方法十分必要。

血藥濃度測定屬于臨床檢驗范疇，評估及時性的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)為“檢驗結(jié)果回報時間”（turnaround time，TAT）。由于早產(chǎn)兒身體器官發(fā)育尚未完善，在腸內(nèi)營養(yǎng)支持治療條件下體重容易快速變化，從而導(dǎo)致藥物動力學(xué)的變化；另外早產(chǎn)兒出生后會長時間住在 NICU，呼吸系統(tǒng)疾病、感染等病情隱匿性強(qiáng)且變化快，而一般血藥濃度檢測時間為3 h，因此快速的血藥濃度報告對于縮短判斷周期，即時調(diào)整用藥方案十分重要。

近年來，全自動二維高效液相色譜法（automatic 2-dimensional high performance liquid chromatography，2D-HPLC）逐漸應(yīng)用到血藥濃度監(jiān)測[8-10]，本研究旨在研究氟康唑2D-HPLC 的各種條件，建立高靈敏度方法，降低血液樣品體積需求，提高自動化，為早產(chǎn)兒氟康唑個體化用藥提供適宜的監(jiān)測技術(shù)，為臨床醫(yī)師用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2D-LC-UV 系統(tǒng)由FLC 全自動二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）及島津LC-20A 液相色譜部件構(gòu)成，F(xiàn)LC 連接第一維色譜泵、第二維色譜泵、檢測器、自動進(jìn)樣器等色譜模塊；其中第一維色譜系統(tǒng)（LC1）完成樣品富集及一維分離，第二維色譜系統(tǒng)（LC2）完成進(jìn)一步分離檢測，兩維系統(tǒng)通過智能流路控制系統(tǒng)（TRS）連接，采用“中心切割”模式轉(zhuǎn)移目標(biāo)物，中間轉(zhuǎn)移柱同時承擔(dān)轉(zhuǎn)移、攔截雜質(zhì)的功能，工作站為Lab Solution 工作站，具體結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。GH-202 電子分析天平（AND，日本）；XW-80A 漩渦震蕩儀（上海琪特）。

圖1 全自動二維液相色譜工作原理示意圖Fig 1 Schematic diagram for automatic 2D-HPLC

1.2 試藥

氟康唑?qū)φ掌罚ㄅ枺?00314-201204，含量：99.8%，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，ACS）；磷酸、磷酸銨、三氟乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純凈水為純水儀所制（不低于GB17323 執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)）。

2 方法

2.1 色譜條件

第一維色譜柱采用Aston SNX1（氰基柱，3.5 mm×50 mm，5 μm，ANAX），流動相：V甲醇∶V水＝64∶36，流速0.8 mL·min－1。第二維色譜柱采用Aston SBN（苯基柱，4.6 mm×250 mm，5 μm，ANAX），流動相：V水∶V甲醇∶V乙腈＝54∶38∶8，流速1.0 mL·min－1；中間柱采用Aston SH4（苯基柱，4.6 mm×10 mm，3.5 μm，ANAX），輔助流動相為純水，檢測波長為209 nm，進(jìn)樣體積為200 μL。檢測流程如表1所示。

表1 二維液相色譜條件設(shè)置-時間程序Tab 1 Time program for conditions in 2D-HPLC

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取氟康唑?qū)φ掌?6.02 mg，用純水溶解后，定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為1320.36 μg·mL－1的氟康唑?qū)φ掌穬湟?。精密吸取不同量氟康唑?qū)φ掌穬湟海尤?0 mL 量瓶中，用空白血漿定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為54.08、135.20、338.01、845.03、2640.71、5281.42 ng·mL－1的系列線性溶液，保存在－20℃待用。

2.2.2 質(zhì)控樣品配制 精密吸取“2.2.1”項下氟康唑?qū)φ掌穬湟哼m量，加入到10 mL 量瓶中，用空白血漿定容至刻度，配制成高、中、低3 種質(zhì)量濃度（4225.13、2112.57、211.26 ng·mL－1），取3 mL 分裝到質(zhì)控瓶中，保存在－20℃冰箱中。

2.3 血漿樣品處理

準(zhǔn)確吸取10%三氟乙酸去蛋白劑 600 μL 至1.5 mL EP 管中，再準(zhǔn)確加入 200 μL 血漿樣本，渦旋振蕩1 min 后，高速離心（14 500 r·min－1）8 min，取650 μL 上層清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，加入1 mol·L－1的碳酸銨水溶液65 μL 調(diào)節(jié)pH 值，渦旋混勻。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗

取空白血漿（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院提供）、患者血漿樣品處理溶液及氟康唑?qū)φ掌啡芤喊础?.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。氟康唑保留時間為11.7 min，目標(biāo)物從第一維轉(zhuǎn)移到第二維色譜系統(tǒng)，需要約3 min 的樣品處理時間。氟康唑與雜質(zhì)分離較好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)均不干擾樣品的分離測定。大多數(shù)樣品中均發(fā)現(xiàn)存在與氟康唑較為接近的色譜峰（見圖2C），是否為代謝物有待繼續(xù)研究。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Fig 2 System suitability chromatogram

3.2 線性范圍和定量限

取“2.2.1”項下系列線性溶液，按“2.1”項下方法檢測。以氟康唑的峰面積（Y）對氟康唑質(zhì)量濃度（X，ng·mL－1）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y＝498.5X－3297.3，r＝0.9999，氟康唑在54.08～5281.42 ng·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系，定量限為54.08 ng·mL－1，能夠滿足臨床新生兒氟康唑血藥濃度檢測要求。

3.3 準(zhǔn)確度和精密度

取“2.2.2”項下質(zhì)控樣品進(jìn)行方法學(xué)準(zhǔn)確度和精密度檢測。每個濃度梯度設(shè)置5 個平行組，計算實際濃度，比較實際濃度與理論濃度得出方法回收率和變異系數(shù)，檢驗方法準(zhǔn)確度和日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d 用相同方法配制并測定質(zhì)控樣品，考察檢測方法日間精密度。建立的氟康唑分析的方法回收率在93.6%～102.7%，RSD＜4.7%，日內(nèi)、日間變異系數(shù)均小于5%。表明本法符合臨床血藥濃度監(jiān)測檢測的方法學(xué)要求。

3.4 提取回收率

取質(zhì)量濃度為10 μg·mL－1的氟康唑?qū)φ掌啡芤海ㄅR用新配），用流動相稀釋10 倍后作為對照，用空白血漿稀釋10 倍，用同樣的前處理方式沉淀樣品，計算提取回收率。結(jié)果提取回收率為100.6%，RSD為4.6%（n＝6），證明本法的提取回收率高且穩(wěn)定。

3.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下的質(zhì)控樣品，分別于室溫放置24 h、反復(fù)凍融 3 次以及－20℃冰凍保存30 d 后測定樣品濃度，結(jié)果RSD均小于5%，表明血漿中氟康唑穩(wěn)定性良好。

3.6 臨床應(yīng)用

2018年1月—2019年1月，本 院NICU 對40 名住院患兒預(yù)防性地給予口服氟康唑3 mg/（kg·次），每3日給藥一次，直至治愈出院。根據(jù)氟康唑藥代動力學(xué)特征，患兒在第3 次給藥時達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，于第3 次給藥后，對所有患兒通過足底毛細(xì)血管采樣，共收集120 個血液樣本，2 mL 抗凝管全血采集后經(jīng) 3000 r·min－1離心 10 min，取上清液，－70℃凍存待檢。凍存樣本化凍后，按“2.3”項下方法處理樣品后，按“2.1”項下方法測定，每位患者測3 個血清樣本，隨行測定高、中、低質(zhì)控樣品。平均采樣量為（647±12.3）μL。其中81 個樣本血藥濃度介于200～2000 ng·mL－1，占總樣本量的67%；28個樣本結(jié)果介于2000～4000 ng·mL－1，占總樣本量的23%；11 個樣本結(jié)果高于4000 ng·mL－1，占總樣本量的10%。

4 討論

4.1 光譜圖

氟康唑的3D 光譜圖顯示（見圖3），氟康唑在206 nm 及261 nm 有最大吸收波長，261 nm 吸收強(qiáng)度遠(yuǎn)小于206 nm。209 nm 雖然不是最大吸收波長，但可以明顯減小色譜圖基線的波動，考慮到209 nm 與206 nm 相差并不大，因此選擇209 nm 波長作為檢測波長。由于氟康唑在波長222 nm 處吸收出現(xiàn)下降，引起色譜圖基線較大的波動，所以應(yīng)當(dāng)使用參比較正，但使用參比校正時發(fā)現(xiàn)209 nm 波長差減222 nm 波長強(qiáng)度，雖然改善色譜圖基線狀態(tài)，但并未有效改善色譜圖基線狀態(tài)，因此未采用此技術(shù)。

圖3 氟康唑3D 圖Fig 3 3D stereogram of fluconazole

4.2 樣品在線處理能力

本研究應(yīng)用的全自動二維液相色譜系統(tǒng)，通過在線萃取提高測定靈敏度，但一維色譜柱通常載樣量具有一定上限，因此進(jìn)樣量過大的時候，會發(fā)生柱上擴(kuò)散現(xiàn)象。本文提出“進(jìn)樣量線性區(qū)間（linear injection volume，LIV）”表達(dá)二維系統(tǒng)在線萃取的能力，進(jìn)樣量增加至200 μL 時，峰面積增加開始不成線性，400 μL 與500 μL 二維系統(tǒng)產(chǎn)生的峰面積并沒有太大差別，因此本方法設(shè)定進(jìn)樣量為200 μL，與普通色譜20 μL 比較，靈敏度可以提高10 倍。

4.3 長光程樣品池與靈敏度

本系統(tǒng)應(yīng)用近年出現(xiàn)的長光程紫外樣品池提高檢測靈敏度，與普通樣品池比較，紫外線通過全息反射到達(dá)傳感器端，光程長達(dá)85 mm，而普通樣品池僅有10 mm 光程，根據(jù)朗伯比爾定律，光程越長靈敏度更高。但為了不增加樣品池體積，長光程管道體積很小，容易發(fā)生堵塞，因此使用時需要特別注意，每次用完后清洗色譜柱和替換流動相中間的鹽。

圖4顯示空白血樣添加10 μg·mL－1氟康唑的兩種樣品池檢測色譜圖，長光程樣品池獲得峰面積約為標(biāo)準(zhǔn)樣品池的6.5 倍，很大程度地提高了樣品的測定能力。

圖4 長光程樣品池與標(biāo)準(zhǔn)樣品池的靈敏度Fig 4 Sensitivity of long path sample cells and standard sample cells

氟康唑血藥濃度測定受到基質(zhì)效應(yīng)、多電荷現(xiàn)象與源內(nèi)裂解的限制[11-12]，內(nèi)標(biāo)修正上述技術(shù)缺陷，難以做到不同處理批使用同一校準(zhǔn)曲線計算樣品結(jié)果，尤其當(dāng)不同條件測定方法交替、批數(shù)量過多、離子源劣化時，需要重新處理校準(zhǔn)曲線，這樣不僅需要更多的維護(hù)，也不具備足夠的穩(wěn)健性達(dá)到及時性要求；與HPLC 比較，紫外檢測氟康唑靈敏度較低，需要復(fù)雜且耗時的前處理過程[13]。本方法開發(fā)的在線萃取、二維分離、長光程紫外檢測以及光譜差減技術(shù)具有樣品處理簡單、分離過程自動以及檢測穩(wěn)定的特征，可達(dá)到早產(chǎn)兒血藥濃度監(jiān)測血樣量需求小、報告及時的技術(shù)要求。

本研究分析并控制每個過程產(chǎn)生的時間消耗，通常早產(chǎn)兒足跟采血比成人靜脈采血時間長，但也很少超過5 min；臨床樣品送達(dá)實驗室時間與每個單位具體路線和程序有關(guān)，本院通常時間小于30 min；關(guān)鍵的時間消耗在實驗室測定過程中產(chǎn)生，本研究采用新型2D-HPLC，利用穩(wěn)定的光學(xué)檢測系統(tǒng)，樣品濃縮與分離自動完成，并標(biāo)定了二維方法的轉(zhuǎn)移特征，因此受環(huán)境溫度變化、試劑純度變化、樣品復(fù)雜度變化影響小。本方法工作曲線可以長期使用，同時無需內(nèi)標(biāo)相關(guān)操作及每批定標(biāo)操作，節(jié)省大量時間，可以在30 min 完成從測定系統(tǒng)啟動到結(jié)果生成的過程。

目前，新生兒基于PK/PD 數(shù)據(jù)預(yù)防性使用氟康唑的經(jīng)驗十分有限。研究認(rèn)為，氟康唑的穩(wěn)態(tài)血藥濃度應(yīng)維持在2 mg·L－1以上，才能達(dá)到AUC/MIC為50 的臨床預(yù)防效果[3]。筆者分析發(fā)現(xiàn)新生兒使用3 mg·kg－1，每周兩次的給藥方案后，僅33%的患兒氟康唑血藥濃度在2 mg·L－1以上，結(jié)果提示氟康唑整體用藥劑量不足，達(dá)到有效治療濃度者不足1/3。因此，臨床醫(yī)師應(yīng)可根據(jù)治療藥物監(jiān)測結(jié)果，更密切地參與氟康唑臨床用藥，減少常規(guī)的經(jīng)驗用藥和間接判斷所致的不合理用藥，減少不良反應(yīng)，輔助精準(zhǔn)醫(yī)療，降低住院費(fèi)用，提升社會經(jīng)濟(jì)效益。