葉敏玲，黎智瑩，陳梓樺，盧少芳

廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院 (廣東順德 528300)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、病死率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。國家癌癥中心公布的最新數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌的相關(guān)死亡病例占全部惡性腫瘤死亡病例的8.01%[2]。有研究表明，結(jié)直腸癌的早期篩查和治療可以顯著改善預(yù)后，降低病死率[3]。人類糞便SDC2基因甲基化檢測作為一種非侵入性的新型方法，被應(yīng)用于早期腸癌篩查中。本研究參照中國合格評定國家認(rèn)可委員會(huì)(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)制定的CNAS-GL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》[4]要求，對廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司的人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒(熒光PCR法)進(jìn)行性能評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

本次性能驗(yàn)證采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。試劑購自廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司的人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒(熒光PCR法)。檢測試劑盒配套陰、陽性質(zhì)控品，其中，陰性質(zhì)控品為Caco2細(xì)胞DNA，陽性質(zhì)控品為Hct116細(xì)胞DNA，內(nèi)控基因?yàn)锳CTB基因，在每次實(shí)驗(yàn)中均需要同時(shí)檢測。靈敏度參考品L和精密度參考品J主要成分為Caco2細(xì)胞DNA和Hct116細(xì)胞DNA。

1.2 研究對象

收集2020年10月至2021年3月廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院的門診或住院患者糞便樣本41例，以及由廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司提供的結(jié)直腸癌患者糞便樣本5例，共46例。其中結(jié)直腸癌患者樣本10例，結(jié)直腸腺瘤患者樣本11例，結(jié)直腸炎患者樣本7例，正常對照樣本(經(jīng)腸鏡檢查未發(fā)現(xiàn)腸道疾病的患者所留取的糞便)18例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有納入患者均經(jīng)腸鏡和/或病理確診；未接受腸癌手術(shù)或放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤。

1.3 方法

按照試劑盒說明書操作，以甲基化SDC2基因的Ct值≤38為陽性判定值，以甲基化SDC2基因的Ct值>38為陰性判定值，內(nèi)控基因ACTB的Ct值≤36為樣本合格。

1.4 評價(jià)指標(biāo)

(1)方法符合率。(2)檢出限：重復(fù)檢測SDC2靈敏度參考品L共5次，5次SDC2基因甲基化擴(kuò)增曲線正常且為陽性，同時(shí)內(nèi)控基因ACTB擴(kuò)增曲線正常且Ct值合格。(3)精密度：重復(fù)檢測精密度參考品J，連續(xù)檢測2天，每天做10個(gè)平行測試，共20次檢測，分別計(jì)算參考品甲基化SDC2基因和內(nèi)控基因ACTB的Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差SD、變異系數(shù)CV值。(4)陽性率、靈敏度、特異度和約登指數(shù)：檢測所有樣本，計(jì)算陽性率、靈敏度、特異度和約登指數(shù)，陽性率=真陽性例數(shù)/腸鏡病理陽性例數(shù)，靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1。

2 結(jié)果

2.1 方法符合率

根據(jù)試劑盒陰、陽性判斷值，試劑盒檢測結(jié)直腸癌患者樣本的陰性符合率均為88.89%(16/18)，陽性符合率分別為100.00%(10/10)，總符合率分別為92.86%(26/28)，見表1。

表1 糞便SDC2基因甲基化與腸鏡和/或病理的符合率(例)

2.2 檢出限

檢測SDC2靈敏度參考品L共5次(L1-L5)，5次結(jié)果均為陽性，檢出率100%，見表2。

表2 糞便SDC2基因甲基化的靈敏度參考品L檢測結(jié)果

2.3 精密度

試劑盒的批內(nèi)、批間精密度符合要求，符合檢測Ct值的變異系數(shù)(CV)≤5%，見表3。

表3 批內(nèi)與批間精密度檢測結(jié)果

2.4 SDC2基因甲基化診斷結(jié)直腸癌的陽性率、靈敏度、特異度和約登指數(shù)

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，SDC2基因甲基化在結(jié)直腸癌患者、結(jié)直腸腺瘤患者、腸炎患者和正常對照糞便中的陽性率分別為100.00%(10/10)、63.64%(7/11)、42.86%(3/7)和11.11%(2/18)；試劑盒檢測結(jié)直腸癌的靈敏度為100.00%(10/10)，特異度為66.67%(24/36)，約登指數(shù)為0.667，見表4。

表4 糞便SDC2基因甲基化與腸鏡和/或病理的檢測結(jié)果(例)

3 討論

結(jié)直腸癌是威脅我國人民生命健康的主要癌癥，有關(guān)研究表明，早期篩查與治療對降低其病死率至關(guān)重要[5-6]。結(jié)腸鏡雖然是篩查結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要煩瑣而耗時(shí)的腸道準(zhǔn)備，且作為侵入性檢查手段有出血和穿孔的風(fēng)險(xiǎn)，被篩查人群的參與率低[7]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是由基因或表觀遺傳不穩(wěn)定性所致，其中表觀遺傳不穩(wěn)定性以DNA甲基化或去甲基化為主[8]。有研究表明，糞便中的DNA異常甲基化常發(fā)生在結(jié)直腸腫瘤的早期，對檢測結(jié)直腸癌具有較高的準(zhǔn)確率[9]。以結(jié)直腸癌高危人群的糞便樣品中人類SDC2基因?yàn)槟繕?biāo)基因，檢測其甲基化表達(dá)水平是一種具有無創(chuàng)、便捷、可居家采樣等優(yōu)點(diǎn)的腸癌篩查新方法[10]。

本研究對人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒的方法符合率、檢出限、精密度等參數(shù)進(jìn)行了分析評價(jià)，其中總符合率為92.86%，檢出限檢出率為100%，批內(nèi)精密度和批間精密度均符合要求。在結(jié)直腸癌患者的糞便中，SDC2基因甲基化的陽性率為100.00%，靈敏度為100.00%，特異度為66.67%，約登指數(shù)為0.667，有較高的診斷效率。結(jié)直腸癌的主要癌前疾病為結(jié)直腸腺瘤(占全部結(jié)直腸癌癌前疾病的85%～90%，甚至更高)和潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性腸病[11]，本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸腺瘤和腸炎患者樣本的SDC2基因甲基化陽性率分別為63.64%和42.86%，應(yīng)該引起重視，建議患者進(jìn)行早期干預(yù)或定期做腸鏡檢查。

綜上所述，人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒對結(jié)直腸癌有較高的檢測性能和輔助診斷價(jià)值，具有采樣方便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于篩查結(jié)直腸癌和癌前病變，為醫(yī)師提供輔助診斷依據(jù)，為患者提供一種無創(chuàng)性結(jié)直腸癌的輔助診斷方法。