李昕芫，婁金秀，劉清源，胡健，張英俊

中國東北和華北地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌遺傳多樣性研究

李昕芫，婁金秀，劉清源，胡健，張英俊

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，南京 210095

【】紫花苜蓿（L.）被譽(yù)為牧草之王，近年來，中國東北和華北地區(qū)種植面積不斷擴(kuò)大，但紫花苜蓿質(zhì)量與產(chǎn)量仍不足以滿足中國畜牧業(yè)發(fā)展的需求。本研究旨在分析中國東北和華北地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌遺傳多樣性，為紫花苜蓿高效固氮根瘤菌的篩選與應(yīng)用提供參考。采用表面消毒和平板劃線法從根瘤中分離純化根瘤菌單菌落；使用BOX-PCR方法對供試菌株進(jìn)行基因型劃分；選取代表菌株進(jìn)行持家基因（、和）和共生基因（和）的系統(tǒng)發(fā)育分析。從中國東北和華北19個采樣地共分離純化了499株根瘤菌，BOX-PCR可將供試菌株分為37種BOX型，BOX型存在顯著的地理分布現(xiàn)象，同時寄主品種對根瘤菌基因型具有一定的選擇作用。97.60%（487/499）的根瘤菌為。其余12株分別為、、、、、sp.和sp.，這12株根瘤菌僅在中國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)，華北地區(qū)根瘤菌均為。3個持家基因在紫花苜蓿根瘤菌種間系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致，但其揭示優(yōu)勢種的種內(nèi)多樣性存在差異。共生基因系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，在根瘤菌屬間和屬內(nèi)發(fā)生了共生基因的水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。在種內(nèi)顯示出比更豐富多樣性。中國東北和華北地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌具有較豐富的遺傳多樣性，且根瘤菌存在顯著的地理分布特征和寄主選擇現(xiàn)象。

紫花苜蓿；根瘤菌；遺傳多樣性；系統(tǒng)發(fā)育；水平轉(zhuǎn)移

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（L.）產(chǎn)量高，適口性好，常作刈割草地，為家畜提供青貯和干草資源，也可與禾本科草混播作放牧利用，被稱為牧草之王[1]，近年來，中國紫花苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大，但仍不足以滿足中國畜牧業(yè)發(fā)展的需求，如何提高紫花苜蓿產(chǎn)量與質(zhì)量，是當(dāng)前亟待解決的問題[2]。根瘤菌劑的應(yīng)用被作為提高豆科植物產(chǎn)量及質(zhì)量的有效手段[3-4]，據(jù)統(tǒng)計，全世界有70多個國家在種植豆科植物時使用根瘤菌劑，尤其在美國、巴西等西方國家，根瘤菌接種率更是高達(dá)70%左右[5]。而中國由于根瘤菌研究起步較晚，菌劑質(zhì)量、應(yīng)用范圍及應(yīng)用效果等問題未能很好地解決。中國豆科作物的根瘤菌接種面積尚不足其播種面積的3%，豆科牧草接種面積更少[5]。紫花苜蓿根瘤菌遺傳多樣性的研究對根瘤菌劑的篩選和應(yīng)用具有重要的參考意義[6-7]。【前人研究進(jìn)展】目前，苜蓿根瘤菌多樣性的研究主要集中在中國西部地區(qū)[6-11]，張榮娟[6]對中國西部苜蓿根瘤菌進(jìn)行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)中國西部根瘤菌主要有和，其中是中國西部苜蓿根瘤菌的主要種群，另外少數(shù)則出現(xiàn)在西南部偏酸性的土壤中；KANG等[7]通過對甘肅紫花苜蓿根瘤菌多樣性分析，發(fā)現(xiàn)主要有、sp.、和；同樣，張小甫[8]研究發(fā)現(xiàn)甘肅地區(qū)紫花苜蓿上還有另外一些根瘤菌，如和sp.?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，隨著紫花苜蓿種植范圍的擴(kuò)大，中國東北和華北地區(qū)也成為了紫花苜蓿種植的重要地區(qū)，而關(guān)于這些地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌多樣性的研究則鮮有開展。不同地區(qū)紫花苜蓿品種及其種植的環(huán)境不盡相同，其根瘤菌遺傳多樣性可能存在差別[12-13]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究于2015—2017年重點(diǎn)采集了中國東北及華北19個地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌499株，采用BOX-PCR指紋圖譜對紫花苜蓿根瘤菌多樣性進(jìn)行分析，進(jìn)一步選用3個持家基因（、和）和2個共生基因（和）對各BOX型代表菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以期了解中國東北和華北地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌的遺傳多樣性，為紫花苜蓿根瘤菌優(yōu)質(zhì)菌種資源的篩選及應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

試驗選擇種植成片的紫花苜蓿地進(jìn)行樣品采集，東北地區(qū)種植的紫花苜蓿品種主要有公農(nóng)5號、東苜1號、公農(nóng)1號、龍牧803、龍牧806、WL319和敖漢等，華北地區(qū)種植的主要有三得利、M343、M354、勁能5010、中苜1號、中苜3號、甘農(nóng)3號和WL363等（表1）。部分采樣地在相鄰地塊種植了不同的紫花苜蓿品種，如新鄉(xiāng)、滄州、膠州、衡水和遼陽等，本文分別進(jìn)行了樣品的采集（表1）。采樣地紫花苜蓿種植年限普遍在2—5年。采樣地除五河外，均未有根瘤菌接種的情況。樣品采集選擇在5—6月進(jìn)行，一般在紫花苜蓿初花期左右時間，此時根瘤菌活性一般較好，易獲得促生效果好的菌種。

使用鐵鍬將健康的紫花苜蓿植株和根一起挖出，輕抖去根系上的土壤，將根瘤連根一起剪下，置于含有藍(lán)色變色硅膠粒及濾紙片的50 mL離心管中。每個采樣點(diǎn)隨機(jī)選擇5—10株長勢相似的紫花苜蓿進(jìn)行取樣，每個植株至少保持>10 m的距離，隨機(jī)從每個植株根部不同部位采集10—15個根瘤，以滿足采集樣品的代表性。當(dāng)大部分藍(lán)色硅膠粒變色時，需要及時更換，以保持離心管處于干燥狀態(tài)。

1.2 根瘤菌的分離純化、保存

取出干燥的根瘤樣品，用滅菌蒸餾水沖洗其表面后，使用無菌生理鹽水，4℃浸泡1—2 h，至根瘤吸水恢復(fù)原狀，用于根瘤菌的分離，每個根瘤最多分離保存1株根瘤菌。使用Wang等[13]方法進(jìn)行根瘤的表面消毒和破碎、根瘤菌的分離和純化，并稍作改動。使用酵母甘露醇瓊脂培養(yǎng)基（yeast mannitol agar，YMA）平板進(jìn)行根瘤菌的分離和純化[8]。將具有根瘤菌形態(tài)特征的細(xì)菌一份短期保存于YMA斜面培養(yǎng)基上[8]，置于4℃?zhèn)溆?，另一份使? mL凍存管，裝有0.8 mL胰蛋白酵母（tryptone yeast，TY）液體培養(yǎng)基[9]，將菌液搖培至生長對數(shù)期，加入等體積的50%甘油，置于-80℃長期保存。

1.3 根瘤菌DNA的提取

將1 mL滅菌TY液體培養(yǎng)基加入2 mL滅菌離心管中，使用接種環(huán)挑取YMA平板上的根瘤菌單菌落接入TY培養(yǎng)基，將離心管置于28℃恒溫?fù)u床上以180 r/min的轉(zhuǎn)速搖培2—4 d。待培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，使用離心機(jī)以13 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集菌體。收集的菌體按照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）說明書進(jìn)行根瘤菌基因組DNA的提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BOX-PCR指紋圖譜分析

以根瘤菌基因組DNA為模板，使用BOX-PCR引物（BOXAIR：5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGA CG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增[14]。25 μL BOX-PCR反應(yīng)體系為12.5 μL Master Mix（TaKaRa）、1 μL BOX A1R（10 μmol·L-1）、0.2 μL BSA（10 mg·ml-1）、2.5 μL DMSO、1 μL DNA和7.8 μL ddH2O。BOX-PCR反應(yīng)程序為95℃ 7 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，65℃ 8 min，30個循環(huán)；65℃ 22 min。用1.8%的瓊脂糖凝膠檢測，60 V電壓電泳3 h，對BOX-PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。使用凝膠成像儀將電泳結(jié)果進(jìn)行拍照保存，分析BOX-PCR指紋圖譜并對根瘤菌進(jìn)行BOX型劃分。

1.5 持家基因和共生基因PCR擴(kuò)增

選取每種BOX型的代表菌株，用于持家基因（、和）及共生基因（和）的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物信息和PCR反應(yīng)程序參考已有文獻(xiàn)報道[7, 15-18]。所有基因PCR反應(yīng)體系均為30 μL：15 μL Master Mix（TaKaRa）、正向和反向引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL、1 μL模板DNA和13 μL ddH2O。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行100 V凝膠電泳20 min，成功擴(kuò)增出目的片段且條帶清晰的送至上海生工有限公司測序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

將代表菌株各基因測序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，其中基因序列號為MZ165036—MZ165071，基因序列號為MZ165072—MZ165105，基因序列號為MZ165106—MZ165138，基因序列號為MZ165139—MZ165170，基因序列號為MZ165171—MZ165202。同時在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列同源性比對（BLAST search）,下載數(shù)據(jù)庫中相似性高的基因序列及信息作為參照，使用MEGA7.0軟件的Clustal W進(jìn)行序列比對[6]，并采用Kimura 2- parameter模型，bootstrap值為1 000，構(gòu)建Neighbour- Joining系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。

2 結(jié)果

2.1 BOX-PCR指紋圖譜

2015—2017年采集了中國19個地區(qū)紫花苜蓿根瘤樣品（表1），共分離出499株根瘤菌，按區(qū)域可將所有采樣地區(qū)劃分為兩大區(qū)（東北和華北）（表1），對所有菌株進(jìn)行BOX-PCR擴(kuò)增并對指紋圖譜進(jìn)行分析，可將供試的499株根瘤菌分為37種BOX型（表2），中國東北和華北地區(qū)共有的BOX型15個，東北地區(qū)特有的BOX型16個，其中，除BOX13菌株數(shù)為15個外，其余東北地區(qū)特有的BOX型菌株數(shù)量均不超過3個。華北地區(qū)特有的BOX型6個，其中BOX24和BOX33的菌株數(shù)為8和19個，其余華北地區(qū)特有的BOX型菌株數(shù)均不超過2個。在15個共有的BOX型中，菌株數(shù)占比在7%以上的有BOX1（7.62%）、BOX7（18.64%）、BOX19（7.20%）、BOX22（11.62%）和BOX23（28.26%）。這5個BOX型中，BOX1（36/38）和BOX22（53/58）主要分布在東北地區(qū)，BOX7（72/93）、BOX19（31/35）和BOX23（132/141）主要分布在華北地區(qū)。所有菌株BOX型分布信息如表2所示。

2.2 紫花苜蓿根瘤菌鑒定

選取37種BOX型的代表菌株，進(jìn)行持家基因的擴(kuò)增、測序和比對分析（BOX3使用進(jìn)行序列比對），以鑒定各BOX型的根瘤菌種類，結(jié)果顯示，大部分BOX型（28種）菌株為，有9種BOX型為sp.（相似度91.34%，BOX3）、（100%，BOX6和BOX11）、（100%，BOX16）、（99.67%，BOX21和BOX31）、（98.01%，BOX30）、（99.33%，BOX36）、（92.72%，BOX32）（表2）。所有這9種BOX型均來自中國的東北：白城（4種BOX型）、通榆（1種BOX型）和沈陽（4種BOX型），BOX3和BOX32可能為尚未明確分類地位的新種（表2）。

2.3 根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育分析

持家基因、和的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果具有類似的特征，3個持家基因揭示根瘤菌種間多樣性的結(jié)果一致，但揭示種內(nèi)多樣性的結(jié)果存在差異（圖1）。持家基因均可將BOX16與聚在一起（100%相似度）；BOX21和BOX31與聚在一起，但和聚類顯示其與GenBank數(shù)據(jù)庫中的形成明顯的分支；BOX30與聚為一類，但與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考序列形成明顯的分支（EU120727、DQ310809和KF206971），BOX6和BOX11可與聚在一起，但將它們聚為2個分支；BOX36與聚在一起，但和將二者聚為2個分支。3個持家基因可將所有為的BOX型與顯著的分開（圖1）。在揭示種內(nèi)多樣性方面，3個持家基因均可將分為4個分支（圖1），但分支內(nèi)BOX型存在差別，僅BOX24在3個持家基因中均為單獨(dú)分支。可將BOX18、BOX26和BOX27聚在一起，和則只能將BOX18和BOX27聚在一起。將其余代表菌株分類2個分支，但和則無法有效將其分開（圖1）。

共生基因和在BOX3、BOX21、BOX32和BOX36中不能有效的擴(kuò)增出來，對其他BOX型代表菌株的和進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，二者揭示相同的特征。BOX16的和型與屬聚在一起，其余BOX型代表菌株的和均與的聚在一起（圖2）。BOX6（，100%）、BOX30（，98.01%）和BOX31（，99.67%）與分屬不同的屬和種，但和都聚在一起。在種內(nèi)顯示出比豐富的多樣性（圖2）。

表1 本文供試的紫花苜蓿根瘤菌菌株信息

表2 紫花苜蓿根瘤菌BOX型種類及其分布

續(xù)表2 Continued table 2

a：BOX3選取進(jìn)行序列比對，其余BOX型選取進(jìn)行序列比對；b：采樣地后面括號里的數(shù)字代表菌株數(shù)，采樣地后面無數(shù)字則代表只有1株菌株。NE：東北；N：華北

a:BOX3 was aligned withgene, the rest BOX types were aligned withgene;b: The number in the bracket after sampling site represented the number of strains, sampling site with no number represented only one strain in this sampling site. NE: Northeast; N: North

2.4 紫花苜蓿品種對根瘤菌基因型的影響

對部分采樣地相鄰地塊不同紫花苜蓿品種共生的根瘤菌基因型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，新鄉(xiāng)地區(qū)，品種M343的根瘤菌中，BOX23占據(jù)優(yōu)勢（占比62.12%，23/37），而品種M354中，BOX7則占優(yōu)勢（90%，19/21）；衡水地區(qū)，品種中苜1號的根瘤菌中，BOX7占優(yōu)勢（90.32%，28/31），品種WL363中，BOX23占優(yōu)勢（64.71%，11/17）；膠州地區(qū)，與品種三得利共生結(jié)瘤的優(yōu)勢根瘤菌基因型為BOX19（66.67%，8/12），與中苜3號結(jié)瘤的基因型主要為BOX23（66.67%，8/12）；滄州和遼陽地區(qū)，不同品種的根瘤菌占優(yōu)勢的基因型則相同，分別為BOX23和BOX1（表3）。

表3 栽培品種對紫花苜蓿根瘤菌基因型的影響

a：同一采樣地的紫花苜蓿不同品種種植在相鄰的地塊，其生境相似；b：BOX型后面括號里的數(shù)字代表菌株數(shù)，BOX型后面無數(shù)字則代表只有1株菌株

a: Cultivars from the same sampling site were planted adjacently, they had similar habitat type;b: The number in the bracket after BOX type represented the number of strains, BOX type with no number represented only one strain in this BOX type

圖2 共生基因nodC（A）和nifH（B）的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

BOX-PCR與16sRNA-RFLP、IGS-RFLP等方法常用作大樣本量根瘤菌的基因型初步鑒定，有研究顯示BOX-PCR方法在揭示根瘤菌基因型多樣性方面具有更好的效果[19]。Wang等[13]使用BOX-PCR可將青藏高原地區(qū)581株紫花苜蓿根瘤菌分為124種BOX型。本研究采用BOX-PCR方法將中國東北及華北地區(qū)499株紫花苜蓿根瘤菌分為37種BOX型。持家基因、和的系統(tǒng)發(fā)育分析也進(jìn)一步驗證了BOX-PCR在揭示根瘤菌基因型多樣性方面的能力（圖1）。

紫花苜蓿根瘤菌BOX型存在一定的地理分布現(xiàn)象，在所有37個BOX型中，為東北和華北特有的分別為14和6個。特有的BOX型占比一般都較少，僅華北特有的BOX33占比超過3.8%，表明特有BOX型雖然能在局部區(qū)域定植，但其在環(huán)境適應(yīng)方面存在一定的劣勢（表2）。BOX型占比前5的在中國東北和華北均廣泛分布，但優(yōu)勢的BOX型存在一定的地理偏好性，BOX23（占比28.26%）和BOX7（占比18.64%）主要分布在中國的華北地區(qū)，而BOX22（占比11.62%）則主要分布在東北地區(qū)（表2）。研究表明中國東北和華北地區(qū)的紫花苜蓿根瘤菌存在地理分化現(xiàn)象，這與張榮娟[6]對中國西部苜蓿根瘤菌的研究結(jié)果相似，且已有很多研究表明苜蓿根瘤菌存在著顯著的地理學(xué)分布[20-21]。本文也發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿不同品種對根瘤菌基因型選擇存在一定的寄主偏好性，在新鄉(xiāng)和衡水地區(qū)，這種現(xiàn)象尤為明顯（表3）。這與很多相關(guān)文獻(xiàn)報道植物品種對根際微生物具有選擇性相一致[22-23]，紫花苜蓿不同品種在種植的過程中，可能選擇了特定基因型的根瘤菌與其發(fā)生共生關(guān)系。因此，本研究結(jié)果表明，在篩選根瘤菌菌劑時，應(yīng)當(dāng)充分考慮地理和寄主品種的因素，選擇在特定區(qū)域與特定品種高效結(jié)瘤共生的優(yōu)勢基因型的根瘤菌，以提高其在田間競爭結(jié)瘤的能力。接下來可通過盆栽試驗，進(jìn)一步探究寄主和環(huán)境對根瘤菌基因型選擇的機(jī)制，以及優(yōu)勢BOX型的競爭能力是否是其廣泛分布的重要原因，同時可通過比較基因組分析并揭示根瘤菌優(yōu)勢基因型廣適應(yīng)性的分子機(jī)制[24]。

本研究對紫花苜蓿根瘤菌進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)中國東北和華北地區(qū)優(yōu)勢根瘤菌種仍然是，這與其他研究報道類似。張榮娟[6]對中國西部苜蓿根瘤菌多樣性分析顯示其主要也為，少數(shù)是，主要來自于西南亞熱帶氣候區(qū)呈酸性的土壤中，表明與苜蓿共生的根瘤菌中為優(yōu)勢菌種；在國外，Talebi等[25]對伊朗地區(qū)982紫花苜蓿根瘤菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)僅有7株為，其余均為；Silva等[26]發(fā)現(xiàn)墨西哥15個采樣點(diǎn)分離的176株苜蓿根瘤菌中僅有6株為。本研究的499株根瘤菌中未發(fā)現(xiàn)有，可能與采樣地的土壤理化特性有關(guān)。本文的采樣點(diǎn)基本上都屬于中性或偏堿的環(huán)境（未發(fā)表數(shù)據(jù)），而已有研究顯示傾向于偏酸的環(huán)境[6, 25-26]。研究也發(fā)現(xiàn)中國東北地區(qū)根瘤菌存在豐富的種間多樣性，所有非優(yōu)勢種的根瘤菌均來自于東北地區(qū)，而華北地區(qū)根瘤菌則均為。目前與紫花苜蓿共生的根瘤菌種間多樣性的報道較少。張小甫[8]對從甘肅地區(qū)篩選的 31 株苜蓿根瘤菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)根瘤菌存在多個種（、、和sp.），但這些種主要為內(nèi)生菌。馮春生[9]對西北地區(qū)天藍(lán)苜蓿根瘤菌分析，發(fā)現(xiàn)供試菌株少數(shù)可歸屬于根瘤菌屬（）、土壤桿菌屬（）、中華根瘤菌屬（），大部分菌株為。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)581株分離至西藏紫花苜蓿根瘤的根瘤菌僅1株為未確定的種sp.。本文在中國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿根瘤菌較豐富的種間多樣性可能與共生基因在逆境脅迫下發(fā)生基因的水平轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)瘤和固氮基因可在根瘤菌種間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，是根瘤菌進(jìn)化的重要機(jī)制[27]。基因的水平轉(zhuǎn)移使一些腐生的根瘤菌獲得與豆科植物共生結(jié)瘤以及固氮的能力，并形成與寄主的協(xié)同進(jìn)化。而在逆境脅迫下，根瘤菌受到的選擇壓力可能使得基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象更為頻繁[28-29]。東北地區(qū)的根瘤菌大多采自鹽堿地，這為共生基因在根瘤菌間的水平轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了逆境條件。通過與紫花苜蓿共生的各根瘤菌基因組的比較分析將有助于揭示中國東北地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌種間多樣性的分子機(jī)制；同時加大逆境脅迫環(huán)境條件下苜蓿根瘤菌的采樣和分析有助于更清楚地了解環(huán)境脅迫在根瘤菌的基因水平轉(zhuǎn)移中所發(fā)揮的作用[30]。

本文采用了3個持家基因（、和）和2個共生基因（和）對供試紫花苜蓿根瘤菌多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。目前，可用于根瘤菌多樣性分析的持家基因很多，但有很多研究報道不同持家基因揭示多樣性的能力存在差別[5]。本研究結(jié)果顯示，3種持家基因在進(jìn)行紫花苜蓿種間多樣性的系統(tǒng)發(fā)育分析時具有一致的效果，但在種內(nèi)多樣性的分析時則存在部分不一致的結(jié)果（圖1）。當(dāng)多基因聯(lián)合分析時，種內(nèi)多樣性呈現(xiàn)比較雜亂的狀態(tài)，因此，本研究沒有將3種持家基因進(jìn)行多基因聯(lián)合分析。研究表明是中國東北和華北地區(qū)優(yōu)勢根瘤菌，未來需要進(jìn)一步評估各種分子標(biāo)記在根瘤菌種內(nèi)多樣性研究中的作用。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步和測序費(fèi)用的下降，根瘤菌染色體基因組范圍內(nèi)的SNPs分子標(biāo)記的開發(fā)和利用也將有助于紫花苜蓿根瘤菌種內(nèi)多樣性的分析及根瘤菌種內(nèi)分化機(jī)制的揭示[31-32]。根瘤菌種內(nèi)多樣性的分析對篩選高效結(jié)瘤、固氮和促生的根瘤菌應(yīng)用于紫花苜蓿的生產(chǎn)具有重要的意義。本研究的共生基因系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明，共生基因在一些根瘤菌中發(fā)生了屬內(nèi)和屬間的水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，和的與的具有一樣的系統(tǒng)發(fā)育分支（圖2）。根瘤菌屬內(nèi)共生基因水平轉(zhuǎn)移常見報道，但屬間則報道較少[27]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)保留了其和，但仍可與紫花苜蓿進(jìn)行結(jié)瘤共生。根瘤菌早期被認(rèn)為是與紫云英（與紫花苜蓿結(jié)瘤發(fā)生共生的原因[34]。

本研究還發(fā)現(xiàn)了2種與紫花苜蓿結(jié)瘤共生的潛在新種（sp.和sp.），需要通過進(jìn)一步的分析以明確其分類地位[35]。本研究明確了中國東北和華北部分地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌的遺傳信息，獲得了豐富的種間和種內(nèi)多樣性的根瘤菌菌株，可為高效根瘤菌劑的篩選和應(yīng)用提供有價值的菌種資源和參考信息。此外，在逆境脅迫條件下（如鹽堿），紫花苜蓿根瘤菌種間和種內(nèi)的共生效率及其相互之間的競爭或合作關(guān)系，仍不清楚。厘清根瘤菌種間及種內(nèi)互作機(jī)制，是根瘤菌高效應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)，未來可以充分利用本研究獲得的鹽堿地中與紫花苜蓿結(jié)瘤共生的多個根瘤菌種以及優(yōu)勢種豐富的種內(nèi)多樣性，開展相關(guān)的研究，為鹽堿地高效根瘤菌劑的篩選和利用提供參考。

4 結(jié)論

中國東北和華北地區(qū)紫花苜蓿根瘤菌具有較豐富的遺傳多樣性，且存在顯著的地理分布特征及寄主品種選擇現(xiàn)象。為優(yōu)勢根瘤菌種，占總數(shù)的97.60%。其余12株分別為、、、和，以及2個潛在的新種（sp.和sp.）均分布于東北地區(qū)。根瘤菌屬間和屬內(nèi)發(fā)生了共生基因的水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

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Genetic Diversity Analysis of Rhizobia Associated withCultivated in Northeast and North China

LI Xinyuan, LOU JinXiu, LIU QingYuan, HU Jian, ZHANG YingJun

College of Agro-grassland Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【】is reputed to be the “Queen of Forages”, its cultivated area has increased in Northeast and North China in recent years. However, the quality and yield ofstill do not meet the needs of livestock husbandry development in China. The objective of this study was to analyze the genetic diversity of rhizobia associated withfrom Northeast and North China, which will provide valuable reference for screening and applying high efficient nitrogen fixing rhizobia from【】Surface sterilization and plate streaking method were used to recover and purify the rhizobia fromroot nodules; BOX-PCR was applied to identify the genotypes of the tested rhizobia; Three housekeeping (,and) and two symbiotic genes (and) were selected for phylogenetic analysis of the representative genotypes. 【】A total of 499 rhizobia strains were obtained from 19 sampling regions located in Northeast and North China. All strains were classified into 37 BOX types. The BOX types showed a strong geographic distribution, and host cultivars imposed a certain selection pressure to the genotypes of rhizobia. 97.60% (487/499) of the strains was identified as, while the rest 12 strains were identified as,,,,,sp. andsp.. All the 12 strains were collected from Northeast China, while all strains from North China were. The housekeeping genes revealed similar phylogenetic trends when they were used for inter-species analysis, but revealed differently for intra-species analysis. Phylogeny of symbiotic genes revealed that horizontal gene transfer happened between genera and species within genus.showed high genetic diversity thaninstrains.【】 Rhizobia associated withfrom Northeast and North China showed high genetic diversity, moreover, they had a strong characteristics of geographic distribution and host selection.

;; genetic diversity; phylogeny; horizontal transfer

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.003

2021-02-03；

2021-05-02

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（KJQN201836）

李昕芫，E-mail：nalxy0806@163.com。通信作者胡健，E-mail：jaffyhu@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）