趙靜雅，夏薈清，彭夢(mèng)雅，凡卓，殷悅，徐賽博，張楠，陳文波，陳琳琳

假禾谷鐮孢轉(zhuǎn)錄因子FpAPSES的鑒定與功能分析

趙靜雅，夏薈清，彭夢(mèng)雅，凡卓，殷悅，徐賽博，張楠，陳文波，陳琳琳

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002

【】假禾谷鐮孢（）侵染小麥引起的小麥莖基腐病嚴(yán)重影響中國(guó)小麥的安全生產(chǎn)。查找假禾谷鐮孢中的APSES轉(zhuǎn)錄因子，分析其在病原菌致病過(guò)程中的作用，為解析假禾谷鐮孢的致病機(jī)制及小麥莖基腐病的防治提供理論依據(jù)。從GenBank獲得物種中已知的APSES氨基酸序列，利用BLASTP方法在假禾谷鐮孢中查找APSES同源蛋白，利用pfam軟件預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域，采用MEGA5.05構(gòu)建APSES蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析A組APSES轉(zhuǎn)錄因子基因和在假禾谷鐮孢侵染過(guò)程中的表達(dá)。通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和PCR篩選和基因缺失的突變體菌株。在PDA培養(yǎng)基上測(cè)定假禾谷鐮孢野生型菌株Wz2-8A、Δ和Δ突變體菌株的菌絲形態(tài)和生長(zhǎng)速率；測(cè)定在CMC培養(yǎng)液中培養(yǎng)后的分生孢子產(chǎn)生情況、形態(tài)以及在無(wú)菌水中的萌發(fā)率；利用菌絲塊和分生孢子接種小麥胚芽鞘和大麥葉片以及盆栽試驗(yàn)測(cè)定其致病性；采用ELISA方法測(cè)定小米培養(yǎng)基中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）的含量。假禾谷鐮孢中有4個(gè)APSES同源蛋白，均含有保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域HTH。與其他物種的APSES蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4屬于A組APSES，F(xiàn)pAPSES3分布在C組。和在侵染階段誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)可能參與假禾谷鐮孢的致病。分別獲得2個(gè)和基因缺失的突變體菌株Δ-T10、Δ-T27和Δ-T1、Δ-T2。表型測(cè)定結(jié)果顯示，與野生型相比，和基因缺失突變體在PDA平板上的生長(zhǎng)速率明顯減慢、色素積累明顯增多；基因缺失突變體菌絲形態(tài)無(wú)差異，而基因缺失突變體菌絲彎曲、分支明顯增多；和基因缺失突變體在CMC液體中的分生孢子產(chǎn)生明顯減少，分別比野生型下降了99.5%和97.4%，產(chǎn)生的分生孢子變短、隔膜減少、萌發(fā)率有所降低；與野生型相比，和基因缺失突變體菌絲體和分生孢子對(duì)小麥胚芽鞘的致病力明顯降低，菌絲在小麥胚芽鞘表皮細(xì)胞中的擴(kuò)展明顯受阻；和基因缺失突變體對(duì)大麥葉片和小麥根部的致病力也明顯降低；和基因缺失突變體在小米培養(yǎng)基中產(chǎn)生的DON毒素分別比野生型下降了約78%和44%。編碼A組APSES同源蛋白的和對(duì)假禾谷鐮孢的菌絲生長(zhǎng)、分生孢子產(chǎn)生和致病力均具有重要作用。

小麥莖基腐病；假禾谷鐮孢；APSES轉(zhuǎn)錄因子；致病力

0 引言

【研究意義】假禾谷鐮孢（）是一種土傳病原真菌，其引起的小麥莖基腐病已成為威脅中國(guó)麥區(qū)小麥生產(chǎn)的主要病害[1-2]。假禾谷鐮孢也可以侵染小麥穗部造成赤霉病，并產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等毒素危害人和家畜的健康[3-4]。但是，目前對(duì)該病菌了解不深，尤其缺乏抗病小麥品種及有效防治策略。研究假禾谷鐮孢致病的分子機(jī)制，對(duì)制定合理有效的小麥莖基腐病和赤霉病防治策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】轉(zhuǎn)錄因子與特定的DNA位點(diǎn)結(jié)合，通過(guò)DNA-蛋白互作、蛋白-蛋白互作或者染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變來(lái)激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。APSES（Asm1p、Phd1p、Sok2p、Efg1p和StuAp）蛋白是在真菌中非常保守的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛作用于真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和次級(jí)代謝等過(guò)程[5]。APSES類轉(zhuǎn)錄因子包含一段約100 bp的保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其核心結(jié)構(gòu)域可以形成一個(gè)典型的基礎(chǔ)螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH/HTH）結(jié)構(gòu)[6]。在不同真菌中，APSES類轉(zhuǎn)錄因子可以分成A、B、C和D 4個(gè)組，A組包括Mbp1、Swi4和Swi6蛋白，主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期作用于真菌的生長(zhǎng)發(fā)育。在稻瘟病菌（）中，MoSwi6與絲裂原活化激酶（MAPK）MoMps1互作，Δ突變體在菌絲生長(zhǎng)、分生孢子形態(tài)、附著胞形成和致病力等方面表現(xiàn)異常[7]。B組由Xbp1蛋白組成[8]。C組APSES蛋白在不同真菌中研究報(bào)道比較多，又分成C-Ⅰ（Efg1、Efh1、Phd1和Sok2）和C-Ⅱ（StuA/Asm1 的同源蛋白）。在釀酒酵母（）中，Phd1在營(yíng)養(yǎng)缺陷條件中能夠激活酵母假菌絲的生長(zhǎng)[9]；白色念珠菌（）Efg1及其同源蛋白Efh1p主要作用于真菌的形態(tài)建成、代謝、生物膜形成和致病力等[10-11]；StuA/Asm1是最先鑒定到的APSES轉(zhuǎn)錄因子，其同源蛋白的功能已在多種植物病原真菌中報(bào)道是真菌生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和侵染等過(guò)程的關(guān)鍵因子，包括稻瘟病菌的Mstu1、禾谷鐮孢（）的FgStuAp和擬輪枝鐮孢（）的FvStuA等[12-15]。D組APSES蛋白目前主要通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，其功能還不明確?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，APSES類轉(zhuǎn)錄因子在假禾谷鐮孢中的分布和功能還未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)生物信息學(xué)系統(tǒng)分析假禾谷鐮孢中的APSES轉(zhuǎn)錄因子，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、遺傳轉(zhuǎn)化和生物學(xué)表型分析，探討A組APSES轉(zhuǎn)錄因子FpAPSES1和FpAPSES4的功能，為進(jìn)一步揭示APSES類轉(zhuǎn)錄因子在植物病原真菌中的作用以及解析假禾谷鐮孢的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年5月至2020年11月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物病害檢測(cè)與防控實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

假禾谷鐮孢菌株Wz2-8A由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物病害檢測(cè)與防控實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

假禾谷鐮孢Wz2-8A高感小麥品種矮抗58和周麥27由國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心提供，啤酒大麥種子購(gòu)于河北興農(nóng)富民種子銷售有限公司。

1.2 方法

1.2.1 FpAPSES蛋白的篩選與分析 根據(jù)釀酒酵母、粗糙脈孢菌（）、構(gòu)巢曲霉（）和稻瘟病菌中已知的APSES類蛋白，利用BLASTP在假禾谷鐮孢基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找同源蛋白[16]。獲得的候選蛋白利用Pfam軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)域[17]，具有保守HTH結(jié)構(gòu)域的蛋白被認(rèn)定為APSES同源蛋白。采用MEGA 5.05軟件構(gòu)建APSES蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[18]。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 假禾谷鐮孢野生型菌株Wz2-8A在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，水1 L）上活化后轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)平板上，25℃、黑暗培養(yǎng)3 d，用打孔器在菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅置在分生孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基（carboxymethyl cellulose，CMC：carboxymethyl cellulose 10 g、NH4NO31 g、酵母提取物1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 L）中，25℃、150 r/min搖培3 d收集分生孢子。將分生孢子在YEPD培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min搖培20 h收集菌絲體。對(duì)假禾谷鐮孢感病的小麥品種矮抗58種子在25℃、保濕萌發(fā)生長(zhǎng)4 d，取2 μL分生孢子懸浮液（1×107/mL）接種于小麥幼苗胚芽鞘，25℃、黑暗、保濕培養(yǎng)，分別在侵染18、30、48 h、3、5和7 d取樣，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

利用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）對(duì)上述收集的樣品提取總RNA。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（寶生物，大連）去除基因組DNA，并合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Applied Biosystems 7300，美國(guó)）方法檢測(cè)在不同階段的表達(dá)水平，作為內(nèi)參基因，所用引物見(jiàn)表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex TaqⅡ6 μL，Primer F（10 μmol·L-1）0.5 μL，Primer R（10 μmol·L-1）0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序：95℃ 2min預(yù)變性，40個(gè)循環(huán)（95℃15 s，60℃15 s，68℃20 s），95℃15 s，60℃ 15 s和95℃ 15 s，獲得熔解曲線。將假禾谷鐮孢菌絲體待分析基因表達(dá)量定為1，分析比較相應(yīng)基因在分生孢子和侵染過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 基因敲除及檢測(cè) 為了獲得基因缺失的突變體菌株，利用split-marker策略獲得目標(biāo)基因同源重組序列[19-20]，所用引物見(jiàn)表1。第1輪PCR擴(kuò)增，以假禾谷鐮孢菌絲體基因組DNA為模板，利用引物F1+R1和F2+R2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目標(biāo)基因的上游（A1）和下游（A2）約1 000 bp的DNA序列；以pKOV21（含潮霉素基因）載體為模板，利用引物HYG/F+HYG/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得潮霉素片段（H）。PCR反應(yīng)體系包含Premix Taq 25 μL，正反向引物各1 μL，假禾谷鐮孢基因組DNA 100 ng，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃5 min預(yù)變性，35個(gè)循環(huán)（94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min），72℃10 min再延伸。第2輪PCR擴(kuò)增將以第1輪PCR純化后產(chǎn)物以A1﹕A2﹕H=1﹕1﹕3濃度比混合作為模板。反應(yīng)體系為10×LA Taq buffer 5 μL，dNTPs 2 μL，LA Taq 0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min預(yù)變性，15個(gè)循環(huán)（94℃30 s，58℃30 s），72℃3.5 min再延伸。第3輪PCR擴(kuò)增將直接以第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，分別利用引物F1+HY/R和YG/F+R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為Premix Taq 25 μL，引物2 μL，模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃5 min預(yù)變性，35個(gè)循環(huán)（95℃30 s，58℃30 s，72℃2 min），72℃10 min再延伸。第3輪PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物純化后通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入假禾谷鐮孢野生型菌株原生質(zhì)體中[21]。

利用潮霉素抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。利用引物H2F/H2R、F3/H1R、H1F/R3和G1+G2依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子中的潮霉素基因、目標(biāo)基因上游和潮霉素融合片段、潮霉素和目標(biāo)基因下游融合片段以及目標(biāo)基因，確定目標(biāo)基因被潮霉素替換的轉(zhuǎn)化子。

表1 本研究中所用的引物

1.2.4 菌絲生長(zhǎng)測(cè)定 假禾谷鐮孢野生型和突變體菌株活化后，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，25℃、黑暗培養(yǎng)3 d，利用直徑5 mm的打孔器取菌落邊緣菌絲塊，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，25℃、黑暗培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)、色素積累，拍照并測(cè)量菌落直徑。將滅菌的載玻片蘸取融化好的PDA培養(yǎng)基，放置在培養(yǎng)皿中，將菌絲塊接種在載玻片上。待長(zhǎng)出菌落后，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察并拍照。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。利用T測(cè)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析樣品間的差異。

1.2.5 分生孢子產(chǎn)生及其萌發(fā)測(cè)定 假禾谷鐮孢野生型和突變體菌株活化后，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，25℃、黑暗培養(yǎng)3 d，利用直徑5 mm的打孔器取兩塊邊緣菌絲塊，轉(zhuǎn)接60 mL CMC培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分生孢子的產(chǎn)生，野生型和突變體菌株在25℃、150 r/min搖培3—7 d。用一層miracloth濾布過(guò)濾收集分生孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用顯微鏡觀察分生孢子的形態(tài)。收集的分生孢子用無(wú)菌水清洗兩遍，制備濃度為4×105/mL的孢子懸浮液。取100 μL置于滅菌載玻片上，25℃、黑暗保濕培養(yǎng)3—6 h，取10 μL經(jīng)萌發(fā)處理孢子懸浮液滴于新的載玻片上，用顯微鏡觀察分生孢子萌發(fā)芽管長(zhǎng)度并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)量。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用T測(cè)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析樣品間的差異。

1.2.6 致病力測(cè)定 假禾谷鐮孢野生型和突變體菌株活化后，轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，25℃、黑暗培養(yǎng)3 d，待用。選擇在溫室內(nèi)對(duì)假禾谷鐮孢感病的小麥品種周麥27于培養(yǎng)砵中，25℃、16 h光照﹕8 h黑暗條件下培養(yǎng)4 d，至小麥胚芽鞘長(zhǎng)約5 cm時(shí)備用。利用直徑5 mm的打孔器取活化的假禾谷鐮孢菌落邊緣菌絲塊置于胚芽鞘上，25℃、黑暗、保濕培養(yǎng)24 h，移去菌絲塊并將小麥移到25℃、16 h光照﹕8 h黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d，拍照并記錄病斑長(zhǎng)度。撕取接種的小麥胚芽鞘內(nèi)表皮，利用尼康Ti-s顯微鏡觀察假禾谷鐮孢菌絲在小麥細(xì)胞中的侵染和擴(kuò)展（因突變體菌株生長(zhǎng)減慢，侵染延長(zhǎng)至5 d）。收集分生孢子配制成1×106/mL濃度的孢子懸浮液。將0.5 cm×5 cm的滅菌吸水紙纏繞在生長(zhǎng)3 d的小麥胚芽鞘上，并滴加50 μL分生孢子懸浮液，25℃、黑暗保濕培養(yǎng)4 d，拍照并記錄病斑長(zhǎng)度。

啤酒大麥種子種于培養(yǎng)砵中，25℃、16 h光照﹕8 h黑暗培養(yǎng)7 d。利用直徑5 mm的打孔器取活化的假禾谷鐮孢菌落邊緣菌絲塊置于離體葉片上，每片葉接種兩個(gè)菌絲塊。25℃、黑暗、保濕培養(yǎng)24 h，移去菌絲塊繼續(xù)培養(yǎng)3 d，拍照并記錄病斑直徑。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的盆栽試驗(yàn)方法[22]，分別將活化的假禾谷鐮孢野生型和突變體菌絲塊接種到小米培養(yǎng)基上擴(kuò)繁，25℃培養(yǎng)7 d。按質(zhì)量比0.5%的比例將菌混入滅菌土中，每個(gè)種植缽放置200 g菌土，對(duì)照為等比例的小米和無(wú)菌土。將催芽后的周麥27小麥種子播于種植缽內(nèi)。25℃、16 h光照﹕8 h黑暗培養(yǎng)7 d，拍照并通過(guò)觀察小麥的株高、根系長(zhǎng)度以及葉鞘和莖稈變褐程度確定小麥莖基腐病發(fā)病程度。

每種致病力測(cè)定試驗(yàn)至少重復(fù)3次，每次試驗(yàn)每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù)。利用T測(cè)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析樣品間的差異。

1.2.7 DON毒素測(cè)定 將假禾谷鐮孢野生型和突變體菌株在PDA培養(yǎng)基上活化，用直徑5 mm的打孔器取菌落邊緣菌絲塊轉(zhuǎn)接到小米培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)10 d至小米表面完全長(zhǎng)滿菌。取5 g小米樣品粉碎后，利用北京華安麥科生物技術(shù)有限公司的嘔吐毒素ELISA檢測(cè)試劑盒（HEM0896），參照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)接種不同假禾谷鐮孢菌株的小米培養(yǎng)基中的DON即嘔吐毒素的含量。因Δ-T10菌株接種小米培養(yǎng)基后有細(xì)菌污染，所以未測(cè)定。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)每個(gè)處理重復(fù)3次，數(shù)據(jù)利用T測(cè)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 FpAPSES蛋白的篩選與分析

根據(jù)物種中已知的APSES類轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)BLASTP的方法，在假禾谷鐮孢中查找到5個(gè)APSES候選蛋白。利用Pfam預(yù)測(cè)候選蛋白的功能域（圖 1-A），發(fā)現(xiàn)FPSE_10424、FPSE_07209、FPSE_02622和FPSE_07396包含APSES轉(zhuǎn)錄因子保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域HTH，初步確定為APSES同源蛋白，并根據(jù)其與禾谷鐮孢APSES蛋白的同源性，分別命名為FpAPSES1、FpAPSES2、FpAPSES3和FpAPSES4。候選蛋白FPSE_05854無(wú)明顯的HTH結(jié)構(gòu)域。從表2可以看出，F(xiàn)pAPSES蛋白分子量較大，除FpAPSES2外，其余3個(gè)FpAPSES蛋白分子量均在75 kD以上；FpAPSES蛋白均呈弱酸性。

A：FpAPSES蛋白結(jié)構(gòu)域分析 Domains analysis of FpAPSES proteins；B：FpAPSES蛋白進(jìn)化分析 Phylogenetic analysis of FpAPSES proteins

將FpAPSES蛋白與物種中已知的APSES蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1-B），結(jié)果顯示FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4屬于A組APSES蛋白，F(xiàn)pAPSES3分布在C組。分析不同物種APSES蛋白的相似度可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)pAPSES與禾谷鐮孢的APSES蛋白同源性最高，其次分別為曲霉、稻瘟病菌、粗糙脈孢菌和釀酒酵母，符合物種進(jìn)化的方向。

表2 FpAPSES轉(zhuǎn)錄因子的基本特性

2.2 FpAPSES1和FpAPSES4在侵染階段誘導(dǎo)表達(dá)

C組APSES蛋白在植物病原真菌中的功能已有較多報(bào)道，而A組APSES蛋白在鐮孢菌中的功能還不清楚，因此在假禾谷鐮孢中選擇了兩個(gè)A組APSES同源蛋白FpAPSES1和FpAPSES4做進(jìn)一步的功能分析。為了預(yù)測(cè)FpAPSES1和FpAPSES4在病原菌致病中的作用，利用qRT-PCR方法分析其在假禾谷鐮孢侵染過(guò)程中的表達(dá)（圖2）。結(jié)果顯示和在侵染階段均明顯被誘導(dǎo)表達(dá)，其中在侵染48 h表達(dá)量最高，與菌絲階段相比，上調(diào)表達(dá)約8倍。而在侵染18 h和5 d時(shí)表達(dá)量最高，是菌絲階段表達(dá)量的7倍以上。以上結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)pAPSES1和FpAPSES4可能參與假禾谷鐮孢的致病過(guò)程。

圖2 FpAPSES1和FpAPSES4在假禾谷鐮孢侵染階段的表達(dá)分析

2.3 FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突變體的構(gòu)建

為了分析和在假禾谷鐮孢中的生物學(xué)功能，利用split-marker PCR的方法分別擴(kuò)增獲得和基因上游-潮霉素以及潮霉素-目標(biāo)基因下游的融合片段（圖3-A）。通過(guò)PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將重組片段轉(zhuǎn)入假禾谷鐮孢Wz2-8A菌株的原生質(zhì)體中，利用潮霉素篩選陽(yáng)性菌株，通過(guò)PCR檢測(cè)和基因缺失的菌株。如圖3-B所示，在轉(zhuǎn)化子Δ-T10和Δ-T27中能夠檢測(cè)到潮霉素（750 bp）、上游-潮霉素（1 598 bp）以及潮霉素-1下游（1 508 bp）的融合片段，但無(wú)法檢測(cè)到（811 bp），因此獲得2個(gè)基因缺失的突變體菌株。如圖3-C所示，在轉(zhuǎn)化子Δ-T1和Δ-T2中能夠檢測(cè)到潮霉素（750 bp）、上游-潮霉素（1 540 bp）以及潮霉素-下游（1 520 bp）融合片段，但是無(wú)法檢測(cè)到（975 bp），同樣獲得2個(gè)基因缺失的突變體菌株。

A：假禾谷鐮孢基因敲除策略及引物示意圖Schematic representation of the target gene deletion strategy and primers；B：FpAPSES1基因缺失突變體PCR檢測(cè)PCR products for the FpAPSES1 gene replacement construct；C：FpAPSES4基因缺失突變體PCR檢測(cè)PCR products for the FpAPSES4 gene replacement construct

2.4 FpAPSES1和FpAPSES4參與假禾谷鐮孢的菌絲生長(zhǎng)

在PDA培養(yǎng)基上測(cè)定野生型菌株Wz2-8A、Δ和Δ突變體菌株的菌絲生長(zhǎng)速率及菌落形態(tài)。結(jié)果顯示，與野生型菌株相比，Δ和Δ突變體菌絲生長(zhǎng)速度均明顯減慢，色素積累明顯增多（圖4-A、4-B）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Δ的菌絲形態(tài)無(wú)明顯差異，而Δ的菌絲彎曲、分支明顯增多（圖4-A）。說(shuō)明FpAPSES1和FpAPSES4對(duì)假禾谷鐮孢的生長(zhǎng)非常關(guān)鍵。

2.5 FpAPSES1和FpAPSES4調(diào)控假禾谷鐮孢分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)

在CMC培養(yǎng)液中檢測(cè)野生型菌株Wz2-8A、Δ和Δ突變體菌株分生孢子的產(chǎn)生及形態(tài)。假禾谷鐮孢野生型菌株搖培3 d，即可獲得大量分生孢子，此時(shí)Δ和Δ突變體分生孢子非常少。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型分生孢子相比，Δ和Δ突變體的分生孢子變短，分隔減少（圖5-A）。為了明確Δ和Δ突變體分生孢子減少是否是其生長(zhǎng)速率減慢造成的，繼續(xù)搖培至7 d。結(jié)果顯示，假禾谷鐮孢野生型菌株分生孢子量持續(xù)增多，而Δ和Δ突變體分生孢子并沒(méi)有明顯增多（圖5-B）。將收集的野生型、Δ和Δ突變體分生孢子在無(wú)菌水中調(diào)整濃度至4×105/mL，置于載玻片上25℃、黑暗保濕培養(yǎng)3—6 h。顯微觀察結(jié)果顯示，與野生型相比，Δ和Δ突變體分生孢子萌發(fā)6 h的芽管長(zhǎng)度較短（圖5-A），萌發(fā)率有所降低（圖5-C）。以上結(jié)果說(shuō)明FpAPSES1和FpAPSES4作用于假禾谷鐮孢分生孢子的產(chǎn)生、形態(tài)建成和萌發(fā)。

A：假禾谷鐮孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突變體菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落和菌絲形態(tài)，標(biāo)尺=20 μm Colony and mycelial morphology of F. pseudograminearum WT, Δfpapses1 and Δfpapses4 strains grown on PDA medium, bar=20 μm；B：假禾谷鐮孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突變體菌株在PDA平板上的菌落直徑Colony diameters of F. pseudograminearum WT, Δfpapses1 and Δfpapses4 strains grown on PDA plates

2.6 FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失影響假禾谷鐮孢的致病力

為了明確FpAPSES1和FpAPSES4是否參與假禾谷鐮孢的致病過(guò)程，通過(guò)小麥胚芽鞘接種、大麥葉片接種和盆栽試驗(yàn)分析了野生型菌株Wz2-8A、Δ和Δ突變體菌株的致病力。結(jié)果顯示，與野生型相比，Δ和Δ突變體菌株侵染的小麥病斑均明顯減小，但仍形成了明顯的侵染病斑（圖6-A、6-B）。收集野生型菌株Wz2-8A、Δ和Δ突變體菌株的分生孢子，制備成1×106/mL濃度的孢子懸浮液，接種到生長(zhǎng)4 d的周麥27小麥胚芽鞘上，25℃、保濕培養(yǎng)4 d。結(jié)果顯示，野生型菌株侵染的小麥胚芽鞘有明顯擴(kuò)展的壞死病斑，而Δ和Δ突變體分生孢子接種的小麥胚芽鞘只在接種點(diǎn)的位置形成壞死病斑，無(wú)明顯擴(kuò)展（圖6-A、6-C）。

為了明確Δ和Δ突變體菌絲侵染病斑減小是否由其生長(zhǎng)減慢造成，顯微觀察了菌絲在小麥表皮細(xì)胞中的擴(kuò)展。結(jié)果顯示，假禾谷鐮孢野生型菌絲可以在小麥表皮細(xì)胞中正常擴(kuò)展，而Δ和Δ突變體的菌絲在小麥表皮細(xì)胞間擴(kuò)展過(guò)程中受到明顯阻礙（圖6-A）。

對(duì)大麥葉片侵染試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生型相比，Δ和Δ突變體菌株侵染的大麥葉片病斑明顯減?。▓D7-A、7-B）。通過(guò)盆栽試驗(yàn)?zāi)M土壤中假禾谷鐮孢對(duì)小麥的侵染。結(jié)果顯示，與接種假禾谷鐮孢野生型的小麥相比，接種Δ和Δ菌株的小麥生長(zhǎng)較好，根和莖基部發(fā)病明顯減輕（圖7-C）。以上結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)pAPSES1和FpAPSES4調(diào)控假禾谷鐮孢的致病力，且主要影響病原菌在寄主細(xì)胞中的擴(kuò)展。

2.7 FpAPSES1和FpAPSES4參與假禾谷鐮孢DON毒素的合成

DON毒素即嘔吐毒素，在假禾谷鐮孢侵染過(guò)程中非常重要[3,23]。利用ELISA檢測(cè)野生型菌株Wz2-8A、Δ和Δ突變體菌株DON毒素的合成。結(jié)果顯示，假禾谷鐮孢野生型菌株可以產(chǎn)生大量的DON毒素，含量可達(dá)到12.8 mg·kg-1。與其相比，Δ和Δ突變體接種的小米培養(yǎng)基中DON毒素含量明顯減少，分別下降了78%和44%（圖 8）。說(shuō)明FpAPSES1和FpAPSES4均調(diào)控假禾谷鐮孢DON毒素的合成。

A：假禾谷鐮孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突變體菌株菌絲塊接種大麥葉片 Barley leaves inoculated with mycelial blocks of WT, Δfpapses1 and Δfpapses4 strains；B：接種4 d的病斑直徑Lesion diameters measured at 4 dpi；C：小麥盆栽試驗(yàn) Wheat seedlings from the pot-culture experiment

圖 8 假禾谷鐮孢野生型、Δfpapses1和Δfpapses4菌株產(chǎn)DON分析

3 討論

APSES類轉(zhuǎn)錄因子廣泛作用于真菌的細(xì)胞分化、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生，且與人和植物等多種真菌病害相關(guān)[5]。在曲霉和粗糙脈孢菌等絲狀真菌中通常包含5個(gè)APSES蛋白，根據(jù)蛋白序列比對(duì)，本研究在假禾谷鐮孢中也篩選到5個(gè)APSES同源蛋白，其中4個(gè)為包含APSES保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白FpAPSES1—4。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)pAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4屬于A組APSES蛋白，F(xiàn)pAPSES3屬于C組APSES蛋白。StuA作為APSES家族中最早被鑒定的成員，在人類和植物病原真菌中已有廣泛研究報(bào)道，其對(duì)真菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和致病等均有重要的調(diào)控作用[12,14,24-25]，但對(duì)A組APSES蛋白在鐮孢菌致病過(guò)程中的作用了解較少。

目前已報(bào)道的真菌A組APSES蛋白主要包括Mbp1、Swi4和Swi6。在釀酒酵母中，Swi6是轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程中非常常見(jiàn)的亞單位，但其沒(méi)有DNA結(jié)合活性，所以Swi6常結(jié)合Mbp1形成MBF復(fù)合體，或者結(jié)合Swi4形成SBF復(fù)合體起作用[26-27]。MBF復(fù)合體調(diào)控下游多個(gè)途徑相關(guān)基因的表達(dá)，尤其是絲裂原蛋白激酶信號(hào)途徑，與Mpk1結(jié)合作用于細(xì)胞的完整性[28-30]。在稻瘟病菌中，Mbp1（PCG2）具有一種新的有翼螺旋-轉(zhuǎn)-螺旋（wHTH）結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合模式，缺失突變體表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)孢量下降、附著胞形成和侵染、擴(kuò)展能力顯著降低[6,31]；MoSwi6與稻瘟病菌絲裂原活化激酶MoMps1互作，且缺失突變體菌株在多個(gè)層面表現(xiàn)缺陷，包括菌絲生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)、附著胞形成、細(xì)胞壁完整性、過(guò)氧化氫耐受性以及致病性等，缺失也導(dǎo)致過(guò)氧化物酶和漆酶等多種胞外酶的轉(zhuǎn)錄和活性降低[7]。在本研究中，選擇Mbp1的同源蛋白FpAPSES1和MoSwi6的同源蛋白FpAPSES4，通過(guò)qRT-PCR方法分析發(fā)現(xiàn)，和在假禾谷鐮孢侵染階段誘導(dǎo)表達(dá)，推測(cè)其可能參與病原菌的致病過(guò)程。

利用遺傳學(xué)的方法分別獲得和的缺失突變體。表型分析發(fā)現(xiàn)，和缺失突變體的菌絲生長(zhǎng)明顯減慢、分生孢子產(chǎn)生減少、致病力減弱、DON毒素合成減少。對(duì)比和在禾谷鐮孢中的同源基因和的功能，和缺失突變體菌絲生長(zhǎng)也明顯減慢，但是分生孢子的數(shù)量并沒(méi)有明顯差異，而且突變體菌株完全不致病[32]。推測(cè)APSES蛋白在物種間的功能已有分化，但是和缺失突變體的回補(bǔ)和功能有待驗(yàn)證。

4 結(jié)論

APSES轉(zhuǎn)錄因子基因和在假禾谷鐮孢的侵染階段高表達(dá)，突變菌株分析推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子影響了菌絲生長(zhǎng)、分生孢子產(chǎn)生和致病過(guò)程。研究結(jié)果將為進(jìn)一步解析假禾谷鐮孢的致病機(jī)制提供參考。

[1] LI H L, YUAN H X, FU B, XING X P, SUN B J, TANG W H. First report ofcausing crown rot of wheat in Henan, China. Plant Disease, 2012, 96(7): 1065.

[2] ZHOU H F, HE X L, WANG S, MA Q Z, SUN B J, DING S L, CHEN L L, ZHANG M, LI H L. Diversity of the Fusarium pathogens associated with crown rot in the Huanghuai wheat-growing region of China. Environmental Microbiology, 2019, 21(8): 2740-2754.

[3] KAZAN K, GARDINER D M. Fusarium crown rot caused byin cereal crops: recent progress and future prospects. Molecular Plant Pathology, 2018, 19(7): 1547-1562.

[4] OBANOR F, NEATE S, SIMPFENDORFER S, SABBURG R, WILSON P, CHAKRABORTY S.andcaused the 2010 head blight epidemics in Australia. Plant Pathology, 2013, 62(1): 79-91.

[5] ZHAO Y, SU H, ZHOU J, FENG H H, ZHANG K Q, YANG J K. The APSES family proteins in fungi: Characterizations, evolution and functions.Fungal Genetics and Biology, 2015, 81: 271-280.

[6] LIU J F, HUANG J G, ZHAO Y X, LIU H A, WANG D W, YANG J, ZHAO W S, TAYLOR I A, PENG Y L. Structural basis of DNA recognition by PCG2 reveals a novel DNA binding mode for winged helix-turn-helix domains. Nucleic Acids Research, 2015, 43(2): 1231-1240.

[7] QI Z Q, WANG Q, DOU X Y, WANG W, ZHAO Q, LV R L, ZHANG H F, ZHENG X B, WANG P, ZHANG Z G. MoSwi6, an APSES family transcription factor, interacts with MoMps1 and is required for hyphal and conidial morphogenesis, appressorial function and pathogenicity of. Molecular Plant Pathology, 2012, 13(7): 677-689.

[8] MILES S, LI L, DAVISON J, BREEDEN L L. Xbp1 directs global repression of budding yeast transcription during the transition to quiescence and is important for the longevity and reversibility of the quiescent state. PLoS Genetics, 2013, 9(10): e1003854.

[9] GIMENO C J, FINK G R. Induction of pseudohyphal growth by overexpression of, agene related to transcriptional regulators of fungal development. Molecular and Cellular Biology, 1994, 14(3): 2100-2112.

[10] PARK H, MYERS C L, SHEPPARD D C, PHAN Q T, SANCHEZ A A, EDWARDS J E, FILLER S G. Role of the fungal Ras-protein kinase A pathway in governing epithelial cell interactions during oropharyngeal candidiasis. Cellular Microbiology, 2005, 7(4): 499-510.

[11] STOLDT V R, SONNEBORN A, LEUKER C E, ERNST J F. Efg1p, an essential regulator of morphogenesis of the human pathogen, is a member of a conserved class of bHLH proteins regulating morphogenetic processes in fungi. The EMBO Journal, 1997, 16(8): 1982-1991.

[12] LYSOE E, Pasquali M, Breakspear A, Kistler H C. The transcription factor FgStuAp influences spore development, pathogenicity, and secondary metabolism in. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2011, 24(1): 54-67.

[13] Nishimura M, Fukada J, Moriwaki A, Fujikawa T, Ohashi M, Hibi T, Hayashi N. Mstu1, an APSES transcription factor, is required for appressorium-mediated infection in. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2009, 73(8): 1779-1786.

[14] Rath M, Crenshaw N J, Lofton L W, Glenn A E, Gold S E. FvSTUA is a key regulator of sporulation, toxin synthesis, and virulence in. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2020, 33(7): 958-971.

[15] 周欣, 云英子, 郭譜勝, 吳凱莉, 陳偉鐘, 李江江, 周曉莉. 尖孢鐮刀菌番茄專化型中APSES轉(zhuǎn)錄因子FolStuA的功能分析. 分子植物育種, 2018, 16(3): 772-780.

ZHOU X, YUN Y Z, GUO P S, WU K L, CHEN W Z, LI J J, ZHOU X L. Functional analysis of APSES transcription factor FolStuA inf. sp.. Molecular Plant Breeding, 2018, 16(3): 772-780. (in Chinese)

[16] Gardiner D M, Benfield A H, Stiller J, Stephen S, Aitken K, Liu C, Kazan K. A high-resolution genetic map of the cereal crown rot pathogenprovides a near-complete genome assembly. Molecular Plant Pathology, 2018, 19(1): 217-226.

[17] Finn R D, BATEMAN A, CLEMENTS J, COGGILL P, EBERHARDT R Y, EDDY S R, HEGER A, HETHERINGTON K, HOLM L, MISTRY J, SONNHAMMER E L L, TATE J, PUNTA M. Pfam: The protein families database. Nucleic Acids Research, 2014, 42: D222-D230.

[18] Hall B G. Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30(5): 1229-1235.

[19] Catlett N L, Lee B, Yoder O C, Turgeon B G. Split-marker recombination for efficient targeted deletion of fungal genes. Fungal Genetics Reports, 2003, 50: 9-11.

[20] 張承啟, 廖露露, 齊永霞, 丁克堅(jiān), 陳莉. 禾谷鐮孢核孔蛋白基因的功能分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 54(9): 1894-1903.

ZHANG C Q, LIAO L L, QI Y X, DING K J, CHEN L. Functional analysis of the nucleoporin gene. Scientia Agriculture sinica, 2021, 54(9): 1894-1903. (in Chinese)

[21] LIU Z H, Friesen T L. Polyethylene glycol (PEG)-mediated transformation in filamentous fungal pathogens. Methods in Molecular Biology, 2012, 835: 365-375.

[22] Chen L L, Geng X J, Ma Y M, Zhao J Y, Li T L, Ding S L, Shi Y, Li H L. Identification of basic helix-loop-helix transcription factors reveals candidate genes involved in pathogenicity of. Canadian Journal of Plant Pathology, 2019, 41(2): 200-208.

[23] Tunali B, Obanor F, Erginbas G, Westecott R A, Nicol J, Chakraborty S. Fitness of three Fusarium pathogens of wheat.FEMS Microbiology Ecology, 2012, 81(3): 596-609.

[24] Chung D, Upadhyay S, Bomer B, Wilkinson H H, Ebbole D J, Shaw B D.ASM-1 complements the conidiation defect in amutant of. Mycologia, 2015, 107(2): 298-306.

[25] Miller K Y, Toennis T M, Adams T H, Miller B L. Isolation and transcriptional characterization of a morphological modifier: thestunted () gene. Molecular and General Genetics, 1991, 227(2): 285-292.

[26] Foord R, Taylor I A, Sedgwick S G, Smerdon S J. X-ray structural analysis of the yeast cell cycle regulator Swi6 reveals variations of the ankyrin fold and has implications for Swi6 function. Nature Structural Biology, 1999, 6(2): 157-165.

[27] Koch C, Moll T, Neuberg M, Ahorn H, Nasmyth K. A role for the transcription factors Mbp1 and Swi4 in progression from G1 to S phase.Science, 1993, 261(5128): 1551-1557.

[28] Amigoni L, Colombo S, Belotti F, Alberghina L, Martegani E. The transcription factor Swi4 is target for PKA regulation of cell size at the G1to S transition in. Cell Cycle, 2015, 14(15): 2429-2438.

[29] Jiang L, Wang J, Asghar F, Snyder N, Cunningham K W. CaGdt1 plays a compensatory role for the calcium pump CaPmr1 in the regulation of calcium signaling and cell wall integrity signaling in.Cell Communication and Signaling, 2018, 16(1): 33.

[30] Medina E M, Walsh E, Buchler N E. Evolutionary innovation, fungal cell biology, and the lateral gene transfer of a viral KilA-N domain. Current Opinion in Genetics and Development, 2019, 58/59: 103-110.

[31] 王大偉. 稻瘟病菌APSES轉(zhuǎn)錄因子Pcg2的作用及其機(jī)理的研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

WANG D W. Functional characterization of the APSES transcription factor Pcg2 in the rice blast fungus[D]. Beijing: China Agricultural University, 2014. (in Chinese)

[32] Son H, Seo Y S, Min K, Park A R, Lee J, Jin J M, Lin Y, Cao P, Hong S Y, Kim E K,. A phenome-based functional analysis of transcription factors in the cereal head blight fungus,. PLoS Pathogens, 2011, 7(10): e1002310.

Identification and Functional Analysis of Transcription Factors FpAPSES in

ZHAO JingYa, XIA HuiQing, PENG MengYa, FAN Zhuo, YIN Yue, XU SaiBo, ZHANG Nan, CHEN WenBo, CHEN LinLin

College of Plant Protection, Henan Agricultural University/National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Zhengzhou 450002

【】Fusarium crown rot (FCR) caused byseriously affects wheat production in China. The objective of this study is to find and analyze the functions of APSES transcription factors in, and to provide theoretical basis for revealing the pathogenic mechanism ofand prevention and treatment of FCR.【】The known APSES proteins were obtained from GenBank, and APSES candidates inwere found by BLASTP. Domains of FpAPSES proteins were determined using Pfam. The phylogenetic tree of APSES proteins was constructed using MEGA 5.05. The relative expression levels ofandduring infection were examined by quantitative RT-PCR (qRT-PCR).anddeletion mutants were generated by polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast fungal transformation, and screened by PCR. The wild type, Δand Δstrains were activated on PDA medium, and cultured on PDA for mycelial growth and morphology assays; mycelial blocks were introduced into liquid CMC medium to assess conidiation and conidia morphology; conidia were cultured in sterile distilled water to explore conidia germination; mycelial blocks or conidia suspension were prepared and inoculated wheat coleoptiles and barely leaves to explore pathogenicity. The pot-culture experiment was also used for virulence assay. ELISA was used to detect deoxynivalenol (DON) in inoculation millet. 【】Four APSES candidates were found in, which all contained the conserved DNA binding domain HTH. The phylogenetic tree analysis showed that FpAPSES1, FpAPSES2 and FpAPSES4 were divided into A group, while FpAPSES3 belonged to the C group. The qRT-PCR analysis revealed thatandwere up-regulated at infection stages, which suggested that FpAPSES1 and FpAPSES4 might play important roles in infection. Twodeletion mutants (Δ-T10 and Δ-T27) and twodeletion mutants (Δ-T1 and Δ-T2) were obtained. Compared with the wild type strain, both- and-deleted mutants exhibited significantly reduced colony growth rates.-deleted mutants had normalhyphal branches, while-deleted mutants exhibited curved and more branched hypha. both- and-deleted mutants exhibited significantly reduced conidiation in CMC, and the conidia numbers were respectively reduced by 99.5% and 97.4% comparing with that of the wild type. Furthermore, conidia of- and-deleted mutants were shorter, less septa and lower germination rates. The wheat coleoptiles were point-inoculated with mycelial blocks or conidia, and the virulence of- and-deleted mutants was significantly reduced comparing to the wild type. Reduced pathogenicity was further observed by barely leaves inoculation and pot culture experiment. the DON levels in millet upon infection with- and-deleted mutants were reduced by 78% and 44% comparing to the wild type, respectively.【】Both A group APSES homologsandplay important roles in growth, conidiation and pathogenicity of.

Fusarium crown rot;; APSES transcription factor; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.006

2020-11-26；

2021-01-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（U2004140）、河南省青年人才托舉工程項(xiàng)目（2020HYTP043）、大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（201910466015）

趙靜雅，E-mail：zhaojy0108@163.com。通信作者陳琳琳，E-mail：llchensky@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）