李保玲，李穎，范鑫，馬文慧，曹云剛

焦磷酸鈉與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)氧化損傷肌原纖維蛋白凝膠性能的協(xié)同改善效應(yīng)

李保玲，李穎，范鑫，馬文慧，曹云剛

陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021

【】探究焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，PP）、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TG）及其組合（PP+TG）對(duì)氧化損傷豬肉肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）凝膠性能的影響，為改善氧化損傷蛋白的功能特性提供理論依據(jù)。從豬背最長肌中提取MP，采用亞油酸-脂肪氧合酶氧化體系誘導(dǎo)MP發(fā)生氧化，然后分別添加PP（1 mmol?L-1）、TG（E﹕S=1﹕500）及其組合（PP+TG）。采用圓二色譜探究不同添加處理對(duì)氧化損傷MP溶液二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響；通過內(nèi)源性色氨酸熒光測定探究MP三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化；通過粒度、溶解度及SDS-PAGE探究不同處理對(duì)MP交聯(lián)聚集情況的影響；借助物性測試儀探究MP凝膠強(qiáng)度的變化；采用離心法測定凝膠持水性的變化；通過分光測色計(jì)測定其白度變化；借助掃描電鏡觀察MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。PP處理明顯改變了氧化損傷MP的構(gòu)象，使氧化MP的平均粒徑明顯減小、溶解度顯著增強(qiáng)，在增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度的同時(shí)顯著提高了其持水性能（<0.05），凝膠的微觀結(jié)構(gòu)也明顯比氧化損傷MP凝膠更規(guī)則、均勻、細(xì)膩和致密。TG處理顯著改善了MP凝膠強(qiáng)度，但對(duì)其持水性能并無積極影響；凝膠的微觀結(jié)構(gòu)孔徑變小、結(jié)構(gòu)致密的同時(shí)，仍存在形狀不規(guī)則、表面粗糙等問題。綜合來看，PP+TG協(xié)同使用效果最好，氧化損傷MP的凝膠強(qiáng)度及持水性顯著增強(qiáng)，且明顯好于未氧化MP的凝膠性能。焦磷酸鈉與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的協(xié)同使用可以有效改善氧化損傷MP的凝膠性能。

肌原纖維蛋白；焦磷酸鈉；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；氧化；凝膠性能

0 引言

【研究意義】原料肉富含脂肪和蛋白質(zhì)，在長期儲(chǔ)藏及加工過程中，氧化是不可避免的自然現(xiàn)象。蛋白氧化通常會(huì)導(dǎo)致肉蛋白溶解度下降，進(jìn)而引起加工性能（乳化性和凝膠性等）劣變，最終導(dǎo)致產(chǎn)品得率降低、品質(zhì)下降[1-3]。因此，有效防控蛋白氧化或改善氧化損傷肉蛋白的功能特性具有重要的商業(yè)意義。【前人研究進(jìn)展】現(xiàn)有研究聚焦于采用不同包裝技術(shù)、添加抗氧化劑等手段降低儲(chǔ)藏過程中原料肉的氧化損傷。真空包裝能夠降低脂肪和蛋白氧化速率，延長肉品貨架期，但其對(duì)肉品的色澤及外觀等影響較大[4-5]。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)魚糜加工水解物可有效延緩魚糜的氧化，顯著提高其初始凝膠性能，降低凍藏造成的膠凝性能損失。Xu等[7]研究發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加番茄紅素可以有效地抑制蛋白和脂質(zhì)氧化，提高羊肉的貯藏品質(zhì)。JONGBERG等[8]研究發(fā)現(xiàn)在70% N2/30% CO2以及100% N2條件下白葡萄提取物（WGE）可有效阻止肉餅中的脂質(zhì)氧化，且對(duì)蛋白氧化有一定的抑制作用，但在高氧包裝（70% O2/30% CO2）條件下卻會(huì)促進(jìn)蛋白氧化。李艷青[9]研究發(fā)現(xiàn)在魚糜漂洗時(shí)添加沒食子酸丙酯可以抑制蛋白羰基的生成，但添加抗壞血酸鈉反而促進(jìn)了蛋白氧化的發(fā)生。CAO等[10]研究發(fā)現(xiàn)適量綠原酸的添加能有效抑制蛋白羰基含量的上升，且有利于肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，但高濃度綠原酸具有負(fù)面影響。這些策略在控制脂肪氧化方面非常有效，但是在控制蛋白氧化方面卻存在一定局限性。肌原纖維蛋白是肉蛋白的主要成分，約占整個(gè)肌肉蛋白含量的55%—60%，對(duì)肉制品的凝膠性能及感官品質(zhì)起決定性作用[11]。原料肉中富含脂肪，脂肪氧化產(chǎn)物是誘導(dǎo)蛋白發(fā)生氧化的重要因素。大量研究表明，焦磷酸鈉能有效改變肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)、解離肌動(dòng)球蛋白、有效提高其溶解度并改善其凝膠性能和持水性[12-13]；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能高效催化蛋白共價(jià)交聯(lián)提高蛋白凝膠性能[14]。TG催化蛋白交聯(lián)的效果取決于可利用反應(yīng)底物谷氨酰胺和賴氨酸殘基的含量，而蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化通常導(dǎo)致可利用反應(yīng)底物含量的改變。因此，推測焦磷酸鈉結(jié)合谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能協(xié)同改善氧化損傷肉蛋白的凝膠性能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然焦磷酸鈉及谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加對(duì)MP凝膠性能的影響已有一些研究，但二者復(fù)配對(duì)氧化損傷MP凝膠性能的協(xié)同改善研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究使用脂肪氧化體系制造氧化損傷的肌原纖維蛋白，探究焦磷酸鈉結(jié)合谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改善氧化損傷肌原纖維蛋白凝膠性能的協(xié)同作用，并探討其內(nèi)在機(jī)制，為改善損傷蛋白的功能特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年12月至2020年8月在陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)樓進(jìn)行。

1.1 主要材料與試劑

豬外脊肉（）分3個(gè)批次購于西安市未央?yún)^(qū)潤家超市（n=3），置于冰盒中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，每批次分別剔除肉眼可見的脂肪和結(jié)締組織，逆肌纖維走向切成約100 g肉片，真空包裝后置于-20℃冰箱備用。

脂肪氧合酶（soybean lipoxidase）、水溶性維生素E（Trolox）購于Sigma公司，亞油酸（>95%）購于上海阿拉丁試劑有限公司，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG，1 000 U?g-1）購于北京索萊寶科技有限公司，焦磷酸鈉（PP）購于上海源葉生物科技有限公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；UV2900紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TA.Plus物性測試儀，英國Stable Micro System公司；Fluoro Max-4熒光分光光度計(jì)，日本Horiba公司；CM-5分光測色計(jì)，柯尼卡美能達(dá)（中國）投資有限公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀，英國Malvern Instruments有限公司；FEI Q45+EDAX Octane Prime環(huán)境掃描電子顯微鏡，美國FEI公司；圓二色光譜儀，英國Applied Photophysics公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 MP的提取 將冷凍樣品在4℃解凍，切成長條后參照PARK等[15]的方法進(jìn)行MP的提取，提取過程溫度保持在0—4℃，將提取的MP置于碎冰中并在48 h內(nèi)用完。

1.3.2 MP的氧化以及PP和TG處理 使用25 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（含0.4 mol?L-1NaCl，pH 6.2）將MP膏稀釋并添加脂肪氧化體系（LOS：3 750 U?mL-1的脂肪氧合酶，10 mmol?L-1亞油酸）于4℃氧化12 h。氧化反應(yīng)通過添加Trolox（1 mmol?L-1）終止，隨后將PP（1 mmol?L-1）、TG（E﹕S=1﹕500）以及PP+TG添加到氧化后的MP（30 mg?mL-1）分散液中并在4℃反應(yīng)2 h待用，所提及濃度均為最終濃度。未氧化以及氧化后未經(jīng)PP和TG處理的MP分散液分別作為空白對(duì)照（NonOx）和氧化對(duì)照（Ox）。

1.3.3 圓二色譜測定 不同處理MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化采用圓二色譜光譜儀進(jìn)行分析。使用25 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（含0.4 mol?L-1NaCl，pH 6.2）將MP樣品稀釋至0.2 mg?mL-1，以120 nm?min-1的速率從200 nm掃描至260 nm，累計(jì)掃描3次取其平均值并扣除緩沖液背景，使用CDNN軟件計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.4 內(nèi)源性色氨酸熒光測定 使用25 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（含0.4 mol?L-1NaCl，pH 6.2）將MP樣品稀釋為0.4 mg?mL-1，以283 nm作為激發(fā)波長利用Fluoro Max-4 熒光分光光度儀記錄290—400 nm的發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為1.5 nm。相同條件下記錄樣品緩沖液發(fā)射光譜，并從樣品發(fā)射光譜中扣除，以排除干擾。

1.3.5 粒度測定 在25℃下使用Mastersizer 2000采用靜態(tài)光散射法對(duì)不同處理的MP樣品（2 mg?mL-1）的平均粒徑進(jìn)行分析，將稀釋后的MP樣品分散在蒸餾水（分散介質(zhì)）中，直至遮光效果達(dá)到10%—13%，以避免多次散射。設(shè)置MP顆粒折射率為1.434，分散劑折射率為1.330，重復(fù)測定3次，取其平均值。

1.3.6 SDS-PAGE 使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)MP組分的氧化交聯(lián)、聚合或降解情況進(jìn)行分析。參考CAO等[10]的方法并適當(dāng)修改，使用4%濃縮膠和12%分離膠在還原（+DTT）和非還原（-DTT）條件下進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣量為20 μg，染色脫色后拍照，對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析。

1.3.7 溶解度測定 使用25 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（含0.4 mol?L-1NaCl，pH 6.2）將MP樣品稀釋至2 mg?mL-1，在5 000×條件下離心15 min，采用雙縮脲法測定上清液的蛋白濃度，溶解度計(jì)算公式如下所示：

1.3.8 MP熱誘導(dǎo)凝膠的制備 準(zhǔn)確稱取5 g脫氣后的MP樣品（30 mg?mL-1）于玻璃瓶中，封口后置于水浴鍋中以1℃?min-1的升溫速率從20℃加熱至75℃，并在75℃保溫10 min，取出后立刻置于冰水混合物中冷卻30 min，隨后放入4℃冰箱冷藏過夜。在測定MP樣品凝膠性能之前，需將樣品提前取出在室溫下平衡2 h。

1.3.9 MP凝膠白度的測定 參照XIA等[16]的方法，分光測色計(jì)經(jīng)自檢及零點(diǎn)、白板校正后，進(jìn)行樣品測定。每個(gè)樣品3組平行，取平均值。凝膠白度值按下式計(jì)算：

式中，L*為亮度值；a*為紅度值（正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠）；b*為黃度值（正值表示偏黃，負(fù)值表示偏藍(lán)）。

1.3.10 MP凝膠持水性能的測定 將凝膠置于離心管中于4℃下離心（6 000×，15 min），記錄離心管質(zhì)量（m）以及離心前離心管和凝膠總重量（m1）和離心后去除離心管中水分后總重量（m2）。持水性的計(jì)算公式如下：

WHC（%）=×100

1.3.11 MP凝膠強(qiáng)度的測定 樣品凝膠強(qiáng)度用TA-XT Plus物性分析儀進(jìn)行測定。測定模式：測前速率為5 mm?s-1，測中速率為1 mm?s-1，測后速率為5 mm?s-1；下壓距離為8 mm，探頭型號(hào)為P/0.5。凝膠強(qiáng)度定義為刺破凝膠所需的初始?jí)毫Γ∟）。

1.3.12 MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察 參照張興等[17]的方法并略做修改。將MP凝膠樣品切成小方塊后使用含2.5%（v/v）戊二醛的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol?L-1，pH 7.4）固定4 h，使用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次，然后通過一系列濃度的乙醇溶液（50%、70%、90%、95%、100%）進(jìn)行梯度脫水，每次30 min。在-70℃對(duì)樣品進(jìn)行冷凍干燥，將干燥的樣品噴金后使用掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓15 kV，放大倍數(shù)為4 000。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用Statistix 9.0分析軟件通用線性模型程序（Analytical software, Tallahassee, FL, USA）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。采用LSD全配對(duì)多重比較方法進(jìn)行顯著性分析，值設(shè)置為0.05。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，使用SigmaPlot 12.5軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 PP和TG處理對(duì)氧化損傷MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

使用圓二色譜對(duì)不同處理MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1所示。未氧化MP的CD圖譜在208和222 nm處有兩個(gè)負(fù)峰，表明樣品中-螺旋含量豐富。氧化后這兩個(gè)峰明顯變小，這是因?yàn)檠趸辜∏虻鞍孜膊康某菪Y(jié)構(gòu)解開，導(dǎo)致其-螺旋含量下降[11]。不同添加劑處理對(duì)氧化損傷MP的CD圖譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量產(chǎn)生了明顯影響，PP處理下氧化損傷MP樣品的-螺旋含量顯著提高（<0.05），TG和PP+TG處理下氧化損傷MP的兩個(gè)負(fù)峰大小進(jìn)一步降低，同時(shí)-螺旋含量也進(jìn)一步降低，表明TG交聯(lián)導(dǎo)致MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

2.2 PP和TG處理對(duì)氧化損傷MP三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)色氨酸殘基的熒光特性對(duì)其所處的微環(huán)境極其敏感，經(jīng)常被用來反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。如圖2所示，未氧化MP處于折疊狀態(tài)，色氨酸殘基被包圍在MP內(nèi)部疏水性環(huán)境中，具有較大的熒光強(qiáng)度。與之相比，氧化損傷MP樣品的熒光強(qiáng)度顯著降低，說明氧化導(dǎo)致MP結(jié)構(gòu)展開；TG處理促進(jìn)了氧化損傷MP熒光強(qiáng)度的降低，PP和PP+TG處理均使氧化損傷MP的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，說明添加PP引起了氧化損傷MP構(gòu)象的變化，但這種構(gòu)象變化明顯區(qū)別于TG引起的變化。

NonOx：未氧化 Non-oxidized；Ox：氧化 Oxidized；Ox+PP：氧化+焦磷酸鈉 Oxidized+sodium pyrophosphate；Ox+TG：氧化+谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶 Oxidized+transglutaminase；Ox+PP+TG：氧化+焦磷酸鈉+谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶 Oxidized+sodium pyrophosphate+transglutaminase。下同 The same as below

圖2 不同處理對(duì)MP內(nèi)源性色氨酸熒光的影響

2.3 PP和TG處理對(duì)氧化損傷MP粒徑的影響

與未氧化的MP相比，氧化損傷MP的d3,2值和d4,3值均顯著增加15%以上（<0.05）。PP的加入使氧化損傷MP的d3,2值和d4,3值分別降低了28.0%和32.9%；TG處理使氧化損傷MP的d3,2值和d4,3值分別下降7.0%和8.3%；PP+TG處理下的氧化損傷MP的平均粒徑值分別下降11.6%和19.2%（圖3）。上述結(jié)果表明，PP能顯著降低氧化損傷MP的粒徑，這主要是因?yàn)镻P能解離肌動(dòng)球蛋白為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白。TG對(duì)氧化MP粒徑的影響可能要?dú)w因于其對(duì)MP構(gòu)象的影響（圖1、圖2）。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。下同

2.4 PP和TG處理對(duì)氧化損傷MP交聯(lián)聚集行為的影響

在非還原條件下（圖4-A），與未氧化MP相比，氧化MP的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）和肌動(dòng)蛋白（Actin）的條帶強(qiáng)度明顯降低，同時(shí)在濃縮膠的頂端出現(xiàn)了蛋白聚集體；在還原條件下（圖4-B），氧化損傷MP的MHC和Actin條帶損失完全恢復(fù)，說明氧化誘導(dǎo)的聚合物主要與肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白有關(guān)[6,18]，同時(shí)也表明這些聚合物主要通過二硫鍵的交聯(lián)形成[19]。PP和TG單獨(dú)使用時(shí)均未對(duì)氧化損傷MP的MHC和Actin條帶強(qiáng)度產(chǎn)生顯著影響，PP+TG處理下的MHC和Actin條帶強(qiáng)度顯著減弱。在還原條件下，PP處理下的氧化損傷MP頂端聚集物完全消失，而TG和PP+TG處理的MP頂端聚集物未完全消失，這表明部分聚集體是由TG催化形成的非S-S共價(jià)鍵連接產(chǎn)生，如-（-谷氨?；┵嚢彼岙愲逆I[20]。

2.5 PP和TG處理對(duì)氧化損傷MP溶解度的影響

溶解度可以間接反映蛋白分子間以及蛋白與水分子間的相互作用力。如圖5所示，與未氧化MP相比，氧化處理后MP的溶解度下降了40.0%以上。與氧化損傷MP相比，PP處理后氧化損傷MP的溶解度顯著增加31.5%（<0.05），這一結(jié)果與圖3中PP處理后顯著降低的MP粒徑相符；TG處理下氧化損傷MP的溶解度顯著降低，而PP+TG處理因PP的存在使得氧化損傷MP溶解度增長約20.0%。

圖4 不同處理對(duì)MP交聯(lián)聚集情況的影響

圖5 不同處理對(duì)MP溶解度的影響

2.6 PP和TG處理對(duì)氧化損傷MP凝膠性能的影響

凝膠的持水性指凝膠在外力作用下保持自身水分或者補(bǔ)充水分的能力[21]，它與凝膠內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。與未氧化MP相比，氧化后MP的凝膠白度有所降低，凝膠的持水性能和凝膠強(qiáng)度分別下降了16.0%和23.8%，推測是MP氧化變性導(dǎo)致。PP、TG和PP+TG處理對(duì)氧化損傷MP凝膠的白度均無顯著影響，但是PP以及PP+TG的加入使氧化損傷MP凝膠的持水性分別上升了28.6%和10.4%，單獨(dú)添加TG對(duì)氧化損傷MP凝膠的持水性無顯著影響。PP、TG和PP+TG處理分別使氧化損傷MP的凝膠強(qiáng)度提高了18.8%、58.3%和97.9%（圖6）。

2.7 PP和TG處理對(duì)氧化損傷MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

凝膠的微觀結(jié)構(gòu)與其持水性和凝膠強(qiáng)度密切相關(guān)，不同處理MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)特征如圖7所示。未氧化MP凝膠呈現(xiàn)出一種致密、均勻、連續(xù)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而氧化MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)粗糙多孔、不規(guī)則、不均勻，這也導(dǎo)致氧化MP凝膠的持水性降低（圖6）。與氧化MP凝膠相比，PP和PP+TG處理均使凝膠的微觀結(jié)構(gòu)更加細(xì)膩、均勻，這很好地解釋了二者明顯增強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度及持水性能（圖6）。單獨(dú)添加TG使氧化損傷MP的凝膠結(jié)構(gòu)更加緊致，但蛋白不規(guī)則聚集體分布并不均勻，伴有“溝壑”的形成。因此，TG處理下氧化損傷MP凝膠擁有較好的凝膠強(qiáng)度，但持水性能卻未得到明顯改善（圖6）。

圖6 不同處理對(duì)MP凝膠性能的影響

3 討論

3.1 PP和TG處理改變了氧化損傷MP的結(jié)構(gòu)

MP的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)密切相關(guān)，氧化導(dǎo)致MP的構(gòu)象發(fā)生變化，表現(xiàn)為CD圖譜及內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度的變化。本研究中氧化損傷MP的-螺旋含量減少，同時(shí)伴隨著-折疊、-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲含量的上升。與之類似，CAO等[22]發(fā)現(xiàn)羥自由基氧化體系誘導(dǎo)MP構(gòu)象改變以及-螺旋含量降低。王策等[23]研究發(fā)現(xiàn)羥自由基誘導(dǎo)牛血清蛋白氧化也導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。PP處理下氧化損傷MP的-螺旋含量顯著上升，孫悅[24]研究也發(fā)現(xiàn)在羥自由基氧化體系下PP的加入會(huì)引起MP樣品的-螺旋含量上升。TG和PP+TG處理導(dǎo)致氧化損傷MP的-螺旋含量稍有下降，推測是TG處理催化了MP分子內(nèi)及分子間的共價(jià)交聯(lián)，導(dǎo)致MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這與HERRERO等[25]的研究結(jié)果一致。

由于色氨酸殘基對(duì)其周圍微環(huán)境非常敏感，內(nèi)源性色氨酸熒光特性通常用于反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[26-27]。與CD結(jié)果相對(duì)應(yīng)，氧化后MP因其結(jié)構(gòu)的展開導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，TG處理引起MP中氨基酸殘基間的共價(jià)交聯(lián)使熒光強(qiáng)度進(jìn)一步下降，而PP和PP+TG處理因?yàn)镻P對(duì)氧化MP構(gòu)象的影響導(dǎo)致熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。CAO等[28]研究發(fā)現(xiàn)在羥自由基氧化體系下，PP的加入反而促進(jìn)了氧化引起的MP熒光強(qiáng)度的降低，不一致的原因可能是由氧化誘導(dǎo)體系、PP添加濃度以及添加順序等的不同造成。

圖7 不同處理對(duì)MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

3.2 PP和TG處理改變了氧化損傷MP的交聯(lián)聚集效應(yīng)、提高了其溶解度

氧化會(huì)對(duì)MP分子內(nèi)及分子間的共價(jià)交聯(lián)類型以及交聯(lián)程度造成影響，進(jìn)而對(duì)MP的溶解度、凝膠及乳化性能造成影響。本研究中，脂肪氧化體系誘導(dǎo)MP結(jié)構(gòu)展開，MP分子間S-S形成及疏水相互作用增強(qiáng)、蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集加劇，導(dǎo)致MP的平均粒徑顯著增大、溶解度顯著降低。前人使用次氯酸鈉、羥自由基等不同體系誘導(dǎo)MP氧化也得到了類似的研究結(jié)果[29-31]。TG處理導(dǎo)致氧化損傷MP粒徑略微變小，這可能與TG引起的蛋白分子內(nèi)及分子間共價(jià)交聯(lián)導(dǎo)致的MP構(gòu)象變化有關(guān)。值得關(guān)注的是，本研究中TG對(duì)氧化MP的SDS-PAGE圖譜影響不明顯，但使氧化MP溶解度明顯降低。類似地，LI等[32]在羥基自由基生成系統(tǒng)中研究發(fā)現(xiàn)TG處理導(dǎo)致氧化肌球蛋白溶解度進(jìn)一步損失。PP處理對(duì)氧化損傷MP的SDS-PAGE無明顯影響，但導(dǎo)致其平均粒徑顯著降低，這主要是由于PP的加入引起了肌動(dòng)球蛋白解離為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致MP樣品的顆粒尺寸減小、溶解度增大（圖3、圖5）。CAO等[28]在羥自由基氧化體系中研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2O2濃度在0—3 mmol?L-1時(shí)，PP添加對(duì)MHC和Actin條帶強(qiáng)度無明顯影響；當(dāng)H2O2濃度為10 mmol?L-1時(shí)，添加PP顯著促進(jìn)了蛋白的共價(jià)交聯(lián)；但在所有H2O2濃度條件下，添加PP均顯著提高了MP的溶解度。PP+TG處理導(dǎo)致氧化損傷MP中MHC和Actin條帶強(qiáng)度顯著降低（圖4），說明PP的存在促進(jìn)了TG引起的蛋白組分間的共價(jià)交聯(lián)；但同時(shí)PP的存在使其蛋白粒徑仍低于氧化損傷對(duì)照，因此溶解度增大（圖5）。

3.3 PP和TG處理增強(qiáng)了氧化損傷MP的凝膠性能

氧化后MP的凝膠白度有所下降，推測是蛋白氧化變性導(dǎo)致，HWANG等[33]研究發(fā)現(xiàn)蛋白的凝膠白度與蛋白質(zhì)的變性程度有關(guān)。PP、TG和PP+TG處理均未對(duì)氧化損傷MP的凝膠白度產(chǎn)生負(fù)面影響。與未氧化MP相比，氧化后MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得粗糙、多孔、松散、不規(guī)則，因而其凝膠強(qiáng)度及持水性也顯著下降。類似氧化導(dǎo)致MP凝膠蒸煮損失增大，持水性能下降的結(jié)論已有諸多研究報(bào)道[34-36]。這可能是由于氧化導(dǎo)致蛋白分子內(nèi)和分子間相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而形成蛋白大分子聚集體，導(dǎo)致加熱成膠過程中蛋白展開速度低于交聯(lián)速度，難以形成穩(wěn)定有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而降低了氧化MP的凝膠性能。PP處理后的氧化損傷MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得更加細(xì)膩、光滑、規(guī)則，孔徑也較小，持水性能也顯著增強(qiáng)，凝膠強(qiáng)度也有一定提升，這可能與PP引起的肌動(dòng)球蛋白解離和溶解度增加有關(guān)[28,37-38]。PP與TG復(fù)配處理時(shí)，氧化損傷MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)致密均勻、凝膠性能增強(qiáng)效果也更好，進(jìn)一步解釋了 PP與TG間的協(xié)同作用。

4 結(jié)論

焦磷酸鈉（PP）處理使氧化損傷豬肉肌原纖維蛋白（MP）凝膠的微觀結(jié)構(gòu)更加均勻、細(xì)膩，持水性能顯著增強(qiáng)，但凝膠強(qiáng)度增加幅度有限；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG）處理顯著改善了氧化損傷MP的凝膠強(qiáng)度，但其持水性無明顯改善，其凝膠微觀結(jié)構(gòu)存在粗糙、不規(guī)則、不均勻等問題；PP+TG處理使氧化損傷MP凝膠性能顯著改善，表現(xiàn)為凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加細(xì)密、均勻，凝膠強(qiáng)度和持水性能均顯著增加。綜上，PP和TG協(xié)同使用效果最好，可以有效改善氧化損傷肌原纖維蛋白的凝膠性能。因此，在肉品加工業(yè)中，PP和TG復(fù)配有望改善氧化損傷原料肉的加工性能，提高肉品品質(zhì)和企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

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Synergistic Enhancement of Gelling Properties of Oxidatively Damaged Myofibrillar Protein by Sodium Pyrophosphate and Transglutaminase

LI BaoLing, LI Ying, FAN Xin, MA WenHui, CAO YunGang

School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021

【】This study was designed to explore the effects of sodium pyrophosphate (PP), transglutaminase (TG), and their combination (PP+TG) on the gelling properties of oxidatively damaged pork myofibrillar protein (MP), which was expected to provide a theoretical basis for the enhancement of functional properties of oxidatively damaged proteins. 【】 MP was extracted from porcinemuscle, and oxidized using a lipoxygenase-linoleic acid oxidation system. Subsequently, PP (1 mmol?L-1), TG (E:S=1:500) and their combination (PP+TG) were added and incorporated into the oxidatively damaged MP systems, respectively. The effects of different additive treatments on the secondary and tertiary structures of oxidatively damaged MP solution were investigated by circular dichroism spectroscopy and endogenous tryptophan fluorescence, respectively. The changes of cross-linking and aggregation of MP with different treatments were investigated through measuring particle size, solubility and SDS-PAGE. The textural properties of MP gels were measured by physical property tester, and the water holding capacity (WHC) was determined by centrifugation method. The whiteness of the MP gels was measured by spectrophotometer, and the microstructure of the MP gels was observed by a scanning electron microscopy. 【】The results showed that PP treatment significantly changed the protein conformation, reduced the mean particle size and enhanced the solubility of oxidatively damaged MP, and obviously enhanced the gel strength and water holding capacity (<0.05). The microstructure of gel with PP treatment was more regular, uniform and delicate than that of oxidatively damaged MP gel. TG treatment significantly improved the gel strength, but had no positive effect on the water holding capacity. While the MP gel with TG treatment had a compact microstructure with small pores, there were still irregular shape and rough surface. On the whole, the combination of PP and TG had the best synergistic effect. The gel strength and water holding capacity of oxidatively damaged MP under PP+TG treatment were significantly enhanced, and the gel performance was obviously better than that of non-oxidized MP. 【】 The combination of PP and TG could effectively improve the gelling properties of oxidatively damaged MP.

myofibrillar protein; sodium pyrophosphate; transglutaminase; oxidation; gelling properties

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.014

2020-11-05；

2021-01-07

國家自然科學(xué)基金青年基金（31801480）、陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2019JQ-397）

李保玲，E-mail：1650608180@qq.com。通信作者曹云剛，E-mail：caoyungang@sust.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）