龍久鈴，朱秋勁，白晶，陳玉芹，楊睿穎,余順波，葉春

1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油菜研究所, 貴州 貴陽 550008

0 引言

蘇麻(PerillafrutescensBritt. var.frutescens)，系唇形科紫蘇屬一年生草本自花授粉植物，是一種優(yōu)質(zhì)的藥食兩用特色植物[1].蘇麻餅粕是蘇麻籽榨油后剩余的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸種類豐富，含有人體所需的8種必需氨基酸，是一種良好的植物蛋白資源[2].目前，油脂企業(yè)產(chǎn)生的大量蘇麻餅粕加工利用途徑單一，主要用作飼料、肥料、燃料等廉價原料，少量在面包、調(diào)味料等方面得以開發(fā)利用[3].由于蘇麻餅粕富含優(yōu)質(zhì)蛋白，近年來受到業(yè)界青睞：李榮等[4]利用微波輔助分步酶解紫蘇餅粕，制備出高品質(zhì)、高產(chǎn)率、高水解度及低成本的紫蘇鮮味肽；徐世濤等[5]采用不同酶解方法制備的蘇麻餅粕多肽，滋味、口感良好，營養(yǎng)價值高；盛彩虹等[6]采用酸性乙醇-水溶劑法脫除紫蘇粕中植酸、單寧等物質(zhì)后，用堿性蛋白酶酶解紫蘇粕，制得的紫蘇肽含量達63.03%，其中相對分子質(zhì)量小于1000的組分占85.3%.另有學(xué)者[7-8]研究發(fā)現(xiàn)，蘇麻多肽具有較好的抗氧化活性.

微生物發(fā)酵法具有將產(chǎn)酶與酶解合二為一的特點,且制備的多肽苦味較弱，故逐漸成為研究熱點.研究者[9]發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵谷物粉可獲得具有抗氧化能力的多肽；此外，通過固態(tài)發(fā)酵芝麻粕和核桃粕得到的多肽抗氧化能力很強[10-11].黃永鋒等[12]研究發(fā)現(xiàn)，通過米曲霉單菌發(fā)酵豆粕可制備大豆肽，米曲霉在發(fā)酵中主要產(chǎn)生中性蛋白酶[13].目前，蘇麻多肽的研究大多采用酶解法，固態(tài)發(fā)酵蘇麻餅粕制備多肽的研究鮮見報道.

本研究擬以米曲霉AS3.863 (AspergillusoryzaeAS3.863) 為菌種，通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵制備蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物的工藝，并測定其多肽含量及1, 1-二苯基-2-苦基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除率，以提高蘇麻餅粕的經(jīng)濟價值，為高效利用蘇麻籽副產(chǎn)物的植物蛋白資源及蘇麻餅粕的深加工提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇麻餅粕，貴州省油菜研究所提供；米曲霉 AS3.863(AspergillusoryzaeAS3.863)，購于廣東省微生物菌種保藏中心；DPPH，東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)；牛血清白蛋白，索萊寶科技有限公司產(chǎn)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，上海博微生物科技有限公司產(chǎn)；三氯乙酸，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)；NaOH、酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅，均為分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司產(chǎn).

1.2 主要儀器與設(shè)備

DMEX20型顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司產(chǎn)；QE-300型高速粉碎機，浙江屹立工貿(mào)有限公司產(chǎn)；SJ-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇潔醫(yī)療器械(蘇州)有限公司產(chǎn)；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司產(chǎn)；LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)；PR124ZH/E型電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司產(chǎn)；TD5MD型臺式低速離心機，長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)；HJ-6B型雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇區(qū)西城新瑞儀器廠產(chǎn)；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)；CTFD-12S 型真空冷凍干燥機，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司產(chǎn)；SpectraMAX190 型酶標(biāo)儀，美國 Molecular Devices 公司產(chǎn).

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化及孢子懸浮液的制備首先按菌種說明書活化所購米曲霉，將活化后的菌種置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至孢子成熟鋪滿斜面后，用無菌水將孢子洗滌倒入無菌三角瓶中；然后用滅菌后的脫脂紗布濾去菌絲片段，制得孢子懸浮液；最后用血球計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)節(jié)孢子濃度至2×106～5×106CFU/mL，置于4 ℃冰箱備用.

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵取20 g脫脂粉碎后過40目篩的蘇麻餅粕粉加入250 mL三角瓶中，再加入適量蒸餾水用無菌玻璃棒攪拌均勻，封口后于121 ℃條件下滅菌20 min，在超凈工作臺按接種量(2.5%～12.5%)接入孢子懸浮液并用無菌玻璃棒攪拌均勻，在實驗設(shè)計條件下進行發(fā)酵.發(fā)酵完畢后將樣品取出，于121 ℃條件下滅菌10 min，在50 ℃條件下干燥48 h，即得蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物，將其粉碎后，于低溫密封保存?zhèn)溆?

1.3.3 單因素試驗設(shè)計1)發(fā)酵時間.在發(fā)酵溫度28 ℃、接種量2.5%及液料比(V(蒸餾水)∶m(蘇麻餅粕))1∶1條件下，考查發(fā)酵時間(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h)對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影響.

2)發(fā)酵溫度.在發(fā)酵時間48 h、接種量2.5%及液料比1∶1條件下，考查發(fā)酵溫度(25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃和37 ℃)對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影響.

3)接種量.在發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度28 ℃及液料比1∶1條件下，考查接種量(2.5%、5.0%、7.5%、10.0%和12.5%)對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影響.

4)液料比.在發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度28 ℃及接種量5.0%條件下，考查液料比(0.6∶1、0.8∶1、1∶1、1.2∶1、1.4∶1)對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影響.

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計應(yīng)用 Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗確定的最佳因素水平基礎(chǔ)上進行四因素三水平響應(yīng)面試驗.選擇發(fā)酵時間(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)、液料比(D)為自變量，以蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量(Y1)和DPPH自由基清除率(Y2)為響應(yīng)值，采用 Design Expert V 8.0.6 軟件進行響應(yīng)面試驗，各因素及水平見表1.

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平表Table 1 The factors and levels Table of response surface test

1.3.5 多肽含量的測定采用秦衛(wèi)東等[14]的方法，其中多肽含量以酸可溶性多肽含量計.取4 g蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物樣品 (精確至0.000 1 g)加入40 mL蒸餾水中，磁力攪拌30 min，于4000 r/min條件下離心10 min，取一定體積上清液加入等體積的體積分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液，混勻后于4000 r/min條件下離心10 min，去除酸不溶性蛋白和長鏈肽沉淀.取1 mL上清液，加4 mL雙縮脲試劑混勻，避光靜置30 min后，于540 nm波長處測其吸光度，空白為蒸餾水.以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，配制成質(zhì)量濃度為0 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

多肽含量按照下式計算：

式中，c為上清液中多肽的質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)，v為溶解樣品提取多肽所用蒸餾水體積/mL，m為原料發(fā)酵后稱取測定的樣品質(zhì)量/g.

1.3.6DPPH自由基清除率的測定參考N.Chen等[15]的方法，并稍作修改.取4 g蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物樣品 (精確至0.000 1 g) 加入40 mL蒸餾水中，磁力攪拌30 min，于4000 r/min條件下離心10 min，取離心后上清液進行20倍稀釋作為待測樣液.分別吸取1.0 mL待測樣液和1.0 mL 濃度為0.1 mmol/L的DPPH-無水乙醇溶液于試管中，渦旋混勻后，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測其吸光度，并用無水乙醇調(diào)零.以待測樣品溶液和無水乙醇混合后的吸光度為對照組.DPPH-無水乙醇溶液和超純水混合后的吸光度為空白組.DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中，A1為樣品組的吸光度,A2為對照組的吸光度,A3為空白組的吸光度.

IC50表示DPPH自由基清除率為50%時抗氧化肽的質(zhì)量濃度/(mg·mL-1).調(diào)整蘇麻餅粕抗氧化肽的質(zhì)量濃度，分別測其DPPH自由基清除率，選取DPPH自由基清除率在25%～85%范圍的蘇麻餅粕抗氧化肽質(zhì)量濃度，再與DPPH自由基清除率通過Origin 2018軟件進行線性擬合，即可求得IC50值.

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析所有實驗均重復(fù) 3 次，以SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析，以O(shè)rigin 2018 作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 發(fā)酵時間發(fā)酵時間對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影響如圖1所示.由圖1可看出，米曲霉固態(tài)發(fā)酵蘇麻餅粕的發(fā)酵產(chǎn)物多肽含量隨發(fā)酵時間的延長呈先增加后降低趨勢.當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，多肽含量達最高值(44.65±0.74) mg/g；之后，多肽含量隨發(fā)酵時間的延長而降低.這可能是因為繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生了一些降解肽的酶類，導(dǎo)致多肽含量降低.發(fā)酵產(chǎn)物中的多肽對 DPPH 自由基的清除能力隨發(fā)酵時間的延長呈先增強后減弱趨勢.當(dāng)發(fā)酵時間為36 h時，DPPH自由基清除率達到最高值(84.76±1.05)%，當(dāng)發(fā)酵時間為48 h，為(83.84±0.95)%；之后，DPPH 自由基清除率隨發(fā)酵時間的延長開始下降.綜合考慮，選擇48 h作為最佳發(fā)酵時間進行下一步試驗.

圖1 發(fā)酵時間對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物 多肽含量及DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on peptide content and DPPH free radical scavenging rate of antioxidant peptides crude extract from Perilla seed meal

2.1.2 發(fā)酵溫度發(fā)酵溫度對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影響如圖2所示.由圖2可看出，多肽含量及DPPH自由基清除率均隨發(fā)酵溫度的升高呈先增加后降低趨勢.當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時，多肽含量及DPPH自由基清除率均達到最高值，分別為(49.81±1.65) mg/g和(77.66±0.96)%.這是因為該米曲霉的最適生長溫度是28 ℃，溫度過高或過低都會影響菌株的生長代謝與酶活性.因此，選擇28 ℃作為最佳發(fā)酵溫度進行下一步試驗.

圖2 發(fā)酵溫度對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物 多肽含量及DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on peptide content and DPPH free radical scavenging rate of antioxidant peptides crude extract from Perilla seed meal

2.1.3 接種量接種量對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影響如圖3所示.由圖3可以看出，多肽含量及DPPH自由基清除率均隨接種量的增加呈先增加后降低趨勢.當(dāng)接種量為5.0%時，多肽含量及DPPH自由基清除率均達到最大值，分別為(36.83±0.43) mg/g和(85.5±0.71)%.這是因為接種量的大小決定了米曲霉在發(fā)酵過程中的生長繁殖速度：接種量過大會導(dǎo)致供氧不足，影響產(chǎn)物合成；接種量過小則不能充分利用餅粕蛋白產(chǎn)多肽，發(fā)酵時間越長，發(fā)酵效率越低.該結(jié)論與W.X.Wu等[16]的研究結(jié)果一致.因此，選擇5.0%作為最佳接種量進行下一步試驗.

圖3 接種量對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物 多肽含量及DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on peptide content and DPPH free radical scavenging rate of antioxidant peptides crude extract from Perilla seed meal

2.1.4 液料比液料比對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量及DPPH自由基清除率的影響如圖4所示.由圖4可以看出，多肽含量及DPPH自由基清除率均隨液料比的增加呈先增加后降低趨勢.當(dāng)液料比為1∶1時，多肽含量達到最大值(38.33±1.04) mg/g，并顯著高于其他組(P<0.05).這可能是因為當(dāng)水分含量較低時，不利于固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中米曲霉的生長，菌體代謝速率降低，從而影響多肽產(chǎn)量；隨著水分含量的增加，米曲霉能充分利用固態(tài)培養(yǎng)基中的水分和營養(yǎng)物質(zhì)，從而具有更好的發(fā)酵產(chǎn)多肽效果；但當(dāng)水分含量過高時，會導(dǎo)致固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的透氣性差，不利于米曲霉的繁殖及產(chǎn)酶，還可能積累對米曲霉生長不利的物質(zhì).因此，選擇1∶1 作為最佳液料比進行下一步試驗.

圖4 液料比對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物 多肽含量及DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-battery ratio on peptide content and DPPH free radical scavenging rate of antioxidant peptides crude extract from Perilla seed meal

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果及回歸方程方差分析響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計與結(jié)果見表2.利用Design Expert v 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到各因素與多肽含量、DPPH自由基清除率的二次回歸方程如下：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

Y1=59.18+2.71A-0.74B+0.82C+

1.84D-0.45AB+0.25AC+0.36AD-

0.030BC+0.002 5BD-0.21CD-12.65A2-

3.58B2-0.67C2-4.27D2

Y2=82.18-1.57A+2.58B+0.32C-

2.01D-0.22AB-0.86AC+0.58AD+

0.002 5BC+0.020BD-0.023CD-

0.67A2-4.97B2-1.50C2-1.76D2

多肽含量回歸模型顯著性檢驗及方差分析見表3.由表3可知，多肽含量的二次多項式擬合模型F值為14.95，P<0.000 1，表明此回歸模型極顯著；失擬項檢驗P值為0.085(P>0.05)，失擬項不顯著，表明模型可信度較高，此試驗方法可靠性強.其中，一次項A與二次項A2、B2、D2對多肽含量的影響極顯著，一次項D影響顯著，交互項均不顯著.多肽含量回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.937 3，大于0.9，表明模型對試驗擬合度良好，較好地反映了多肽含量與發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、液料比的關(guān)系.結(jié)合P值及F值可知，發(fā)酵時間對蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物的多肽含量影響最大，其次是液料比和接種量，發(fā)酵溫度影響最小.

表3 多肽含量回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of the regression model of peptide content

表4 DPPH自由基清除率回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table 4 Significance test and variance analysis of the regression model of DPPH free radical scavenging rate

2.2.2 響應(yīng)面分析響應(yīng)面圖可以較準(zhǔn)確地展示響應(yīng)值與試驗參數(shù)水平之間的關(guān)系.響應(yīng)面圖的坡度越陡，表示指標(biāo)的變化對響應(yīng)值影響越大；反之，若響應(yīng)面的坡度越緩，則表示該指標(biāo)的變化對響應(yīng)值影響越小[17].

1)蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物多肽含量的響應(yīng)面分析.為考查交互項對蘇麻餅粕發(fā)酵抗氧化肽粗提物多肽含量的影響，在固定2個因素不變的條件下，對模型進行降維分析.各因素交互作用對多肽含量影響的響應(yīng)曲面圖如圖5所示.由圖5可以看出，多肽含量先隨各因素的增大而增大；當(dāng)增大到極值后，多肽含量又隨因素的增大而逐漸減小.與單因素試驗結(jié)果一致.

圖5 各因素交互作用對多肽含量影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface diagram of the influence of the interaction of various factors on the content of peptides

2)蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物DPPH自由基清除率的響應(yīng)面分析.各因素交互作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖如圖6所示.由圖6可以看出，在固定發(fā)酵溫度與液料比的條件下，蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物的DPPH自由基清除率先隨發(fā)酵時間與接種量的增加而升高，并在一定條件下達到峰值，之后隨發(fā)酵時間與接種量的增加而減少，這表明并非發(fā)酵時間越長，接種量越高，抗氧化肽的抗氧化活性越強.在實際加工生產(chǎn)中，要在最合適的發(fā)酵時間選擇最優(yōu)的接種量進行發(fā)酵，才能得到抗氧化活性最佳的蘇麻餅粕抗氧化肽.

圖6 各因素交互作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface diagram of the influence of the interaction of various factors on DPPH free radical scavenging rate

綜上所述，米曲霉固態(tài)發(fā)酵蘇麻餅粕產(chǎn)抗氧化肽的最佳工藝條件為:發(fā)酵時間47.87 h，發(fā)酵溫度28.44 ℃，接種量5.56%，液料比0.98∶1.在此工藝條件下，預(yù)測多肽含量和DPPH自由基清除率分別為(58.89±0.14) mg/g和(82.65±1.31)%.

2.3 驗證實驗結(jié)果分析

以2.2確定的最佳工藝進行驗證實驗，每份樣品制作3份，每個指標(biāo)測3次，結(jié)果取平均值.根據(jù)實際生產(chǎn)將工藝條件調(diào)整為發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度 28 ℃，接種量5.5%，液料比1∶1，得到米曲霉固態(tài)發(fā)酵蘇麻餅粕的多肽含量為(58.75±1.12) mg/g，比發(fā)酵前增加了2.66倍；DPPH自由基清除率為(82.13±1.54)%，比發(fā)酵前增加了0.23倍.實際結(jié)果與預(yù)測值差異均不顯著(P>0.05)，表明通過響應(yīng)面設(shè)計米曲霉固態(tài)發(fā)酵蘇麻餅粕產(chǎn)抗氧化肽可靠穩(wěn)定，可作為后續(xù)實踐的理論支撐.

2.4 蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物的DPPH自由基清除能力

蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物的DPPH自由基清除率如圖7所示.由圖7可看出，蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率之間呈線性關(guān)系，通過擬合方程計算得到DPPH自由基IC50為0.17 mg/mL.R.He等[18]利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕制備的菜籽肽DPPH自由基IC50為165 μg/mL；邢瀚文等[19]利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵羅非魚魚皮制備的膠原蛋白肽DPPH自由基IC50為2.37 mg/mL；王海燕等[20]利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵制曲結(jié)合成曲水解制備的大豆抗氧化肽DPPH自由基的IC50為0.29 mg/mL.本研究所得蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物的DPPH自由基IC50值低于膠原蛋白肽和大豆肽，與菜籽肽相似，具有較高的研究價值.

圖7 蘇麻餅粕抗氧化肽的DPPH自由基清除率Fig.7 The DPPH free radicals scavenging rate of the anti-oxidant peptides from the Perilla seed meal

3 結(jié)論

本文以米曲霉為發(fā)酵菌株，采用固態(tài)發(fā)酵方法制備了蘇麻餅粕抗氧化肽粗提物，對影響米曲霉固態(tài)發(fā)酵蘇麻餅粕產(chǎn)抗氧化肽的發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、液料比4個因素進行了單因素試驗，并在此基礎(chǔ)上進行了響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳固態(tài)發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度28 ℃，接種量5.5%，液料比1∶1.在該條件下，蘇麻餅粕發(fā)酵產(chǎn)物的多肽含量為(58.75±1.12)mg/g，比發(fā)酵前增加了2.66倍，DPPH自由基清除率為(82.13±1.54)%，比發(fā)酵前增加了0.23倍，DPPH自由基IC50為0.17 mg/mL.本文為微生物固態(tài)發(fā)酵蘇麻餅粕產(chǎn)抗氧化肽等相關(guān)研究提供了數(shù)據(jù)支撐和依據(jù)，但本文僅在實驗室環(huán)境下進行了少量研究，后續(xù)將進一步研究大批量蘇麻餅粕的固態(tài)發(fā)酵，從而為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考；另外，蘇麻餅粕抗氧化多肽是一種天然活性肽，有待進一步分離純化，并需對其生物活性進行深入研究.