徐遠芳，張祺玲，周毅吉，毛青秀，李文革，陳石新，鄧鋼橋，彭 玲,

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學院核農(nóng)學與航天育種研究所，湖南長沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410125；3.生物輻照技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南長沙 410125；4.中南糧油食品科學研究院有限公司，湖南長沙 410100；5.常德市犟哥生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖南常德 415300）

食用葛根粉是從豆科葛屬（PuerariaDC.）植物粉葛（P.thomsoniiBenth）的塊根中提取的，經(jīng)過粉碎、分離、過濾、干燥而成的粉狀產(chǎn)品[1]。葛根是我國衛(wèi)生部首批批準的藥食兩用植物，享有“南參北葛”、“亞洲人參”等美譽[2]。葛根粉中淀粉含量很高，是其主要食用成分，此外還含有豐富的異黃酮、膳食纖維、氨基酸、礦質(zhì)元素等成分[3]，主要活性成分是葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類成分，對心血管疾病[4?5]、糖尿病[6]、癌癥[7]等疾病有治療作用[8]。葛根粉具有潔白細膩、清香可口、淀粉糊透明度高、粘度穩(wěn)定性好等特點，既可直接沖泡食用，也可加工成保健食品，市場前景廣闊[9]。葛根粉在加工儲存過程中，微生物含量容易超標，有必要對其進行合理的滅菌，以確保產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量。

葛根粉中異黃酮類等活性成分具有熱不穩(wěn)定性[10]，不適合采用傳統(tǒng)的高溫方法進行滅菌。輻照是一種冷加工方法，采用適宜劑量輻照能有效控制食品中污染的微生物，并且不會引起產(chǎn)品營養(yǎng)及功能活性成分的明顯破壞，是解決食用葛根粉微生物超標問題的有效方法。目前，大部分市售保健食品都是通過輻照進行滅菌的[11]。電子束輻照是輻照技術(shù)應(yīng)用的重要形式，與60Co-γ射線輻照相比，電子束輻照具有操作簡單、使用安全，能量利用率高，輻照效率高，成本低等優(yōu)勢[12]。近年來，隨著電子加速器設(shè)備的不斷改進和完善，電子束流的穩(wěn)定性大大提高，電子束輻照技術(shù)在社會經(jīng)濟效益和加工能力方面的優(yōu)勢逐步顯現(xiàn)，有取代60Co-γ射線輻照成為輻照產(chǎn)業(yè)主流的趨勢[13]。關(guān)于電子束輻照技術(shù)在葛根粉輻照滅菌中的應(yīng)用研究，目前國內(nèi)外暫無相應(yīng)的報道。

本文以食用葛根粉為對象，采用不同劑量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 k Gy）電子束進行輻照處理，以食用葛根粉中微生物存活數(shù)（菌落總數(shù)、霉菌數(shù)、大腸菌群數(shù)）、一般營養(yǎng)成分（水分、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、淀粉、膳食纖維、多糖、維生素B1、維生素B2）、異黃酮類成分（葛根素、大豆苷、大豆苷元）、物理性能（白度、凍融穩(wěn)定性、溶解度、膨潤力）以及抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、羥自由基（·OH）清除能力、還原力）為評價指標，研究電子束輻照對食用葛根粉微生物的殺菌效果及品質(zhì)的影響，旨在為電子束輻照技術(shù)在葛根粉及其相關(guān)產(chǎn)品中微生物的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用葛根粉 常德市犟哥生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，粉狀，顏色暗白、略帶微黃；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葛根素對照品（含量以99.71%計）、大豆苷對照品（含量以99.46%計）、大豆苷元對照品（含量以99.99%計） 成都曼思特生物科技有限公司；D-無水葡萄糖對照品（含量以99.8%計） 中國食品藥品檢定研究院；氯化鈉、石油醚、硫酸鉀、濃硫酸、鹽酸等分析純、正己烷（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司。

IS1020電子束輻照加工系統(tǒng)（10 MeV/20 kW）同方威視技術(shù)股份有限公司；MS304s/01電子分析天平 瑞士梅特勒公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；BCM-1000超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；MJ霉菌培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KDN-12D 12孔數(shù)顯消化爐 上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；KQ-300VDB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；KT 200 FOSS凱氏定氮儀蒸餾器 美國培安公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；SHA-CD水浴恒溫振蕩器常州澳華儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Allgera 64低溫離心機 美國貝克曼公司；WSB-L白度計 上海儀電物理光學儀器有限公司；DW-40L508立式低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津公司；e2695液相色譜儀 美國沃特世公司；LC 20AT液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗樣品準備 將食用葛根粉用透明PE自封袋進行分裝，每袋50 g，共18份，用于微生物檢測；每袋250 g，共18份，用于理化指標檢測。樣品分裝完成后即送至輻照。

1.2.2 電子束輻照 電子束輻照在湖南湘華華大生物科技有限公司進行，電子加速器輸出功率為10 kW，電子束流掃描速率為220次/s，電子束能量為10 MeV。為保證樣品受到均勻照射，將樣品平鋪放置于電子束輻照專用金屬托盤上，厚度約3～4 cm，不同電子束輻照劑量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 k Gy）通過控制托盤在電子束下的傳輸速度來實現(xiàn)，輻照完成后室溫儲存待測。

1.2.3 微生物存活數(shù)的測定 按GB 4789.2-2016方法測定食用葛根粉菌落總數(shù)；按GB 4789.15-2016方法測定霉菌數(shù)；按GB 4789.3-2016方法測定大腸菌群數(shù)。

1.2.4 一般營養(yǎng)成分含量的測定 食用葛根粉水分含量：按GB 5009.3-2016方法測定；蛋白質(zhì)含量：按GB 5009.5-2016方法測定；脂肪含量：按GB 5009.6-2016方法測定；灰分含量：按GB 5009.4-2016方法測定；膳食纖維含量：按GB 5009.88-2014方法測定；淀粉含量：按GB 5009.9-2016方法測定；維生素B1含量：按GB 5009.84-2016方法測定；維生素B2含量：按GB 5009.85-2016方法測定。

1.2.5 多糖含量的測定 根據(jù)李定芬等[14]的方法進行測定。精密稱取經(jīng)105℃葡萄糖對照品0.0060 g置50 mL容量瓶中，加純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.12 mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL對照品溶液置于1 mL比色管，體積不足1.0 mL者，加純水補足至1.0 mL。

精密稱取食用葛根粉0.0800 g，置于150 mL圓底燒瓶中，精密加純水100 mL，稱重，加熱回流提取1 h后取出，放冷，再次稱重，用純水補足減失重量，搖勻，過濾，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液0.5 mL，備用。

取對照品溶液和供試品溶液0.5 m1置于25 mL比色管中，加水補足至1 mL，分別加入5%的苯酚溶液2 mL，搖勻，再分別加入濃硫酸7 mL，搖勻后置沸水浴中加熱15 min后取出，于冷水中降至室溫，于波長490 nm處測定吸光度。

1.2.6 異黃酮類成分含量的測定 根據(jù)常飛等[15]的方法進行測定。精密稱取食用葛根粉1.000 g，加入到50 mL容量瓶中，用30%乙醇（V/V）定容，置于40℃恒溫水浴中超聲提取60 min，冷卻至室溫，用30%乙醇再次定容，搖勻，用0.25μm濾膜過濾，濾液用于HPLC分析。分別制備葛根素、大豆苷、大豆苷元對照品的標準曲線，測定樣品中對應(yīng)異黃酮類成分的吸收峰面積，以對照品的標準曲線為對照計算樣品中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量。

色譜條件：色譜柱Athena-C18（4.6 mm×250 mm,5μm），以甲醇和水為流動相，按照表1的洗脫條件進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進樣量5μL，檢測波長250 nm。

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Elution conditions of HPLC

1.2.7 物理性能的測定

1.2.7.1 白度的測定 按GB/T 22427.6-2008方法測定。

1.2.7.2 溶解度和膨潤力的測定 根據(jù)侯蕾等[16]的方法進行測定。精密稱取食用葛根粉1 g（精確至0.001 g），用純水配制成50 mL質(zhì)量分數(shù)為2%的葛根粉溶液，置于85℃恒溫水浴并攪拌30 min，水浴后倒入離心管進行離心(3000 r/min,15 min)，取上清液置于105℃烘箱進行烘干稱重，此部分即為水溶性葛根粉的質(zhì)量，離心管中沉淀部分為膨脹葛根粉，分別按公式（1）和（2）計算葛根粉的溶解度和膨潤力。

1.2.7.3 凍融穩(wěn)定性的測定 根據(jù)侯蕾等[16]方法進行測定。配制質(zhì)量分數(shù)3%的食用葛根粉溶液50 mL，沸水浴15 min（加熱過程中需保持溶液體積不變），在室溫下冷卻，準確移取一定質(zhì)量葛根粉糊至50 mL塑料離心管，置于?20℃低溫保存箱冷凍24 h，取出后在室溫下解凍，于4000 r/min離心20 min（如無水析出，反復凍融至有水析出），用濾紙過濾，稱取濾紙上沉淀物的質(zhì)量，按公式（3）計算析水率。

1.2.8 食用葛根粉抗氧化活性的測定 根據(jù)吳瓊等[17]的方法進行樣品制備和抗氧化能力的測定。稱取食用葛根粉2.0 g，加入80 mL體積分數(shù)70%乙醇溶液，置于80℃恒溫水浴鍋中避光浸提30 min，提取液在3000 r/min離心10 min，取上清液作為抗氧化成分提取液，置于冰箱冷藏備用。

1.2.8.1 DPPH自由基清除率測定 用乙醇配制0.2 mmol/L DPPH溶液，避光保存?zhèn)溆?。?.0 mL上述提取液與3.0 mL DPPH溶液混合均勻，避光放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度AX。同時，取3.0 mL乙醇與3.0 mL DPPH溶液混勻，避光放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度A0，同時以乙醇作為空白。按照公式（4）計算DPPH自由基清除率：

1.2.8.2 ·OH清除率測定 在試管中加入9.0 mmol/L FeSO4、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2.0 mL，再加入2.0 mL提取液和2.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，混勻，避光置于37℃水浴10 min，于波長510 nm處測定吸光度AX。試管中以純水水代替H2O2測定吸光度AX0，以純水替代提取液測定吸光度A0，同時以蒸餾水做空白調(diào)零。按公式（5）計算·OH清除率。

1.2.8.3 還原力測定 配制0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液（phosphate buffer saline,PBS），在試管中加入PBS、提取液、質(zhì)量分數(shù)1%鐵氰化鉀溶液各2 mL，混勻于50℃水浴20 min，冷卻至室溫，加入2 mL質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸溶液，混勻，使反應(yīng)終止。取反應(yīng)液5 mL于試管中，加入純水4 mL，質(zhì)量分數(shù)0.1% FeCl3溶液0.5 mL，混勻并置于暗室反應(yīng)30 min，于波長700 nm處測定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）中的Duncan檢驗在P<0.05顯著水平上進行均值差異性相關(guān)性分析，結(jié)果以3次重復實驗所得數(shù)據(jù)的±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照對食用葛根粉微生物存活數(shù)的影響

食用葛根粉中初始菌落總數(shù)為2.2×103CFU/g，霉菌數(shù)為5.0×10 CFU/g，大腸菌群數(shù)為15.0 MPN/g。不同劑量電子束輻照后食用葛根粉中微生物存活數(shù)見表2，經(jīng)2.5 kGy電子束輻照后，樣品菌落總數(shù)降至4.0×102CFU/g，霉菌數(shù)小于10 CFU/g，大腸菌群數(shù)為0.36 MPN/g。7.5 kGy輻照即可有效控制其微生物存活數(shù)。因此，電子束輻照對食用葛根粉殺菌效果顯著，隨著輻照劑量增加，污染微生物存活數(shù)逐漸降低。根據(jù)食用葛根粉菌落總數(shù)的對數(shù)值（lgN）與輻照劑量的擬合方程（y=?0.3731x+3.4065，R2=0.9860），求出電子束輻照對食用葛根粉菌落總數(shù)殺菌劑量的D10值為2.68 kGy。這與電子束輻照其他同類產(chǎn)品的研究結(jié)果相似，趙巧麗等[18]、陳志軍等[19]分別研究得出電子束輻照對松花粉、靈芝孢子粉菌落總數(shù)的殺菌劑量D10值分別為1.94和2.17 kGy。D10值是一個重要的輻照技術(shù)參數(shù)，它是指殺滅90%的微生物所需的輻照劑量[20]，即表明2.68 k Gy劑量電子束輻照可使食用葛根粉中菌落總數(shù)的存活數(shù)降低1個數(shù)量級。

表2 電子束輻照食用葛根粉微生物存活數(shù)的影響Table 2 Effectsof electron beam irradiation on mcrobial survival of ediblekudzu root powder

2.2 電子束輻照對食用葛根粉一般營養(yǎng)成分的影響

電子束輻照對一些食品營養(yǎng)成分有一定的影響，不同種類營養(yǎng)成分的輻射敏感性有差異，主要取決于輻照食品的種類、輻照環(huán)境和輻照劑量。由表3可知，不同劑量電子束輻照對食用葛根粉水分、灰分、蛋白質(zhì)以及淀粉的含量無明顯影響（P>0.05），這與魏會惠等[21]對電子束輻照小麥粉的研究結(jié)論一致。食用葛根粉脂肪含量為0.10 g/100g，屬于低脂食品，輻照后樣品脂肪含量顯著高于對照組樣品（P<0.05），與輻照劑量無明顯的相關(guān)性。究其原因，可能是由于電子束輻照在加速葛根粉中的蛋白質(zhì)氫鍵的斷裂，使其分解出部分氨基酸的同時，又加速了氨基酸的脫氨、脫羧作用，生成各種脂肪酸，從而使輻照后樣品脂肪含量增加。輻照樣品多糖含量顯著高于對照組樣品（P<0.05），2.5～10.0 kGy范圍內(nèi)隨著輻照劑量增大，樣品多糖含量逐漸增加，這與朱佳廷等[22]關(guān)于輻照螺旋藻粉多糖含量變化的研究結(jié)論相似，究其原因，是由于電子束輻照使樣品中纖維素等大分子發(fā)生了降解。輻照后樣品膳食纖維的含量減少，2.5～10.0 k Gy時輻照樣品顯著低于對照組樣品（P<0.05）。李楊等[23]研究輻照對豆渣可溶性膳食纖維結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻照劑量增加會使膳食纖維發(fā)生降解，纖維結(jié)構(gòu)變得疏松膨脹。Fernandes等[24]報道了電子束輻照后兩種干蘑菇中不溶性纖維和總纖維量顯著降低，這與本研究結(jié)論相似。維生素B1和B2都是能量代謝中不可缺少的成分。輻照對樣品維生素B1與維生素B2的含量影響不大，與輻照劑量無線性相關(guān)性。因而，采用不超過12.5 kGy電子束輻照對食用葛根粉的一般營養(yǎng)成分含量無明顯的破壞作用，不會影響其營養(yǎng)品質(zhì)。

表3 電子束輻照對食用葛根粉一般營養(yǎng)成分的影響Table 3 Effects of electron beam irradiation on normal nutrient of edible kudzu root powder

2.3 電子束輻照對食用葛根粉異黃酮類成分的影響

葛根是我國傳統(tǒng)中藥，其主要有效成分是葛根素、大豆苷和大豆苷元等異黃酮類成分，以葛根素為主，也是本屬特有的活性成分，其含量約占葛根總黃酮的一半以上，因此，通常把葛根素的含量高低作為葛根質(zhì)量評價的主要指標[25]。由表4可知，電子束輻照對食用葛根粉中葛根素含量的影響不大，除7.5 k Gy輻照樣品外，其余輻照樣品葛根素的含量與對照組樣品相比略有增加，10.0 k Gy時差異顯著（P<0.05），大豆苷和大豆苷元的含量變化均無顯著差異（P>0.05），結(jié)果表明電子束輻照對食用葛根粉中主要異黃酮類成分的影響不大。前期國內(nèi)學者研究了不同劑量的60Co-γ射線輻照保濟丸[26]、通脈顆粒[27]及柴葛退熱散[28]等中成藥，結(jié)果表明60Co-γ射線輻照對其主要有效成分葛根素的含量均無明顯影響，這與本文的研究結(jié)論一致，但關(guān)于電子束輻照對葛根素成分影響的研究尚鮮見。徐遠芳等[29]報道了不同劑量60Co-γ射線和電子束輻照前后葛根提取物的指紋圖譜相似度均為1.0，2種輻照方式均不會影響其主要功能活性成分的質(zhì)量穩(wěn)定性及有效性，這與本文的研究結(jié)論相似。因此，12.5 k Gy以內(nèi)劑量電子束輻照對食用葛根粉中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量無明顯影響。

表4 電子束輻照對食用葛根粉異黃酮類成分的影響Table 4 Effects of electron beam irradiation on isoflavone active substances of edible kudzu root powder

2.4 電子束輻照對食用葛根粉物理特性的影響

食用葛根粉的主要成分是淀粉，葛根淀粉具有糊化溫度低、透明度高、粘度穩(wěn)定性強等特點，是一種優(yōu)質(zhì)的食品加工原料淀粉來源。由表5可知，電子束輻照對食用葛根粉白度、凍融穩(wěn)定性（以析水率計）、溶解度以及膨潤力有一定的影響。經(jīng)不同劑量電子束輻照后，樣品的白度均顯著低于對照組樣品（P<0.05），但其白度值變化不大。凍融穩(wěn)定性是指淀粉糊經(jīng)冷凍處理，取出融化后保持原來膠體結(jié)構(gòu)的特性，是判定淀粉是否有利于制作冷凍食品的重要指標之一。以析水率表征淀粉的凍融穩(wěn)定性，析水率越高，凍融穩(wěn)定性越差，反之越好[16]。與對照組樣品相比，輻照樣品的析水率顯著降低（P<0.05），2.5～10.0 k Gy劑量范圍內(nèi)，隨著輻照劑量的增加樣品析水率逐漸下降，表明電子束輻照能顯著增強葛根粉的凍溶穩(wěn)定性，從而增加其作為冷凍食品加工原料的適應(yīng)性。輻照后樣品的溶解度和膨潤力均明顯增大（P<0.05），其變化與輻照劑量呈正相關(guān)，說明電子束輻照輻照使產(chǎn)品的溶解性增加，有利于提高產(chǎn)品的沖調(diào)性。目前，關(guān)于電子束輻照對淀粉功能特性的影響已有研究報道[30?31]，與本文的研究結(jié)論基本一致，可通過電子束輻照方法對淀粉進行改性。因此，采用12.5 k Gy以內(nèi)電子束輻照有望改善葛根淀粉的物理性能，提高食用葛根粉的食用品質(zhì)。

表5 電子束輻照對食用葛根粉物理性能的影響Table 5 Effects of electron beam irradiation on physical propertiesof edible kudzu root powder

2.5 電子束輻照對食用葛根粉抗氧化活性的影響

葛根粉中含有多種活性成分，其主要活性成分是異黃酮類和多糖，均具有較強的抗氧化活性，對DPPH自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O?2）等活性自由基具有較強的清除作用[32?33]。由表6可以看出，電子束輻照對食用葛根粉DPPH自由基清除率、羥自由基（·OH）清除率和還原力的影響不一。與對照組樣品相比，2.5～10.0 k Gy輻照樣品對DPPH自由基的清除率顯著低于對照組樣品（P<0.05），12.5 k Gy時顯著高于對照組樣品（P<0.05），但其變化與輻照劑量無明顯的線性相關(guān)關(guān)系。不同劑量輻照樣品的還原力均有所下降，5 kGy及以上劑量輻照樣品還原力顯著低于對照組樣品（P<0.05）。輻照后樣品對羥自由基（·OH）的清除率與對照組樣品相比無顯著差異（P>0.05）。本文作者前期研究了60Coγ射線和電子束輻照對葛根提取物抗氧化活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種輻照方式對葛根提取物的DPPH自由基、羥自由基（·OH）的清除率以及還原力的無明顯影響[29]，這與本研究的結(jié)論不完全一致。分析其原因，電子束輻照對食用葛根粉中葛根素、大豆苷和大豆苷元等3種主要異黃酮類成分的含量無明顯影響，而輻照后樣品多糖成分的含量及分子構(gòu)象會發(fā)生變化[34?35]，可能會對其抗氧化活性產(chǎn)生影響，尚有待進一步研究。因此，不超過12.5 kGy的電子束輻照對食用葛根粉中活性成分的抗氧化能力不會產(chǎn)生明顯的破壞作用。

表6 電子束輻照對食用葛根粉抗氧化活性的影響Table 6 Effects of electron beam irradiation on antioxidant activity of edible kudzu root powder

3 結(jié)論

電子束輻照對食用葛根粉中污染微生物具有明顯的殺菌作用，且輻照劑量越大，微生物存活數(shù)越少。電子束輻照對食用葛根粉菌落總數(shù)殺菌劑量的D10值為2.68 k Gy，對初始菌落總數(shù)為2.2×103CFU/g的食用葛根粉，7.5 kGy劑量電子束輻照即可控制其中的微生物含量。電子束輻照對食用葛根粉中一般營養(yǎng)成分含量（水分、灰分、蛋白質(zhì)、淀粉、維生素B1和B2）、異黃酮類活性成分含量（葛根素、大豆苷、大豆苷元）以及羥自由基（·OH）清除率無明顯影響。輻照后葛根粉脂肪含量明顯增加，膳食纖維含量、白度、DPPH自由基清除率以及還原力有所降低，但總體變化幅度不大。多糖含量、溶解度、膨潤力均顯著增大，凍融穩(wěn)定性明顯增強。因此，電子束輻照是一種有效的食用葛根粉滅菌方式，12.5 kGy以內(nèi)電子束輻照不會對食用葛根粉的營養(yǎng)及功能活性成分產(chǎn)生明顯的破壞作用，并且有望改善其作為食品加工原料的物理性能。