●劉巧斌 龔春水 張 榮 劉蘭蘭

隨著人們生活壓力的增加，焦慮和抑郁的發(fā)病越發(fā)普遍。5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRIs）可以抑制關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的攝取，是目前治療焦慮、抑郁癥的臨床常用藥[1]。然而臨床使用SSRIs治療男性患者時(shí)，常會(huì)導(dǎo)致性功能障礙等嚴(yán)重副作用的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，各種程度的性功能障礙在SSRIs 使用者中的發(fā)生率可以達(dá)到30%～80%[2]，其中，帕羅西汀引發(fā)性功能障礙的幾率最高[3]。性功能障礙嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量，然而目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于SSRIs導(dǎo)致的性功能障礙并無有效的治療方式[4]。贊育丹出自《景岳全書·痿證論》，有補(bǔ)腎壯陽的功效，主治陽痿精衰、虛寒無子癥[5]。本次研究將明確贊育丹對(duì)帕羅西汀導(dǎo)致的性功能障礙大鼠的治療作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4月齡SPF級(jí)Wistar 大鼠，購自北京維通利華公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。雄性65 只，體重（150.2±15.1）g；雌性50 只，體重（142.3±16.2）g。環(huán)境溫度控制在（21.1±1.4）℃，12 h 的光照周期循環(huán)，自由飲食、飲水及活動(dòng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑黃體酮（國藥準(zhǔn)字：H33020828，浙江仙琚制藥股份有限公司）；苯甲酸雌二醇（國藥準(zhǔn)字：H31021297，上海通用藥業(yè)股份有限公司）；大鼠睪酮ELISA檢測(cè)試劑盒（Mybiosource 公司，貨號(hào)：MBS727352）；NO 測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A012-1）；大鼠cGMP ELISA 檢測(cè)試劑盒（Mybiosource 公司，貨號(hào)：MBS282179）；抗eNOS 抗體（CST 公司，貨號(hào)：32027）；抗PDE5 抗體（Abcam 公司，貨號(hào)：ab28761）；抗GAPDH 抗體（CST 公司，貨號(hào)：5174）；羊抗兔IgG 抗體（CST 公司，貨號(hào)：#7074S）；兔抗羊IgG抗體（Abcam 公司，貨號(hào)：ab6741）；RIPA裂解液（碧云天公司，貨號(hào)：P0013B）；BCA定量蛋白檢測(cè)試劑盒（碧云天公司，貨號(hào)：P0012S）；PVDF 膜（millipore公司，貨號(hào)：IPVH00010）。

1.3 藥物配制贊育丹（白術(shù)、熟地各24 g，枸杞、當(dāng)歸各18 g，肉蓯蓉、炒韭子、巴戟天、杜仲、山茱萸、仙茅、淫羊藿各12 g，蛇床子、制附子、肉桂各6 g）中各味藥材均購于南方醫(yī)科大學(xué)中藥房。將附子置于3000 mL 純水中浸泡30 min 后，先煎1 h，加入其余藥物再煎1 h 后，對(duì)藥液進(jìn)行濃縮，定容至濃度為生藥3 g/mL，給藥前用蒸餾水稀釋為所需濃度。帕羅西汀片（國藥準(zhǔn)字：H10950043，中美天津史克制藥公司）在研缽中磨為粉末，按10 mg/mL 濃度混懸于蒸餾水中配置而成，藥物均置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動(dòng)物篩選雌性SD 大鼠在性交配測(cè)試前48 h內(nèi)注射苯甲酸雌二醇（10 μg/100 g）促使發(fā)情，前1 h注射黃體酮（0.5 mg/100 g）催情，對(duì)雄性大鼠進(jìn)行性行為交配試驗(yàn)測(cè)試[6]。選擇30 min 內(nèi)完成射精性行為≥3次的雄性大鼠共50只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 分組及給藥50 只雄性大鼠隨機(jī)分為5 組，每組10只，分別為正常組（予等體積生理鹽水）、模型組（予帕羅西汀10 mg/kg）、贊育丹低劑量組（予帕羅西汀10 mg/kg及贊育丹10.7 g/kg）、贊育丹中劑量組（予帕羅西汀10 mg/kg 及贊育丹21.4 g/kg）、贊育丹高劑量組（予帕羅西汀10 mg/kg及贊育丹42.8 g/kg），每天1次，連續(xù)灌胃4 w。

1.6 性行為參數(shù)雄性大鼠的實(shí)驗(yàn)交配行為由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的2名觀察者記錄，減少主觀誤差。雄性大鼠末次灌胃結(jié)束后1 h，單獨(dú)被放置在一個(gè)50 cm ×30 cm × 20 cm 的玻璃暗光觀察室內(nèi)，適應(yīng)5 min 后放入發(fā)情的雌性大鼠，統(tǒng)計(jì)各組雄性大鼠在30 min內(nèi)的性行為相關(guān)參數(shù)。包括：①騎跨潛伏期（ML）：與雌鼠同籠開始至第1次騎跨所需時(shí)間；②插入潛伏期（IL）：與雌鼠同籠開始至第1次插入陰道所需時(shí)間；③騎跨次數(shù)（MF）：從首次騎跨雌鼠到射精前進(jìn)行的騎跨次數(shù)；④插入次數(shù)（IF）：射精前插入陰道的次數(shù)；⑤射精潛伏期（EL）：首次插入到射精所需時(shí)間[7]。

性行為參數(shù)檢測(cè)結(jié)束后第二天，乙醚麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清；并在冰皿上快速分離陰莖，用生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心取上清液，-20 ℃保存待測(cè)。

1.7 血清睪酮測(cè)試采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 陰莖組織中cGMP、NO水平檢測(cè)陰莖組織勻漿上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用ELISA 法檢測(cè)cGMP 水平，按NO檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)NO水平。

1.9 陰莖組織中eNOS、PDE5 水平檢測(cè)取50 mg陰莖組織加入液氮研磨成粉末，加入適量的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，離心，取上清，BCA 法定量蛋白。取20 μg 總蛋白加入5×上樣緩沖液，100 ℃、5 min 變性，10%的SDS-PAGE 電泳，半干電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h 后，一抗（eNOS 1:1000、PDE5 1:1000、GAPDH 1:1000）孵育過夜，PBS洗三遍，二抗（1:1000）孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶，用GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行分析。One Way ANOVA法檢測(cè)組間差異，方差齊的采用LSD 進(jìn)行兩兩比較，方差不齊的采用Dunnetts T3進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)帕羅西汀誘導(dǎo)性功能障礙的影響與正常組相比，模型組的ML、IL 以及EL 顯著增加，MF 和IF 顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組相比，贊育丹低、中、高劑量組的ML、IL 以及EL 隨著贊育丹劑量的升高而顯著降低，MF 隨著贊育丹劑量的升高而顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。IF 隨贊育丹劑量的升高而有增加的趨勢(shì)，其中贊育丹中、高劑量組與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）。見表1。

表1 贊育丹對(duì)帕羅西汀誘導(dǎo)性功能障礙的影響（-x± s，n=10）

2.2 對(duì)血清睪酮的影響與正常組相比，模型組大鼠血清的睪酮含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；經(jīng)過不同劑量的贊育丹給藥治療后，睪酮含量隨著贊育丹給藥劑量的增加而增加，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

表2 贊育丹對(duì)血清睪酮的影響（-x± s，n=10）

2.3 對(duì)大鼠陰莖NO、cGMP含量的影響與正常組相比，模型組大鼠陰莖NO、cGMP含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)過贊育丹給藥治療后，NO、cGMP含量均顯著增加，且呈劑量依賴性，與模型組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。見表3。

表3 贊育丹對(duì)大鼠陰莖cGMP、NO含量的影響（-x± s，n=10）

2.4 對(duì)大鼠陰莖eNOS、PDE5 含量的影響模型組大鼠eNOS含量較正常組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；經(jīng)過贊育丹給藥治療后，eNOS 含量均顯著增加，且呈劑量依賴性，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖1A、B。

模型組大鼠PDE5 較正常組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，贊育丹中、高劑量組PDE5含量均顯著降低，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），低劑量組的PDE5 含量與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1A、C。

圖1 贊育丹對(duì)大鼠陰莖eNOS、PDE5含量的影響

3 討論

5-羥色胺（5-HT）是人體重要的神經(jīng)遞質(zhì)，影響大腦活動(dòng)各個(gè)方面，參與調(diào)節(jié)睡眠、痛覺及快感等生理過程。SSRIs 作為常用的抗抑郁藥物，可以抑制5-HT的釋放、合成，具有療效可靠、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，卻容易導(dǎo)致男性患者發(fā)生性功能障礙，其可能的機(jī)制包括：SSRIs 可以通過激活5-HT2 受體來抑制多巴胺的釋放，導(dǎo)致催乳素的脫抑制性升高，從而導(dǎo)致性欲降低，使性喚醒的閾值增加；SSRIs也可以抑制副交感神經(jīng)乙酰膽堿的釋放，引起陰莖勃起功能障礙；SSRIs抑制NO 的合成，NO 是陰莖勃起的重要信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，抑制NO的合成會(huì)導(dǎo)致性功能障礙的發(fā)生[8]。

目前，對(duì)于由SSRIs引起的性功能障礙，缺少有效的解決辦法，臨床處理措施為停用該藥物。近年來發(fā)現(xiàn)坦度螺酮對(duì)于SSRIs引起的性功能障礙具有一定的治療作用[9]，但卻會(huì)導(dǎo)致頭暈、嗜睡、失眠、頭痛等嚴(yán)重副作用[3]。中醫(yī)藥具有療效顯著、副作用小等特點(diǎn)，為藥物治療由SSRIs引起的性功能障礙提供新的研究思路和方向。性功能障礙的中醫(yī)治療以補(bǔ)腎、疏肝為主[10]。贊育丹具有補(bǔ)腎壯陽之效，為臨床常用方。臨床研究表明，贊育丹可以有效治療弱精患者[11]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)贊育丹可以通過增加精子數(shù)量、修復(fù)受損組織來改善性功能障礙大鼠的癥狀[12]。本次研究采用帕羅西汀誘導(dǎo)大鼠性功能障礙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，贊育丹可以顯著降低模型大鼠的ML、IL以及EL，增加MF，表明贊育丹具有治療帕羅西汀誘導(dǎo)性功能障礙的作用。

性功能障礙的臨床表現(xiàn)主要有早射、無法勃起、射精沒力、勃起不堅(jiān)等，其中以陰莖勃起功能障礙為最常見的癥狀[13]。海綿體內(nèi)神經(jīng)末梢及海綿竇內(nèi)皮細(xì)胞在eNOS酶的作用下合成并釋放NO，增高海綿體平滑肌中cGMP的水平，下調(diào)細(xì)胞鈣離子濃度，導(dǎo)致陰莖海綿體血管平滑肌舒張，大量血流進(jìn)入海綿體組織，從而導(dǎo)致海綿體內(nèi)壓升高完成勃起過程[14]。PDE5是磷酸二酯酶家族的一員，在陰莖中主要的磷酸二酯酶亞型，能特異性抑制cGMP 的活性。因此，抑制PDE5、提高cGMP是勃起功能障礙的主要治療策略之一[15]。本研究發(fā)現(xiàn)贊育丹可以提高陰莖組織中NO、cGMP、eNOS 的含量，降低陰莖組織中PDE5 的含量，表明贊育丹可以通過調(diào)控NO/cGMP途徑改善勃起功能障礙。調(diào)控NO/cGMP 途徑是中藥防治勃起功能障礙的研究熱點(diǎn)[16]。淫羊藿是贊育丹的有效組成之一，有研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿能抑制PDE5的活性改善勃起功能障礙[17]。因此，筆者推測(cè)淫羊藿是贊育丹中抑制PDE5，防治勃起功能障礙的主要藥物。

睪酮作為一種雄激素，對(duì)于男性性特征發(fā)育、精子發(fā)育、性器官發(fā)育、性沖動(dòng)的產(chǎn)生等方面起著重要作用，維持高水平的血清睪酮含量是提高性欲的基礎(chǔ)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，30%～35%對(duì)PDE5 抑制劑無效的勃起功能障礙患者與低水平血清睪酮相關(guān)，聯(lián)合使用睪酮與PDE5抑制劑有更好的治療效果[19]。本研究發(fā)現(xiàn)贊育丹可以顯著增加帕羅西汀誘導(dǎo)性功能障礙模型大鼠血清中睪酮的含量，提示贊育丹改善帕羅西汀誘導(dǎo)性功能障礙的機(jī)制可能與提高睪酮相關(guān)。贊育丹中多種中藥成分，如仙茅[20]、淫羊藿[21]、巴戟天[22]，都具有提高睪酮的作用。本研究提示，贊育丹可能通過提高睪酮及抑制PDE5雙重作用改善勃起功能障礙。

本研究表明，贊育丹可能通過調(diào)控NO/cGMP 途徑、提高睪酮及抑制PDE5，從而改善SSRIs 引起的性功能障礙。本研究也提示贊育丹具有治療其它原因?qū)е碌男怨δ苷系K的可能，可在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。此外，大量研究證實(shí)PDE5介導(dǎo)的NO/cGMP途徑還在心血管疾病中起重要作用[23-24]，提示贊育丹可能可以在心血管疾病中有一定的應(yīng)用前景，值得探索。