李宜航

(常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000)

丙氨瑞林為一種人工合成的促性腺激素釋放激素(GnRH)的九肽類似物，主要應(yīng)用于治療子宮內(nèi)膜異位癥。臨床研究表明[1]該藥用藥初期可刺激垂體釋放促卵泡素(FSH) 和促黃體生成素(LH)，引起卵巢源性甾體激素短暫升高；重復(fù)用藥可抑制垂體釋放LH和FSH，使血中的雌二醇水平下降，達(dá)到藥物去卵巢的作用，這種抑制作用可用于治療子宮內(nèi)膜異位癥等激素依賴性疾病。丙氨瑞林具有較高的藥用價(jià)值和應(yīng)用市場(chǎng)。

圖1 丙氨瑞林合成路線Fig.1 Synthetic route of alarelin

目前丙氨瑞林的制備方法主要是以哌啶為脫帽試劑的多肽固相合成法[2]，主要存在制備方法成本相對(duì)較高，并且不方便運(yùn)輸和儲(chǔ)存的缺點(diǎn)。本研究采用以哌嗪作為脫帽試劑用CTC樹脂合成片段，結(jié)合液相法合成丙氨瑞林，哌嗪不是易制毒試劑，成本比經(jīng)典合成法用的易制毒試劑哌啶要低，并且更方便運(yùn)輸和儲(chǔ)存，此外，CTC樹脂合成片段還以方便自動(dòng)化生產(chǎn)[3-4]；CTC樹脂可以回收重復(fù)利用；適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，沒有劇烈的化學(xué)反應(yīng)；降低了生產(chǎn)成本。合成工藝流程如下圖所示：

1 儀器與試劑

Agilent technologies 1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Milli--Q超純水系統(tǒng)，德國(guó)默克密理博公司；R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GL-150干式恒溫器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；旋渦混合器 XW-80A，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

2-氯三苯甲基氯樹脂(CTC樹脂，替代度為1.0 mmol·g-1)，天津南開合成科技有限公司；所有氨基酸均采購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司；O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、二異丙基乙胺(DIEA)均采購(gòu)自蘇州昊帆生物股份有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)、二乙胺、石油醚均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Leu-CTC 樹脂的制備

稱取25 g(25 mmol)CTC樹脂于250 mL固相合成反應(yīng)器中，取8.835 g(25 mmol)Fmoc-Leu-OH于250 mL三角瓶中，100 mL量筒量取DCM 120 mL，搖勻，加DIEA 41 mL(250 mmol)，搖勻溶解，倒入反應(yīng)器開始反應(yīng)。反應(yīng)1 h時(shí)，用抽濾裝置抽去反應(yīng)液，用DMF洗4次；量取200 mL脫帽試劑5%哌嗪-DMF溶液，倒入反應(yīng)器中，反應(yīng)20 min，然后抽去反應(yīng)液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗(yàn)溶液呈藍(lán)黑色。

2.2 Boc-Pglu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-樹脂的合成

得到Leu-樹脂后，向反應(yīng)體系中添加第二氨基酸保護(hù)單體Fmoc-D-Ala-OH 15.567 g(50 mmol)、縮合劑HBTU 18.962 g(50 mmol)和堿DIEA 9.916 mL(60 mmol)，溶劑為DMF，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，反應(yīng)完成后，用DMF洗滌4遍，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗(yàn)溶液呈無色，既反應(yīng)完全。得到Fmoc-D-Ala-Leu-樹脂后，量取200 mL脫帽試劑5%哌嗪-DMF溶液，倒入反應(yīng)器中，反應(yīng)20 min，抽去反應(yīng)液，DMF洗滌4次，抽干。洗脫完成后，取少許樹脂，滴入茚三酮試液，并用干式加熱器105 ℃加熱約3 min，檢驗(yàn)溶液呈藍(lán)黑色，既獲得D-Ala-Leu-樹脂。在獲得D-Ala-Leu-樹脂后，按照上述縮合反應(yīng)方法，依次在D-Ala-Leu-樹脂上連接氨基酸保護(hù)單體：Fmoc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OHFmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-His(Boc)-OH和Boc-Pglu-OH后得到：Boc-Pglu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-樹脂。

2.3 Boc-pGlu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-OH(化合物1)的制備

通過“2.2”項(xiàng)下制備出目標(biāo)產(chǎn)物后，將“2.2”項(xiàng)下產(chǎn)物用DMF洗滌4次，異丙醇洗滌2次，抽極干。接著向反應(yīng)體系里加入1%TFA/DCM溶液150 mL，搖擺反應(yīng)10 min，收集反應(yīng)液，重復(fù)6次，濃縮反應(yīng)液，加10%檸檬酸溶液，析出白色固體，過濾，水洗至中性，真空干燥。得到化合物129.8 g，純度為91.9%，收率為91%。RP-HPLC圖見圖2；其裂解的無保護(hù)樣品ESI-MS圖見圖3。

圖2 化合物1的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of compound 1

圖3 化合物1 ESI-MS分析圖譜Fig.3 ESI-MS analysis spectrum of compound 1

2.4 合成H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)

2.4.1 H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl的合成

稱Fmoc-Arg(Pbf)-OH，100 mmol，65 g，BOP 110 mmol，49 g溶于500 mL DMF中，冷浴10 min，加入TEA 110 mmol，12 g。然后稱取H-Pro-NHEt.HCl，110 mmol，20 g，用100 mL DMF+12 g TEA溶解，倒入上述反應(yīng)液，反應(yīng)2 h，HPLC顯示反應(yīng)完全，加入0.5 M鹽酸析出，過濾，得白色固體產(chǎn)物，真空干燥，得產(chǎn)物87.4 g，其收率為108%，純度為96.8%。RP-HPLC圖見圖4。

圖4 化合物H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of compound H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt·HCl

2.4.2 合成H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)

將“2.3.1”項(xiàng)產(chǎn)物用二乙胺500 mL溶解，攪拌30 min，HPLC顯示反應(yīng)完全。濃縮除去二乙胺，加石油醚析出，得到白色固體H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt，真空干燥，得產(chǎn)物51 g，其收率為92.6%，純度為97.5%。RP-HPLC圖見圖5,ESI-MS圖見圖5。

圖5 化合物2的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of compound 2

2.4.3 H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt(化合物2)的的ESI-MS分析

對(duì)化合物2進(jìn)行ESI-MS分析，可知化合物2[M+1]+峰為M/Z為552.1，與理論值550.9一致。見圖6。

圖6 化合物2 ESI-MS分析圖譜Fig.6 ESI-MS analysis spectrum of compound 2

2.5 丙氨瑞林粗品的合成

2.5.1 丙氨瑞林前體的合成(化合物3)

取第一中間體(化合物1)10 mmol，13 g和BOP 11 mmol，4.9 g溶于20 mL DMF，-5 ℃冷浴10 min，另取第二中間體(化合物2)12 mmol，6.6 g，溶于20 mL THF中，反應(yīng)2 h，HPLC檢測(cè)反應(yīng)完全。過濾除去白色固體，濃縮，加入0.5 M鹽酸溶液，析出類白色固體，過濾，水洗至中性。真空干燥，得產(chǎn)物丙氨瑞林前體(化合物3)15.8 g，其產(chǎn)率為86.3%，純度為91%。RP-HPLC圖見圖7。

圖7 化合物3的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of compound 3

2.5.2 丙氨瑞林粗品的合成

取100 mL圓底燒瓶，稱丙氨瑞林前體(化合物3)5 mmol(9.2 g)投入，加入切肽試劑(TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5)切割，得到含有丙氨瑞林粗品的TFA溶液。濃縮TFA溶液至少量，加入乙醚。離心，真空干燥得丙氨瑞林粗品5.3 g，其純度為91%，收率為83%。RP-HPLC圖見圖8，MS圖見附圖9。

圖8 丙氨瑞林粗品的HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of crude alarelin

圖9 丙氨瑞林粗品ESI-MS分析圖譜Fig.9 ESI-MS analysis spectrum of crude alarelin

2.6 樹脂回收

將樹脂用DMF洗滌三次，甲醇洗滌三次，抽去濾液，真空干燥。另配置二氯亞砜的DCM溶液，加入裝有樹脂的固相合成反應(yīng)器中，反應(yīng)2 h后，抽去反應(yīng)液，DCM洗滌。

3 結(jié) 論

丙氨瑞林作為臨床使用藥物，現(xiàn)階段對(duì)其藥理活性研究較多，其合成研究相對(duì)較少。目前，在現(xiàn)有技術(shù)中，申請(qǐng)?zhí)枮镃N201710851059.5提供一種丙氨瑞林的固相制備方法[5]，該制備方法采用全固相合成的方式，反應(yīng)簡(jiǎn)單可控，但因肽鏈較長(zhǎng)，固相合成后期可能副產(chǎn)物較多，此外，現(xiàn)有技術(shù)多采用哌啶作為脫帽試劑，該試劑為易制毒管制試劑，采購(gòu)及運(yùn)輸較為困難。本研究采用固液組合合成方式，前七個(gè)氨基酸(Boc-pGlu-His(Boc)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Ala-Leu-OH)采用固相合成方式，反應(yīng)簡(jiǎn)單，純度為91.9%，收率為91%，最后兩個(gè)氨基酸(H-Arg(Pbf)-Pro-NHEt)及丙氨瑞林粗品均采用液相合成的方式，降低了生產(chǎn)成本，減少了副產(chǎn)物的生產(chǎn)。

本研究利用多肽固相及液相合成結(jié)合法成功合成了丙氨瑞林，該方法操作簡(jiǎn)單，CTC樹脂合成片段可以方便自動(dòng)化生產(chǎn)且成本較低，純度高，反應(yīng)條件溫和，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。