黃　凌

家蠶耐氟性抗血液型膿病品系選育研究

黃凌

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院廣西南寧530007）

將家蠶抗血液型膿病品種的抗性親本與耐氟化物品種的抗性親本進(jìn)行雜交，從后代中篩選出兼耐血液型膿病和氟化物的家蠶個(gè)體，用系統(tǒng)選育的方法進(jìn)行家蠶抗病性品種選育。經(jīng)測(cè)試，新品系2齡起蠶經(jīng)口添食家蠶核型多角體病毒（BmNPV，以下簡(jiǎn)寫(xiě)為NPV），半數(shù)致死濃度（LC50）為2.18×108個(gè)/mL，并且耐受一定濃度的含氟桑葉。在正常環(huán)境條件下，該品系的蟲(chóng)蛹率與對(duì)照932不相上下，但在環(huán)境受NPV污染的情況下，該品系的蟲(chóng)蛹率明顯高于對(duì)照932。因此，經(jīng)本研究表明，品系96·NC99R對(duì)血液型膿病和氟化物兼具一定耐受性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性。

家蠶抗病材料；血液型膿病；氟化物

家蠶核型多角體病毒（BmNPV，以下簡(jiǎn)稱為NPV）經(jīng)食下感染或傷口感染后，通常使家蠶于下一齡期發(fā)病或蛹期發(fā)病，100%致死，死蠶尸體污染蠶座致使其他蠶兒感染發(fā)病，嚴(yán)重可使整批蠶感染病毒致死。桑葉受工廠氟化物污染后出現(xiàn)氟化物中毒，蠶兒食下氟化物中毒的桑葉后出現(xiàn)氟化物中毒癥狀，環(huán)節(jié)凸起，發(fā)育開(kāi)叉大，吐絲量減少，嚴(yán)重的可能不結(jié)繭，產(chǎn)不出受精卵等。不管是NPV感染或是氟中毒，蠶兒一旦發(fā)病或中毒，尚無(wú)有效的治療或解毒方法，現(xiàn)階段只有消毒防控和培育抗逆性家蠶品種這兩種有效方式。有研究結(jié)果表明，家蠶耐氟性狀呈部分顯性遺傳，有加性效應(yīng)，由一對(duì)耐氟主效基因和若干微基因控制，該耐氟基因與第12連鎖群緊密連鎖，F(xiàn)1代耐氟性與雜種優(yōu)勢(shì)呈顯著正相關(guān)，與父本為顯著負(fù)相關(guān)，并且可以較容易地通過(guò)表型選拔獲得耐氟性個(gè)體[1-5]。與耐氟性相似，家蠶對(duì)NPV的抗性同樣受若干微基因和一對(duì)主效基因控制，該抗性基因?yàn)轱@性基因，雜交后代（F1代和F2代）對(duì)NPV的抗性呈偏父遺傳現(xiàn)象，雜交一代（F1代）的抗NPV性表現(xiàn)出雜交優(yōu)勢(shì)，累代添食NPV可提高家蠶品種對(duì)NPV的抗性，且經(jīng)濟(jì)性狀穩(wěn)定[6-7]。至今已培育出的抗NPV家蠶品種或耐氟家蠶品種有桂蠶N2、華康3號(hào)、秋豐×白玉和桂蠶F95等[8-11]，然而，這些品種均只是單一的抗血液型膿病或耐氟化物，尚未報(bào)道有家蠶品種兼抗兩者。因此，本研究擬將含有抗NPV基因的家蠶品種親本與含有耐氟基因的家蠶品種親本雜交，對(duì)其后代進(jìn)行抗NPV和耐氟性篩選，并累代添毒添氟以提高個(gè)體的抗病性和耐毒性，采用系統(tǒng)選育的方法選育出兼抗血液型膿病和耐氟化物的家蠶品系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

家蠶母種NC99R與96均由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站育成并保存，均為二化性中系品種。其中NC99R攜帶抗NPV顯性主效基因，為抗家蠶血液型膿病品種桂蠶N2的親本之一；96攜帶耐較高濃度氟化物顯性主效基因，為耐氟化物品種桂蠶F95的親本之一。

1.2 飼育方法

96·NC99R和對(duì)照932均在平均溫度29 ℃、平均濕度81%的飼育環(huán)境中飼育，1齡～3齡全覆蓋育，4齡半覆蓋育，5齡普通育，每天3回育，并調(diào)查齡期經(jīng)過(guò)、簇中經(jīng)過(guò)、飼育成績(jī)和繭質(zhì)成績(jī)。

1.3 抗NPV性篩選與提升

將提純的NPV病毒原液稀釋成3×106個(gè)/mL備用（隨配隨用）。添食當(dāng)天摘取新鮮適熟葉，浸泡入制備好的NPV病毒液中，充分浸漬均勻，取出后待桑葉表面水分自然蒸發(fā)后，切成4 cm×4 cm的方塊。2齡餉食第一口葉開(kāi)始定量添食，每30 頭蠶在24 h內(nèi)一次性喂給4 cm×4 cm的浸漬過(guò)NPV的桑葉3 片，待24 h食盡后用新鮮石灰粉消毒蠶座，更換蠶座紙，開(kāi)始換為普通桑葉正常飼喂，3齡起蠶后淘汰掉不抗NPV的病蠶。

1.4 半數(shù)致死濃度（LC50）的測(cè)定

將NPV病毒原液稀釋成1×104個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL、1×106個(gè)/mL、1×107個(gè)/mL、1×108個(gè)/mL和1×109個(gè)/mL共6 個(gè)濃度，添食方法同1.3。3齡第2天開(kāi)始統(tǒng)計(jì)死亡與存活的蠶頭數(shù)，每個(gè)濃度梯度攻毒2 個(gè)重復(fù)區(qū)，每個(gè)重復(fù)區(qū)30 頭蠶。

1.5 耐毒性篩選與提升

準(zhǔn)確稱取氟化鈉（NaF）分析純?cè)噭? g，加入10 kg清水稀釋后得到300 mg/L的NaF溶液，NaF溶液宜即配即用。將新鮮適熟桑葉浸入300 mg/L的NaF溶液中，充分浸漬10 min后撈出晾干備用。自3齡餉食至3齡眠下，連續(xù)添食制備好的含氟桑葉（實(shí)測(cè)含氟量237 mg/L），過(guò)程中選留不出現(xiàn)氟化物中毒癥狀的家蠶個(gè)體。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)MicrosoftExcel 2007軟件錄入和處理，半數(shù)致死濃度的計(jì)算參考Reed-Muench法。添食NPV病死率與蟲(chóng)蛹率的顯著性分析用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算，所用軟件為SPSS 24.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 品系96·NC99R的選育

以含有耐氟化物基因載體的家蠶母種96為母本、以含有抗NPV基因載體的家蠶母種NC99R為父本，雜交的后代（暫命名為96·NC99R）為F1代。為了固定新品系的耐氟能力，再以96為父本連續(xù)回交3次，使后代中耐氟化物品種的理論遺傳成分占93.75%，抗NPV品種的理論遺傳成分占6.25%（見(jiàn)表1）。

表1回交后代群體中2個(gè)親本的遺傳成分理論值

飼養(yǎng)時(shí)間回交次數(shù)世代親本遺傳成分占比/%回交后代基因型組成NC99R96 2017.30F15050NnFf 2017.51BC12575NnF_ 2017.62BC212.587. 5NnF_ 2017.93BC36.2593.75NnF_

注：含有抗NPV主效基因的家蠶品種的基因型為NNff，含有耐氟化物主效基因的家蠶品種的基因型為nnFF，其中N對(duì)n為顯性，F(xiàn)對(duì)f為顯性，F(xiàn)_表示基因型為FF或Ff。

最后一次回交的后代設(shè)定為B1世代，從B1世代開(kāi)始，進(jìn)行抗病性和耐毒性的選拔提高。2齡餉食經(jīng)口添食NPV攻毒篩選抗性個(gè)體，3齡期添食含氟桑葉篩選耐毒性個(gè)體（詳見(jiàn)材料與方法1.3和1.5）。B1～B6世代全部混區(qū)飼養(yǎng)，混區(qū)制種。

2.2 抗血液型膿病的鑒定

在添食NPV濃度為106個(gè)/mL的數(shù)量級(jí)下，品系96·NC99R與對(duì)照932的死蠶率見(jiàn)表2。品系96·NC99R的病死率平均為7.14%，對(duì)照932的病死率平均為69.91%[12]，差異極顯著（<0.01），說(shuō)明96·NC99R的抗NPV性高于932，兩個(gè)品系的抗病性有差異，且差異極顯著。將NPV病毒原液稀釋成1×104個(gè)/mL、1×105個(gè)/mL、1×106個(gè)/mL、1×107個(gè)/mL、1×108個(gè)/mL和1×109個(gè)/mL的6個(gè)濃度進(jìn)行添食處理（結(jié)果如表3所示），按Reed-Muench法計(jì)算出品系96·NC99R的半數(shù)致死濃度為2.19×108個(gè)/mL。

如表4所示，在蠶室受NPV污染的情況下飼養(yǎng)，96·NC99R的蟲(chóng)蛹率為43.93%，而對(duì)照932的蟲(chóng)蛹率為6.94%，差異極顯著（<0.01）；在正常情況下飼養(yǎng)，96·NC99R的蟲(chóng)蛹率為89.41%，而對(duì)照932的蟲(chóng)蛹率為90.25%，差異不顯著（>0.05）?？梢?jiàn)在正常情況下，96·NC99R的蟲(chóng)蛹率和對(duì)照932不相上下，而在遭受NPV污染的情況下，96·NC99R的蟲(chóng)蛹率與對(duì)照932的蟲(chóng)蛹率差異極顯著，而且新品系的蟲(chóng)蛹率要高于對(duì)照932，說(shuō)明96·NC99R的抗NPV性優(yōu)于對(duì)照932。

表2品系96·NC99R與對(duì)照的抗病性比較

品種名NPV濃度/個(gè)/mL死蠶數(shù)活蠶數(shù)死蠶率/% 96·NC99R3×1064527.14 對(duì)照932[12]3×10641718069.91

注：對(duì)照932的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)摘自文獻(xiàn)《家蠶抗氟品種“桂蠶F95”的選育研究》[12]。

表3品系96·NC99R添食NPV梯度濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

病毒稀釋度/個(gè)/mL1×1041×1051×1061×1071×1081×109 接毒蠶數(shù)273029263026 活蠶數(shù)252525212420 NPV死蠶數(shù)254566

表4品系96·NC99R與對(duì)照932的飼養(yǎng)情況比較

飼養(yǎng)條件蟲(chóng)蛹率/% 96·NC99R對(duì)照932 蠶室正常情況89.4190.25 蠶室受NPV污染43.936.94

2.3 耐氟化物的鑒定

3齡起蠶淘汰掉不抗NPV的家蠶個(gè)體后，就開(kāi)始進(jìn)行氟化物的添食篩選（詳見(jiàn)材料與方法1.5）。從圖1中可以看出，添食氟化鈉后，96·NC99R和932都出現(xiàn)了環(huán)節(jié)凸起等氟中毒現(xiàn)象（圖1中C和D），但932的蠶頭數(shù)明顯比96·NC99R少，而且蠶個(gè)體明顯比96·NC99R瘦小，發(fā)育不齊（圖1中A和B）。在添食NPV又連續(xù)添食氟化鈉后，932蠶無(wú)法結(jié)繭化蛹，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的氟化物中毒癥狀。

（A、C：添食氟化物后的96?NC99R。B、D：添食氟化物后的932。）

3 討論

本研究用兩個(gè)抗性親本雜交，使得抗NPV顯性基因與耐氟顯性基因均整合至96·NC99R上，為鞏固F1代的耐氟性又與96親本進(jìn)行連續(xù)三代回交，回交后代在高溫多濕環(huán)境下飼養(yǎng)，通過(guò)累代添氟添毒，選拔抗性個(gè)體進(jìn)行留種繼代，以提升新品系的抗病性和耐毒性。

試驗(yàn)結(jié)果表明，新品系的食下感染半數(shù)致死濃度為2.19×108個(gè)/mL，比它的抗病親本NC99R低[8]。在添食NPV濃度為106個(gè)/mL的數(shù)量級(jí)下，新品系96·NC99R的病死率比兩廣二號(hào)的親本932低62.77%，差異極顯著（<0.01），說(shuō)明品系96·NC99R與932的抗病性有極顯著差異。在正常情況下飼養(yǎng)，96·NC99R的蟲(chóng)蛹率比932低0.84%，差異不顯著（>0.05）；在蠶室遭受NPV污染的情況下，96·NC99R的蟲(chóng)蛹率比932高36.99%，差異極顯著（<0.01），說(shuō)明96·NC99R與932的蟲(chóng)蛹率可能存在差異，但差異還未達(dá)到顯著水平。而96·NC99R的抗病性與932的抗病性差異極顯著，說(shuō)明品系96·NC99R含有抗NPV主效基因，對(duì)NPV有相當(dāng)好的抗性。3齡起蠶至3齡眠下連續(xù)添食含氟桑葉，進(jìn)行耐氟性篩選，通過(guò)累代篩選出耐氟化物個(gè)體留種繼代，可以逐步提升96·NC99R品系的耐氟性。

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2095-1205(2021)08-01-03

10.3969/j.issn.2095-1205.2021.08.01