沈曉憶，夏圍圍*，張 潔，賈仲君

硝化抑制劑與尿素配施對旱地土壤溫室氣體排放及硝化微生物的影響①

沈曉憶1，夏圍圍1*，張 潔1，賈仲君2

(1 南京信息工程大學應用氣象學院，南京 210044；2 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008)

為明確施肥措施對旱地土壤溫室氣體排放的綜合效應及微生物機理，采集典型麥田土壤進行室內(nèi)微宇宙培養(yǎng)，研究了雙氰胺(DCD)和烯丙基硫脲(ATU)分別與尿素配施對旱地土壤氮素轉(zhuǎn)化及N2O、CO2和CH4排放的影響，同時監(jiān)測了不同類型微生物群落的動態(tài)變化。結(jié)果表明氨氧化細菌(AOB)主導了施氮麥田土壤硝化過程及N2O排放。單施尿素促進AOB迅速繁殖，使N2O排放總量提高235%，同時促進了細菌生長，CO2排放量增加18.5%。DCD與尿素配施極大程度抑制了AOB的生長，顯著降低了N2O排放(59.4%)，但促進了細菌的生長并提高了CO2的排放總量(50.6%)。而ATU與尿素配施同時抑制了真菌、細菌和AOB的生長，對反硝化細菌的影響則相反，使CO2和N2O排放分別下降28.4% 和35.2%。與不施肥相比，氮肥及與兩種硝化抑制劑配施均顯著降低了CH4的排放量。3種溫室氣體的綜合溫室效應在處理間差異顯著：Urea+DCD>Urea>CK>Urea+ATU。CO2排放對綜合溫室效應的貢獻最大，CO2和N2O的貢獻之和大于98.4%。該研究為深刻理解農(nóng)田土壤中的微生物行為及生態(tài)學效應，合理使用硝化抑制劑以及減緩溫室氣體排放提供科學依據(jù)。

溫室氣體；土壤微生物；氮轉(zhuǎn)化；烯丙基硫脲；雙氰胺

氮肥能夠滿足作物生長對氮(N)元素的需求，是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用最廣的肥料，但利用率平均不足35%[1]。土壤微生物驅(qū)動了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的氮素轉(zhuǎn)化，加速了氮素損失。由氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)推動的硝化作用[2-3]，是旱地土壤中NH4+-N向NO– 3-N轉(zhuǎn)化的主要過程?？焖佼a(chǎn)生的土壤NO– 3-N如不及時被植物吸收，則極易在土壤中淋溶損失，降低氮肥的增產(chǎn)效益，同時導致水體富營養(yǎng)化等環(huán)境問題。硝化過程易產(chǎn)生副產(chǎn)物N2O[4]，進一步加劇了全球氣候變化。研究表明AOB和AOA在不同類型土壤硝化過程和N2O排放過程中的貢獻有較大差異[5-6]。除此之外，在土壤的厭氧微域，異養(yǎng)生長的反硝化微生物也可能參與了無機氮的還原，促進了N2O的排放[7]。

施用硝化抑制劑，可以選擇性地抑制土壤硝化微生物活性，影響氮素轉(zhuǎn)化，減緩硝酸鹽的產(chǎn)生以及降低N2O的排放。硝化抑制劑種類繁多，其中，雙氰胺(dicyandiamide, DCD)作為傳統(tǒng)硝化抑制劑已被廣泛使用。大量田間試驗研究表明DCD可顯著抑制土壤硝酸鹽的積累[8]以及減少N2O的排放[9]。但也有研究結(jié)果顯示DCD不能抑制土壤硝化作用以及氨氧化微生物的生長[10]。DCD抑制效果的差異，除了受土壤pH、土壤有機質(zhì)含量和土壤類型等理化因素影響外，還可能與土壤中不同類型氨氧化微生物對DCD的敏感程度有關(guān)[11-12]。烯丙基硫脲(allylthiourea, ATU)是一種實驗室常用的新型硝化抑制劑。在液體培養(yǎng)基和活性污泥反應器中發(fā)現(xiàn)，ATU能顯著抑制氨氧化細菌，而對古菌不敏感[13-14]，表明在針對性抑制AOB主導的土壤硝化過程中具有應用價值，同時具有減少N2O排放的潛力。但ATU在土壤中的有效施用量及對農(nóng)田土壤N2O排放的貢獻鮮見報道。

農(nóng)業(yè)活動是主要的溫室氣體(CO2、N2O和CH4)排放源之一，對全球溫室氣體排放總量的貢獻率達14%[15]，對全球增溫的貢獻率達80%[16]。硝化抑制劑與氮肥配施不僅能夠抑制N2O的排放，同時還可能改變土壤pH、無機氮含量、有機質(zhì)含量以及不同微生物類群的活性，從而影響土壤另外兩種主要溫室氣體CO2和CH4的排放。目前，DCD生態(tài)效應的研究多集中在參與N素轉(zhuǎn)化的硝化微生物以及對溫室氣體N2O排放的影響，而其對CO2、N2O和CH43種溫室氣體排放的綜合增溫效應及內(nèi)在微生物機制報道較少。ATU的相關(guān)研究則更加缺乏。因此，研究不同硝化抑制劑的綜合生態(tài)效應，不僅有助于提高氮素利用率，還能為制定有效的綜合溫室氣體減排措施提供理論依據(jù)。

綜上所述，我們認為DCD和ATU能夠通過抑制硝化作用減少N2O排放，并降低綜合溫室效應。基于以上假設(shè)，本研究采集典型麥田土壤，采用室內(nèi)微宇宙培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，并結(jié)合分子生物學手段，分析了尿素及與不同類型硝化抑制劑(DCD和ATU)配施對旱地土壤氮素轉(zhuǎn)化及N2O、CO2和CH4排放的影響，同時監(jiān)測了不同類型微生物群落的動態(tài)變化。該研究也為深化碳氮循環(huán)過程的微生物機理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤取自于南京信息工程大學農(nóng)業(yè)氣象試驗站(32°07′N，118°50′E)。樣品采集時間為2017年3月。采用五點交叉取樣法，用土鉆采集0 ～ 20 cm的耕層土壤500 g。將供試土壤去除雜物、植物殘體，研磨過2 mm篩，并混合均勻，組成混合代表土樣，保存于4 ℃待用。該土壤的基本理化性質(zhì)為：pH 5.86，含水率2.85%，NO– 3-N 10.21 mg/kg，NH4+-N 9.37 mg/kg，有機碳33.8 g/kg。

1.2 土壤室內(nèi)微宇宙培養(yǎng)

本次培養(yǎng)設(shè)置 4 個處理：①CK，以等體積滅菌水代替其他試劑加入土壤；②Urea，尿素按N 100 μg/g加入土壤，其他施氮處理的尿素用量與此相同；③Urea+DCD，DCD用量為15 μg/g(尿素含氮量的15%)[17-18]；④Urea+ATU，ATU用量為5 μg/g(尿素含氮量的5%)。具體流程：稱取相當于6.0 g干土的新鮮土壤于120 ml 血清瓶中，加入無菌去離子水調(diào)節(jié)土壤水分至最大持水量40%，用丁基橡膠塞密封，并用鋁蓋封口，于28 ℃ 黑暗中預培養(yǎng)24 h，以恢復土壤微生物活性。預培養(yǎng)后，將培養(yǎng)瓶取出，打開橡膠塞，用壓縮空氣沖洗血清瓶上部空間1 min。加入對應底物至每個血清瓶底部土壤中，使土壤水分達最大持水量的 60%，塞緊橡膠塞，并用鋁蓋封口，于28 ℃ 黑暗條件培養(yǎng) 28 d。每個處理6 個重復。

1.3 CO2、N2O、CH4的排放動態(tài)

在 0、7、14、21、28 d分別采集血清瓶上部氣體樣品，使用氣象色譜儀(Agilent 7890)對3種溫室氣體CO2、N2O和CH4濃度進行檢測。每個處理3個重復。采氣后，打開鋁帽和橡膠塞，用壓縮空氣沖洗血清瓶，再塞上橡膠塞和鋁帽，重新置于28 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)。以每種氣體的周排放量之和，表示每種氣體的累積排放量。

綜合溫室效應(global warming potentials, GWP)表示相同質(zhì)量的不同溫室氣體對溫室效應增加的相對輻射效應。在100 a時間尺度上，CH4和N2O的增溫潛勢分別是按照單位質(zhì)量CO2的25倍和298倍[19]。由CO2、N2O、CH4的累積排放量，根據(jù)以下公式進行綜合溫室效應計算：

1.4 土壤NH4+-N、NO– 3-N分析

在0、14、28 d進行破壞性采樣。每個血清瓶取1.5 g土壤保存于–20 ℃，用于后續(xù)分子生物學分析；剩余土壤用于NH4+-N、NO– 3-N分析，每個處理3個重復。分別采用酚二磺酸比色法和靛酚藍比色法進行土壤NO– 3-N和NH4+-N的測定。以土壤NO– 3-N的增加量表示土壤的硝化強度。

1.5 土壤微生物DNA提取

采用FastDNA?Spin Kit for Soil(MP Biomedicals)試劑盒提取土壤總DNA，溶解于70 μl無菌水。通過微量紫外分光光度計(Nano Drop?ND-1000 UV-Vis)測定DNA濃度和純度(OD260/OD280和OD260/OD230)，確保大部分DNA樣品OD260/OD280值介于1.8 ～ 2.0，以保證DNA質(zhì)量。同時利用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的完整性和相對濃度。

1.6 土壤微生物的實時熒光定量PCR監(jiān)測

實時熒光定量PCR在CFX96 Optical Real-Time Detection System(Bio-Rad)定量PCR儀上進行。分別對6個特定基因進行定量，引物和定量PCR條件見表1。PCR擴增反應體系為：10 μl的SYBR?Premix EX TaqTM(Takara)，上、下游引物(20 μmol/L)各1.0 μl，加入1.0 μl稀釋20倍的DNA模板，加入滅菌雙蒸水至20 μl反應體系。每次試驗均采用無菌水代替DNA作為嚴格的陰性對照。獲得擴增產(chǎn)物后，進一步通過2.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的特異性。

表1 熒光實時定量PCR引物和反應條件

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析；采用單因素方差分析檢驗同一處理不同時刻以及不同處理同一時刻樣品的差異顯著性；采用Pearson雙尾檢驗分析土壤微生物各種特征基因豐度與溫室氣體CO2、N2O、CH4累計排放量以及土壤NO– 3-N含量的相關(guān)性；最后利用Origin 8作圖。

2 結(jié)果

2.1 N2O、CO2和CH4通量變化及綜合溫室效應

N2O、CO2和CH4在處理間的排放趨勢基本一致，累積排放量與培養(yǎng)時間正相關(guān)，但不同氣體的排放量在處理間存在差異(圖1)。對于N2O排放而言，單施尿素刺激了N2O的排放，28 d培養(yǎng)期內(nèi)的累積排放量最高，達1 622.0 ng/g，分別是Urea+ATU、Urea+ DCD和CK處理的1.5倍、2.5倍和3.4倍。Urea處理前兩周的N2O周排放量高于Urea+ATU處理，后兩周無顯著差異。Urea+DCD處理的N2O周排放量均顯著低于Urea和Urea+ATU處理；前3周的周排放量與CK處理無顯著差異，但第4周較CK顯著提高。培養(yǎng)28 d，CK處理CO2累積排放量為1 391.3 μg/g。單施尿素顯著刺激了土壤CO2的產(chǎn)生，CO2在28 d內(nèi)的累積排放量增加258.0 μg/g，較CK處理增幅達18.5%；其中，第2周內(nèi)CO2排放最多，達679.0 μg/g，是CK的3.0倍。與Urea處理相比，Urea+DCD處理顯著提高了CO2周排放(第2周除外)，CO2在28 d內(nèi)的累積排放量增加50.6%；尤其第3周內(nèi)CO2排放最多，達1 351.2 μg/g，為總累積排放量的54.4%。同樣地，較Urea處理，Urea+ATU處理在培養(yǎng)期間CO2周排放量顯著降低，且CO2在28 d內(nèi)的累積排放量減少28.4%，約占CK處理的84.8%。CH4在28 d內(nèi)的累積排放量在CK處理中最高，約為965.3 ng/g；Urea和Urea+DCD處理次之且無顯著差異，分別為CK的71.4% 和73.3%；Urea+ATU處理最低，較Urea處理減少27.1%。

根據(jù)CO2、N2O和CH4增溫潛勢可知，處理間產(chǎn)生的綜合溫室效應存在較大差異(圖1D)。總體而言，處理間綜合溫室效應強度表現(xiàn)為Urea+DCD> Urea>CK>Urea+ATU；單一氣體對綜合溫室效應的貢獻為CO2>N2O>CH4。Urea和Urea+DCD處理CO2、N2O和CH4的三者綜合溫室效應比CK處理分別增加了588.4和1 136.4 μg/g(以CO2當量計)，增幅分別達37.7% 和72.8%，說明單施尿素及尿素與DCD配施能夠顯著增加旱地土壤溫室氣體排放的綜合溫室效應。而Urea+ATU處理中的綜合溫室效應與CK處理無顯著變化，較Urea處理降低。CO2排放對Urea和Urea+ATU處理的綜合溫室效應貢獻分別為76.7% 和78.4%，N2O排放的貢獻分別為22.5% 和20.8%。在Urea+DCD處理中，CO2排放對綜合溫室效應的貢獻高達92.1%，而N2O僅為7.3%，與CK處理較為相似。CH4排放對綜合溫室效應的貢獻在CK處理最高，約為1.6%，在其余處理中貢獻僅為0.7% ～ 0.8%。

2.2 土壤無機氮轉(zhuǎn)化強度

以一定時間內(nèi)土壤NO– 3-N含量的增加量表示土壤硝化強度。由圖2可知，與對照相比，單施尿素顯著提高了土壤的硝化強度，DCD極大程度抑制了土壤的硝化作用，而ATU對硝化強度的影響不顯著。

Urea處理經(jīng)過28 d培養(yǎng)，尿素水解產(chǎn)生的NH4+-N經(jīng)硝化作用完全轉(zhuǎn)化成了NO– 3-N，土壤NO– 3-N含量增加122.51 μg/g，顯著高于CK處理(22.06 μg/g)；其中，前14 d平均硝化速率為8.14 μg/(g·d)，后14 d平均硝化速率僅為0.61 μg/(g·d)(圖2C)。CK處理的硝化速率均低于Urea處理，分別為1.38 μg/(g·d)和0.22 μg/(g·d)，表明非外源氮而是土壤礦化出的NH4+-N作為底物促進了土壤的硝化作用。Urea+DCD處理較Urea處理28 d內(nèi)土壤NO– 3-N含量減少95.17 μg/g，降幅達78.7%，較CK處理僅增加5.27 μg/g。Urea+ATU處理與Urea處理相比，無論是14 d還是28 d內(nèi)的土壤NO– 3-N含量都無顯著差異，表明ATU對該土壤的硝化強度無顯著影響。除了硝化作用受到強烈抑制的Urea+DCD處理中土壤NH4+-N依然維持在較高水平(122.66 μg/g)，其他處理中土壤NH4+-N含量均較低(9.37 ～ 11.37 μg/g)，且無顯著差異。

Fig. 2 Changes of soil nitrate and ammonia contents and nitrogen turnover rates in different treatments during 28-day incubation

土壤NO– 3-N產(chǎn)生速率和N2O積累速率極顯著正相關(guān)(=0.86，<0.001)。除了Urea+DCD處理外，其他處理前14 d的土壤NO– 3-N和N2O累積速率顯著高于后14 d。而Urea+DCD處理雖然在后14 d NO– 3-N的產(chǎn)生速率和前14 d無顯著差異，但N2O累積速率卻顯著提高。

2.3 土壤細菌、古菌和真菌豐度的變化

熒光定量PCR對土壤細菌16S rRNA基因、古菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因進行定量，評估CO2排放相關(guān)的主要土壤微生物類群對尿素及硝化抑制劑的響應。由圖3可知，同一處理的不同類型土壤微生物的響應規(guī)律并不一致，同一類型微生物在不同處理間的變化趨勢也不盡相同?？傮w而言，在各處理中規(guī)律趨勢一致：細菌豐度>古菌豐度>真菌豐度；真菌(=0.751，<0.001)、細菌(=0.691，<0.01)和古菌(=0.491，<0.05)豐度與CO2通量變化均顯著正相關(guān)(表2)。

單施尿素培養(yǎng)28 d顯著刺激了細菌的生長，細菌16S rRNA基因豐度由0 d 時9.25×109copies/g增加到1.22×1010copies/g，增幅達31.6%，但與14 d相比無顯著變化。Urea+DCD處理中細菌豐度亦隨培養(yǎng)時間顯著增加，尤其后14 d增幅最大；與14 d時相比，培養(yǎng)28 d細菌16S rRNA基因豐度增加58.2%，從9.96×109copies/g增加至1.58×1010copies/g；與0 d時相比，增加70.4%。Urea+ATU處理的細菌變化趨勢與以上兩個處理完全相反，培養(yǎng)28 d時比0 d時減少了4.01×109copies/g，降幅達56.7%。

古菌和真菌在不同處理中變化趨勢較為一致，隨培養(yǎng)時間而顯著增加，但增幅存在差異。培養(yǎng)28 d后，古菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因豐度在CK處理中增幅最大，分別由0 d時5.53×107copies/g和4.04×106copies/g增加到2.21×108copies/g和1.29×107copies/g；古菌在Urea和Urea+ATU處理中增幅最??；真菌在Urea+ATU處理增幅最小，且在Urea和Urea+DCD處理中無顯著差異。

表2 土壤微生物特征基因豐度與溫室氣體CO2、CH4、N2O累計排放量以及NO– 3-N含量的相關(guān)性

注：Pearson雙尾顯著性檢驗，= 27；*、**、***分別表示相關(guān)性達<0.05、<0.01和<0.001 顯著水平。

2.4 土壤硝化和反硝化微生物豐度的變化

通過熒光定量PCR對土壤氨氧化細菌基因、氨氧化古菌基因以及反硝化基因進行定量，評估N2O排放相關(guān)的土壤功能微生物類群對尿素及硝化抑制劑的響應。由圖4可知，3種類型功能微生物在不同處理中的響應規(guī)律有明顯差異。總體而言，土壤NO– 3-N含量變化與AOB豐度(=0.982，<0.001)極顯著正相關(guān)，與AOA豐度顯著負相關(guān)(=–0.501，<0.05)(表2)。N2O通量變化與AOB豐度具極顯著相關(guān)(=0.884，<0.001)，與AOA和反硝化細菌豐度無明顯相關(guān)性(表2)。

單施尿素刺激了AOB的生長，細菌基因豐度隨培養(yǎng)時間顯著增加，由0 d時2.66×107copies/g提高到28 d時2.32×108copies/g，增加了7.69倍；其中，前14 d生長最快，14 d時細菌基因豐度已經(jīng)達到28 d時的89.4%，與硝化速率的變化較為一致。Urea+ATU處理中同樣檢測到大量的AOB生長，細菌基因豐度在14 d和28 d分別為同時刻尿素處理的83.2% 和90.1%，與硝化過程未受到明顯抑制(圖2)較為相符。Urea+DCD處理中細菌基因豐度亦呈增加趨勢，28 d時較0 d時增加了1.36倍。CK處理AOB豐度保持穩(wěn)定。與0 d時相比，培養(yǎng)28 d后，在硝化強度相對較弱的CK和Urea+DCD處理中，AOA和反硝化細菌的豐度均高于硝化強度較高的Urea和Urea+ATU處理，與AOB的變化趨勢相反，表明AOB對供試土壤中高強度的無機氮轉(zhuǎn)化起主導作用。同時，N2O與硝化強度極顯著相關(guān)(=0.87，<0.001)，表明AOB亦主導了該土壤施氮條件下的N2O排放。AOB與AOA、反硝化細菌以及總細菌的比值(圖4)在Urea和Urea+ATU處理中均高于CK和Urea+DCD處理，與硝化強度以及N2O通量變化趨勢較為一致，進一步證明了AOB對該施氮土壤中強烈硝化作用以及N2O排放的重要貢獻。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)該麥田土壤排放的3種溫室氣體(CO2、N2O和CH4)綜合溫室效應在處理間由強到弱順序為Urea+DCD>Urea>CK>Urea+ATU，表明施肥措施及硝化抑制劑類型強烈影響單一以及綜合溫室氣體排放量。較多研究表明在旱地生態(tài)系統(tǒng)中土壤溫室氣體排放以CO2和N2O的凈排放為主[26]，而在稻田生態(tài)系統(tǒng)中溫室氣體的交換則是以CO2的凈吸收以及CH4和N2O凈排放為主要特點[27-28]。本研究中尿素氮肥輸入旱地土壤，促進了溫室氣體排放，使綜合溫室效應提高了37.7%，其中CO2的貢獻占76.7%，N2O的貢獻占22.5%。相似地，華北平原玉米地土壤CO2對綜合溫室效應的貢獻高于N2O，且N2O的貢獻最高可達39%[29]。而在另一種麥田土壤中，雖CO2對綜合溫室效應的貢獻高于N2O，但N2O的貢獻僅為CO2的3%[26]?？梢姡瑴厥覛怏w之間的相對排放量在不同旱地土壤中亦存在較大差異。大量研究發(fā)現(xiàn)在旱地土壤中DCD對N2O的減排效果較好，在不同類型(包括小麥、蔬菜、玉米、草地等)旱地土壤中DCD對N2O的減排效率達30% ～ 70%[30-32]。本研究中DCD添加使N2O降低約59%，與以上結(jié)果基本符合。但也有報道表明在酸性土壤中DCD對N2O排放無明顯作用[33]。在本研究中，ATU添加使N2O排放量降低約35%，而目前未見ATU對其他土壤N2O減排作用的報道。另外，本研究發(fā)現(xiàn)DCD刺激了土壤CO2的排放，說明使用硝化抑制劑減排N2O時，不能忽略其對其他溫室氣體的影響。但一些文獻也報道了與本研究不同的結(jié)果，它們發(fā)現(xiàn)DCD可能對CO2的排放無作用或有抑制作用。這種差異可能與土壤的性質(zhì)以及土壤微生物對DCD的降解有關(guān)[34]。室內(nèi)微宇宙培養(yǎng)法是揭示生態(tài)過程潛在微生物機理的有效方法，在溫室氣體排放的機理研究中應用廣泛[35-37]。本試驗采用室內(nèi)微宇宙培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，監(jiān)測了不同時刻溫室氣體的排放量，雖然定期更新了瓶內(nèi)空氣，但每周培養(yǎng)瓶內(nèi)溫室氣體的累積以及氣壓變化可能會對不同溫室氣體的排放產(chǎn)生影響，未來還需要對原位條件下兩種硝化抑制劑的生態(tài)效應做進一步評估。我們的研究結(jié)果反映了硝化抑制劑施用條件下旱地土壤溫室氣體排放的一種模式，為硝化抑制劑在實際生產(chǎn)中的應用以及溫室氣體減排提供了參考。

尿素作為一種常用化學氮肥，在農(nóng)業(yè)中的使用量約占化學氮肥總量50%。尿素進入土壤溶液后迅速水解NH4+，為氨氧化細菌和古菌提供了充足的底物。本研究發(fā)現(xiàn)單施尿素顯著提高麥田土壤的硝化強度，促進了土壤N2O的排放。在培養(yǎng)14 d時已將尿素水解產(chǎn)生NH4+完全氧化，N2O的排放速率與NO– 3-N累積速率極顯著正相關(guān)(=0.99,<0.001)，N2O的排放系數(shù)(ΔN2O-N/ΔNO– 3-N)約0.79%，符合我國旱地土壤 N2O的排放系數(shù)范圍(0.22% ～ 1.13%)[38]。AOB數(shù)量的增加與N2O和NO– 3-N積累量極顯著正相關(guān)(<0.001)，與以往研究較為一致，表明AOB而不是AOA是中性–堿性土壤(pH>5.5)外源高濃度NH4+向NO– 3轉(zhuǎn)化及N2O排放的主導驅(qū)動者[6, 39-40]。另外，實驗室純培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)AOB具有較強的細胞水平產(chǎn)N2O能力，屬AOB單位細胞產(chǎn)N2O速率為2.0 ～ 7.6 amol/h，屬AOB單位細胞產(chǎn)N2O速率可達15.5 ～ 58.0 amol/h[41]。而本試驗條件下，假設(shè)單施尿素條件下N2O全由AOB產(chǎn)生，則AOB細胞N2O產(chǎn)生速率平均約為1.04 amol/h，與較為接近，說明屬AOB可能是該土壤中主要活性AOB類群。值得注意的是，本試驗中土壤AOB產(chǎn)N2O活性明顯低于純培養(yǎng)條件，表明土壤環(huán)境中微生物的活性受到更加復雜的因素影響。該土壤在不施氮條件下，AOA的數(shù)量隨培養(yǎng)時間顯著增加，NO– 3-N的積累與AOA呈強烈正相關(guān)(=0.97,<0.05)，表明AOA可以利用土壤有機質(zhì)礦化出的低濃度NH4+進行生長[42]。假設(shè)不施氮條件下N2O由AOA硝化作用產(chǎn)生，則AOA單位細胞產(chǎn)N2O速率最大可達0.76 amol/h，與AOA純菌細胞產(chǎn)N2O速率(1.0 amol/h)較為接近[42]，直接表明AOA可能在無外源氮肥輸入的自然生態(tài)系統(tǒng)N2O排放中具有重要作用。

DCD作為氮肥增效劑被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，其對土壤氮轉(zhuǎn)化及硝化微生物的抑制作用已有較多報道[34, 43-44]，我們的結(jié)果與此較為相似。本研究中DCD與尿素配施分別使NO– 3-N和N2O的積累量減少71.7% 和59.3%，AOB的數(shù)量減少72.9%，表明DCD與尿素配施是減少旱地土壤N2O排放的一項有效措施[45]。但與14 d相比，28 d時AOB和AOA的豐度有顯著增加，可能是土壤中DCD的降解導致其對硝化微生物的抑制效果減弱。O’Callaghan等[34]研究發(fā)現(xiàn)土壤中的DCD在28 d內(nèi)降解量可達20 μg/g，表明DCD在土壤中能夠快速降解。同時，細菌和反硝化細菌在28 d時也有顯著提高，并促進了CO2排放。相似地，王紅霞等[46]研究也發(fā)現(xiàn)當土壤中DCD濃度低于5 mg/g時能夠促進細菌生長，低于1 mg/g時還同時促進放線菌生長，高于以上濃度則分別對細菌和放線菌生長表現(xiàn)出抑制作用；但對霉菌則具有普遍抑制作用。這種現(xiàn)象可能是由于低濃度DCD降解刺激了部分異養(yǎng)微生物的生長，而高濃度DCD則可能改變土壤環(huán)境并且對微生物產(chǎn)生毒害。除此之外，馬軍偉等[47]還發(fā)現(xiàn)DCD能夠改變細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)，并提高細菌和真菌的豐富度和多樣性。

在液體培養(yǎng)基中ATU濃度小于100 μmol/L即能對AOB生長活性產(chǎn)生強烈或完全抑制[48-49]。本研究ATU的施用量為15 μg/g，在土壤溶液中濃度約為118 μmol/L，未能顯著降低土壤NO– 3-N的產(chǎn)生速率，對AOB的抑制作用較為微弱，跟預先假設(shè)不一致。類似地，在冰島草地土壤中100 μmol/L ATU亦未對AOB和AOA生長表現(xiàn)出明顯抑制或促進作用[50]。但也有研究發(fā)現(xiàn)在其他農(nóng)田或草地土壤中100 μmol/L ATU可以部分抑制硝化作用，并降低AOB的生長活性[51-53]。這種抑制效果的差異可能與土壤類型、土壤的非勻質(zhì)結(jié)構(gòu)、土壤氨氧化微生物的組成以及其他微生物對抑制劑的降解等有關(guān)。本試驗中AOA豐度對ATU未有明顯響應，與大多數(shù)報道一致。AOA對ATU濃度不敏感，所需有效抑制濃度可能是AOB的1 000倍[49]。甚至有些學者還發(fā)現(xiàn)低濃度ATU (100 ～ 1 000 ng/g)對AOA生長具有促進作用[12]。因此，ATU對土壤中AOB和AOA的有效抑制濃度以及對不同土壤類型中氮素轉(zhuǎn)化過程的影響尚需進一步驗證。另外，我們還發(fā)現(xiàn)ATU降低了細菌和真菌的豐度，表明細菌和真菌的某些類群對ATU較為敏感。一些研究表明硫脲類化合物對多種代表性植物病原菌、病毒等具有強烈的抑制作用[54]。然而目前尚不清楚ATU是否會對土壤中的有益微生物產(chǎn)生影響，以及ATU在生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中傳遞是否會帶來生態(tài)環(huán)境健康風險。因此，雖然ATU施用顯著降低了綜合溫室效應，但目前不推薦ATU在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中被廣泛應用。未來需要結(jié)合“土壤–微生物–植物”系統(tǒng)以對ATU的生態(tài)效應和生物機理做更加全面的評估和闡釋。

4 結(jié)論

AOB主導了施氮麥田土壤NH4+-N向NO– 3-N的轉(zhuǎn)化以及N2O排放。單施尿素以及與硝化抑制劑(DCD和ATU)配施對麥田土壤溫室氣體排放及微生物群落的影響存在較大差異。單施尿素促進了AOB的迅速繁殖，極大地增加了N2O排放總量，同時促進了細菌生長及CO2排放，提高了綜合溫室效應。DCD施用極大程度抑制了AOB的生長，顯著降低了N2O排放，但促進了細菌群落的生長，從而提高了CO2排放總量，并顯著提高了綜合溫室效應。而ATU施用對AOB的生長有輕微抑制作用，對反硝化細菌的生長有輕微促進作用，但對AOA豐度影響不顯著，顯著降低了CO2和N2O排放，降低了綜合溫室效應。與對照相比，尿素及與硝化抑制劑配施均顯著降低了CH4的排放量，但CH4對綜合溫室效應的貢獻(<1.65%)遠遠低于CO2和N2O。

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Effects of Combined Application of Nitrification Inhibitors and Urea on Greenhouse Gas Emission and Ammonia Oxidizers in An Upland Soil

SHEN Xiaoyi1, XIA Weiwei1*, ZHANG Jie1, JIA Zhongjun2

(1 College of Applied Meteorology, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China; 2 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

The emission pattern of greenhouse gas (GHG) has been intensively investigated in different agro-ecosystems, but the underlying microbial mechanism in soil is still poorly understood, especially under many possible measures for improving nitrogen utilization. Thus, a 28-day laboratory microcosm experiment was conducted with an upland soil to investigate the effect of urea and two nitrification inhibitors on nitrogen turnover process and global warming potentials (GWP) of N2O, CO2and CH4, in which four treatments were established: CK (no fertilizer and inhibitor were applied), Urea (N 100 μg/g was applied to soil), Urea+15% Dicyandiamide (DCD, 15% of Urea-N in quantity), Urea+5% Allylthiourea (ATU, 5% of Urea-N in quantity). Meanwhile, the dynamics of different microbial abundances in treatments were also quantified by real-time quantitative PCR (qPCR). The results showed that ammonia-oxidizing bacteria (AOB) predominated intensive nitrification process and N2O emission in soil with urea application. Urea stimulated AOB growth and increased cumulative N2O by 235%, which rapidly occurred during the first 14 days. Bactria abundance raised in response to urea and improved CO2emission by 18.5%. Urea+DCD severely inhibited AOB and decreased N2O emission by 59.4%, but stimulated bacteria and increased CO2by 50.6%. Urea+ATU exhibited a strong toxicity on both bacteria and fungi and led to a decrease of CO2by 28.4%, but unexpectedly didn't show any inhibition on nitrification intensity. A slight but significant inhibition and stimulation were observed on AOB and denitrifiers by ATU, respectively, but total emission of N2O fell by 35.2%. CH4emission was inhibited in all treatments with urea and inhibitors. GWPs of N2O, CO2and CH4displayed significant differences among treatments: Urea+DCD>Urea>CK>Urea+ATU. The contributions of N2O and CO2to GWP exceeded 98.4% in soil. This study implies various mechanisms of nitrification inhibitors on soil microbial guilds and GHG emission, and is essential for the implementation of agricultural management and the evaluation of global climate change.

Greenhouse gas; Soil microorganism; Nitrogen turnover; Allylthiourea; Dicyandiamide

X171; S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.03.010

沈曉憶, 夏圍圍, 張潔, 等. 硝化抑制劑與尿素配施對旱地土壤溫室氣體排放及硝化微生物的影響. 土壤, 2021, 53(3): 512–521.

國家自然科學基金項目(41501267)和土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室開放課題項目(Y20160025)資助。

(wwxia@nuist.edu.cn)

沈曉憶(2000—)，女，江蘇蘇州人，本科生，主要研究方向為農(nóng)田土壤硝化過程的調(diào)控機理。E-mail:shen_xiaoyi0721@163.com