謝輝輝，楊登浩，付榮波，趙澤駒

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 泌尿外科， 貴州 遵義 563099)

輸尿管長(zhǎng)段或全段缺損的替代治療主要采用回腸，術(shù)后并發(fā)癥多而呈現(xiàn)多種改良，但始終未能顯著降低并發(fā)癥發(fā)生率[1]。裁剪去粘膜回腸輸尿管短期實(shí)驗(yàn)研究顯示效果較好，并發(fā)癥顯著降低，但其管壁損傷、感染和尿液刺激勢(shì)必誘發(fā)炎癥反應(yīng)，術(shù)后管壁纖維化可能性較大，遠(yuǎn)期效果如何尚且不知[2]。Collagen III和Smad2是公認(rèn)的組織損傷、炎癥至纖維化的關(guān)鍵因子，檢測(cè)其在1年期模型犬回腸輸尿管中的表達(dá)，結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，可以評(píng)估裁剪去粘膜回腸輸尿管穩(wěn)定性和遠(yuǎn)期效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用比格犬5只，1～2歲齡，12～13 kg/只，購(gòu)買于陸軍醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(倫理審查編號(hào)：KLLY(A)-2019-033)，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SP級(jí))，飼養(yǎng)2周后實(shí)施手術(shù)。

1.1.2 主要試劑 RNA Trizol Reagent(批號(hào)vs18061730)，購(gòu)自合肥博美生物科技有限公司生產(chǎn)； TBGreen TM Premix Ex TaqTM Ⅱ(貨號(hào)RR820A)，RT-PCR：PrimeScript RT reagent Kit(貨號(hào)RR047A)，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；抗體 Collagen III抗體，兔克隆抗體(貨號(hào)：22734-1-ap)，購(gòu)自Proteintech公司；Smad2抗體，兔克隆抗體(貨號(hào)：a7699)，購(gòu)自ABClone公司；β-actin抗體，鼠克隆抗體，(貨號(hào)：T0022)，購(gòu)自Affinity公司；生物素化山羊抗鼠抗兔IgG(H+L)，(貨號(hào)：ab6789、貨號(hào)：ab6721)，購(gòu)自英國(guó)Abcam--艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；目的基因一抗： Collagen Ⅲ，兔多克隆抗體(貨號(hào)：bs-0549)，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Smad2，兔多克隆抗體，(貨號(hào)BA0412)，購(gòu)自BOSTER公司；生物素二抗：山羊抗兔工作液，(貨號(hào)SP-9001)，購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立與取樣 實(shí)驗(yàn)用5只比格犬，雌雄比為2∶3，參照前期實(shí)驗(yàn)方法建立動(dòng)物模型[3]，術(shù)前禁食 12 h，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后、取仰臥位、備皮，消毒鋪巾后、取腹正中線開(kāi)腹、探查，分離、顯露、切除左腎及輸尿管，結(jié)扎并縫扎腎蒂及輸尿管遠(yuǎn)端；顯露膀胱、找到右側(cè)輸尿管，充分游離至右腎門(mén)，于腎盂輸尿管連接部及膀胱輸尿管連接部切除整段右側(cè)輸尿管，并縫扎膀胱輸尿管連接部斷端；距回盲部約10 cm處取帶蒂回腸段約13～15 cm,原回腸于系膜前端端吻合,恢復(fù)連續(xù)性,間斷縫合關(guān)閉系膜裂口。帶蒂回腸段用0.05%碘伏沖洗致無(wú)渣,鉗夾固定對(duì)系膜側(cè)1/2腸壁,縱向裁剪切除;系膜側(cè)腸片粘膜剝脫，包裹F10號(hào)橡膠導(dǎo)尿管，3-0可吸收線連續(xù)鎖邊縫合成管狀，用F5號(hào)雙“J”管替換導(dǎo)尿管，近端與右腎盂、遠(yuǎn)端與膀胱吻合; 檢查代輸尿管無(wú)尿瘺及缺血，腹腔無(wú)出血及腸扭轉(zhuǎn),術(shù)區(qū)噴灑甲硝唑，關(guān)腹，術(shù)后觀察犬存活狀態(tài),常規(guī)使用頭孢3～5 d，做好飼養(yǎng)記錄，觀察進(jìn)食、排便和排尿、活動(dòng)情況，期間因腸梗阻死亡一只(雄性)，存活4只。術(shù)后4周拔出雙“J”管，1年后取樣，取樣前于麻醉下實(shí)施靜脈腎盂造影(IVU)后，解剖觀察腹腔、回腸輸尿管在體狀態(tài),切取回腸代輸尿管4條，同時(shí)切取回腸遠(yuǎn)段約3.0 cm腸段做對(duì)照；樣本組織各取1份儲(chǔ)存于﹣80℃冰箱，另1份用10%福爾馬林固定。

1.2.2 HE與Masson染色 固定24 h樣本，按常規(guī)HE和Masson制作方法，制備石蠟切片并染色，封片后采集圖像及分析。

1.2.3 免疫組化 參照試劑盒說(shuō)明，用SP法檢測(cè)Collagen III和Smad2的表達(dá)。切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉后，滴加一抗后4 ℃孵育過(guò)夜，次日，滴加生物素化二抗室溫孵育30 min，后進(jìn)行DAB顯色，鏡下控制反映時(shí)間、蒸餾水洗滌、蘇木素染色、脫水透明后，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察Collagen III和Smad2的表達(dá)，陽(yáng)性結(jié)果呈黃色或棕黃色，并用Image-Pro Plus 6.0分析計(jì)算平均光密度。

1.2.4 Western blot 分別取各組織樣本，加RIPA裂解液，冰上裂解、離心取上清液；提取蛋白后，用BCA蛋白定量法測(cè)定濃度，制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品。根據(jù)試劑盒說(shuō)明配膠，加樣，電泳1.5 h，半干法轉(zhuǎn)膜1～2 h，再用脫脂牛奶2 h封閉，洗膜；將PVDF膜放入一抗中，(一抗?jié)舛龋篊ollagen III1：1 000；Smad2 1∶1 000；β-actin 1∶5 000)，搖床上輕搖，4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜；再將PVDF膜放入相應(yīng)二抗中(生物素化山羊抗兔抗鼠IgG(H+L)1∶5 000)，搖床輕搖，室溫孵育2～3 h；洗膜。用ECL顯影，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)獲取曝光圖像并測(cè)定分析目的蛋白相對(duì)光密度積分值。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè) 按照動(dòng)物組織RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)采用Trizol法提取總RNA、檢測(cè)濃度并配置標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品。引物設(shè)計(jì)Collagen III：上游GACCTGGTTGCTTCTCGCTCTG，下游ATTTGGCACGGTTCTGGCTTCc；Smad-2：上游TGCTGCTCTCCTGGCTCAGTC，下游GTGCTCGTTACCGTCTGCCTTC；按照試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴(kuò)增(條件：先95 ℃預(yù)變性30 s，后95 ℃變性5 s，然后55 ℃退火30 s，再72 ℃充分延伸30 s，循環(huán)45次)；以β-actin為對(duì)照，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，采用2- △△CT值方法對(duì)目的基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)與組織病理 模型犬術(shù)后1年時(shí)存活4只，1只腸梗阻死亡。IVU：腎、輸尿管顯影，輸尿管蠕動(dòng)存在、排尿通暢，管腔無(wú)明顯狹窄(見(jiàn)圖1A)；在體觀察腹腔無(wú)明顯積液、積膿，回腸輸尿管周圍輕度粘連，未觸及疤痕疙瘩，分離后見(jiàn)其外形完整，蠕動(dòng)存在；剖開(kāi)見(jiàn)管壁厚薄均勻，無(wú)局部增厚與變薄，管腔光滑，無(wú)明顯狹窄，管壁柔軟(見(jiàn)圖1B、C)。實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組回腸壁結(jié)構(gòu)完整，HE和Masson染色由內(nèi)向外可見(jiàn)粘膜層、粘膜下層、肌肉及漿膜層，各層界限清楚、無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原層無(wú)顯著增厚(見(jiàn)圖2、3)。

A：IVU腎輸尿管顯影；B和C：CMSPI無(wú)擴(kuò)張、管腔通暢、管壁均勻、腔面光滑。圖1 裁剪去粘膜回腸輸尿管(CMSPI)造影及肉眼觀

A：正常回腸；B： CMSPI四層結(jié)構(gòu)；HE×40。圖2 正?；啬c與裁剪去粘膜回腸輸尿管CMSPI粘膜結(jié)構(gòu)HE染色對(duì)比

2.2 免疫組化 Collagen III在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)、Smad2在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)中見(jiàn)棕黃色顆粒，即陽(yáng)性表達(dá)，未見(jiàn)棕黃色顆粒，即陰性表達(dá)(見(jiàn)圖4)。對(duì)照組組織中未見(jiàn)棕黃色顆粒，實(shí)驗(yàn)組偶見(jiàn)淡黃色顆粒，Collagen III兩組IOD值比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，Smad2實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。

2.3 Western blot 正?；啬c及正常輸尿管與CMSPI中Collagen III和Smad2表達(dá)量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖5)。

A：正常回腸；B :CMSPI四層結(jié)構(gòu)；Masson×40。圖3 正常回腸與裁剪去粘膜回腸輸尿管(CMSPI)粘膜結(jié)構(gòu)Masson染色對(duì)比

A、B：正常回腸與CMSPI中Collagen III表達(dá)檢測(cè)(SP×400)，僅CMSPI有少量表達(dá)；C、D：正?；啬c與CMSPI中Smad2表達(dá)檢測(cè)(SP×400)，兩組均少量表達(dá)；黃色箭頭為陽(yáng)性表達(dá)。圖4 正常回腸與裁剪去粘膜回腸輸尿管(CMSPI)免疫組化結(jié)果對(duì)比

A：Western blotting檢測(cè)Collagen III和Smad2表達(dá)量條帶；B：Collagen III表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)分析；C ：Smad2表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)分析；采用單因素方差分析檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，結(jié)果正常回腸與CMSPI兩者P>0.05；(ILEUM：正?；啬c；Ureter：正常輸尿管；1CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管上段、2CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管中段、3CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管下段)。圖5 Western blotting檢測(cè)正?；啬c、正常輸尿管、裁剪去粘膜回腸輸尿管(CMSPI)中Collagen III，Smad2表達(dá)水平

2.4 Real-time PCR CMSPI與正?；啬cCollagen III及Smad2表達(dá)量比較無(wú)顯著差異(P>0.05，見(jiàn)圖6)。

A： Collagen III相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)； B： Smad2相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)；*：與ILEUM相比P<0.05；(ILEUM：正?；啬c；1CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管上段、2CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管中段、3CMSPI：裁剪去粘膜回腸輸尿管下段)。圖6 RT-PCR檢測(cè)正?；啬c、裁剪去粘膜回腸(CMSPI)Collagen III和Smad2基因表達(dá)水平

3 討論

臨床上超過(guò)15cm以上輸尿管缺損較為少見(jiàn)，主要是醫(yī)源性因素所致，多采用回腸代輸尿管治療[4]。該方法術(shù)后感染、梗阻、返流和尿中廢物重吸收等并發(fā)癥較為常見(jiàn)，其它方法雖多，皆因代輸尿管形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能、并發(fā)癥發(fā)生率缺乏顯著優(yōu)勢(shì)而應(yīng)用較少[4]。裁剪去粘膜回腸代輸尿管實(shí)驗(yàn)研究表明其優(yōu)勢(shì)明顯[3,5]。但回腸裁剪、粘膜剝脫、尿液刺激和粘膜下層暴露等均可誘導(dǎo)腸壁炎癥纖維化，代輸尿管隨時(shí)間延長(zhǎng)是否纖維化存在諸多不確定性。需要延長(zhǎng)模型犬飼養(yǎng)時(shí)間，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能變化，監(jiān)測(cè)與組織纖維化密切相關(guān)的指標(biāo)予以論證，方能評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性和長(zhǎng)期效果。

本實(shí)驗(yàn)采用的回腸裁剪及粘膜剝脫法主要損傷位點(diǎn)在腸上皮細(xì)胞粘膜層與粘膜下層之間，而腸壁嚴(yán)重挫傷、慢性炎癥性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎和腸結(jié)核常至腸壁纖維增生、僵硬、管腔狹窄和功能喪失，其因是激活了以TGF-β/Smad為主的組織炎癥纖維化通路，形成大量肌成纖維細(xì)胞，分泌膠原致細(xì)胞外過(guò)度沉積、纖維增生疤痕形成[6-9]。Collagen III和Smad2在其中發(fā)揮了重要作用[10]。Collagen III是內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化為肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞的主要產(chǎn)物之一，主要由肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)炎癥和損傷發(fā)生時(shí)、在炎性腸病腸組織纖維化以及肝纖維中是主要增生纖維成分之一。Smad2是促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)的組織纖維化的主要下游調(diào)控因子，與Smad3耦合磷酸化后TGF-β1介導(dǎo)的纖維化通路信號(hào)才能得以下傳，而后促進(jìn)組織纖維化[11]。因此Collagen III和 Smad2過(guò)度或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)志著組織纖維化，檢測(cè)其在對(duì)照與實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)差異可以論證炎癥纖維化通路是否激活，是否存在纖維化。本實(shí)驗(yàn)組中裁剪去粘膜回腸輸尿管1年期造影顯示形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能較好，與術(shù)后短期間無(wú)明顯差異，動(dòng)力存在，排尿通暢；粘膜下層及肌層未見(jiàn)大量膠原沉積和管壁增厚；回腸代膀胱和回腸代輸尿管術(shù)后未見(jiàn)腸壁纖維化報(bào)道，裁剪去粘膜回腸代輸尿管實(shí)驗(yàn)中亦未見(jiàn)腸纖維化現(xiàn)象，回腸經(jīng)歷的這些損傷與刺激視乎不足以誘導(dǎo)或激活組織纖維化通路[12-13]。實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組回腸壁組織細(xì)胞中Collagen III和Smad2在蛋白與分子水平的變化也無(wú)顯著差異，且免疫組化結(jié)果顯示Smad2實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組反而下降，其中機(jī)理目前尚不清楚，推測(cè)主要原因?yàn)榛啬c即使經(jīng)歷裁剪、粘膜剝脫、輸尿管重建與尿液長(zhǎng)期刺激，在缺乏細(xì)胞環(huán)境與微循環(huán)支撐的條件下不能激活TGF-β/Smad通路亦或是通路下傳受阻，完整的粘膜下層發(fā)揮了阻滯炎癥纖維化的重要作用，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。裁剪去粘膜回腸代輸尿管短期與1年期出現(xiàn)相同形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)是腸壁未發(fā)生纖維化、功能相對(duì)穩(wěn)定。

原因可能與粘膜剝脫、粘膜下層完整有關(guān)。去粘膜雖然損傷腸壁，局部滲出增加，早期呈現(xiàn)炎癥水腫和細(xì)胞浸潤(rùn)，但該層為細(xì)胞外基質(zhì)，缺乏微循環(huán)和細(xì)胞條件支撐，致炎因素刺激不能啟動(dòng)細(xì)胞炎癥纖維化連鎖反應(yīng)；粘膜下層完整阻斷了炎細(xì)胞向深層浸潤(rùn)，防止了細(xì)胞性炎癥反應(yīng)；粘膜下層大量活性細(xì)胞因子及纖維蛋白溶解酶激活了纖溶過(guò)程，對(duì)抗了早期分泌增加的纖維，維持了組織增生與降解平衡[14]。

綜上所述，裁剪去粘膜回腸代輸尿管未因時(shí)間延長(zhǎng)管壁形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，Collagen III和Smad2未因腸壁結(jié)構(gòu)改造和尿液刺激出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)，說(shuō)明其管壁不存在纖維化問(wèn)題，有助于長(zhǎng)期穩(wěn)定。