覃媛媛，楊宗榮，羅艷珠，溫吉星

（1. 云南省楚雄彝族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 楚雄 675000； 2. 云南龍發(fā)制藥股份有限公司，云南 楚雄 675000）

彝心康膠囊由雞血藤、燈盞細(xì)辛、五氣朝陽(yáng)草、透骨草等7 味中藥材經(jīng)提取制成的彝藥制劑，功效為理氣活血、通經(jīng)止痛（彝醫(yī)稱(chēng)為烏諾衣諾、四乃土），臨床用于治療氣滯血瘀所致胸痹心痛、心悸怔忡，以及冠心病、缺血性腦血管病見(jiàn)上述癥狀者。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[WS－10277（ZD－0277）－2002]，鑒別項(xiàng)下僅有姜黃及木香的薄層鑒別，含量項(xiàng)下僅有虎杖中大黃素的含量測(cè)定。本研究中新增薄層色譜（TLC）法對(duì)雞血藤和燈盞細(xì)辛進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定虎杖中虎杖苷和燈盞細(xì)辛中野黃芩苷含量，旨在提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1100 型高效液相色譜儀，含VWD 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；BP211D 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯電子公司，精度為0.01 mg）；MS304 TS／02 型電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司，精度為0.1 mg）；GoodLook－1000 型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?；ELGA 超純水機(jī)（法國(guó)威立雅公司）；SB25－12DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；薄層預(yù)制G 板（青島海洋化工廠分廠、煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所、德國(guó)Merck 公司）。

1.2 試藥

芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)111703－201504，供鑒別用），虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)為111575－201603，含量為87.3%），野黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110758－201616，含量為91.7% ），雞血藤對(duì)照藥材（批號(hào)為121173－201805），燈盞細(xì)辛對(duì)照藥材（批號(hào)為121269－201103），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；彝心康膠囊（批號(hào)分別為180501，180502，180503，180504，180901，180902，180903，180904，181001，181002），陰性樣品，均購(gòu)自云南龍發(fā)制藥股份有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

雞血藤：取樣品內(nèi)容物1.5 g，精密稱(chēng)定，加乙醇40 mL，超聲(功率200 W，頻率40 kHz，下同)處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用乙酸乙酯10 mL 振搖提取，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，經(jīng)中性氧化鋁柱（中性氧化鋁200 ～300 目，5 g，內(nèi)徑為1.5 cm，干法裝柱），用80%甲醇60 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對(duì)照藥材1 g，加水50 mL，煎煮30 min，濾過(guò)，濾液加乙酸乙酯振搖提取3 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取芒柄花素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的對(duì)照品溶液。取缺雞血藤的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。照TLC法試驗(yàn)，精密吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液各4 μL，對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇（20 ∶1，V／ V）為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15 ～30 min，展開(kāi)，取出，晾干，置氨氣中熏后，在紫外光（254 nm）燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 A。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

燈盞細(xì)辛：取樣品內(nèi)容物1.5 g，精密稱(chēng)定，加0.2%碳酸氫鈉溶液15 mL，浸泡過(guò)夜，濾過(guò)，濾液用稀硫酸調(diào)pH 至3.0，加無(wú)水甲醇20 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用正丁醇振搖提取2 次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。另取燈盞細(xì)辛對(duì)照藥材1 g，同其供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。取野黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的對(duì)照品溶液。取缺燈盞細(xì)辛的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液，照TLC 法試驗(yàn)，吸取上述4 種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以冰醋酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1 B。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.2%磷酸溶液（14 ∶86，V／ V）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取虎杖苷和野黃芩苷對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇制成每1 mL 含野黃芩苷40.348 μg 和虎杖苷111.744 μg 的混合對(duì)照品溶液。取樣品內(nèi)容物0.3 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。分別取不含虎杖藥材和不含燈盞細(xì)辛藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺虎杖的陰性對(duì)照品溶液、缺燈盞細(xì)辛的陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同色譜峰，且主峰與相鄰色譜峰能完全分離，峰形良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾；理論板數(shù)以虎杖苷峰和野黃芩苷峰計(jì)應(yīng)不低于5 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液1，2，3，5，10，15 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得虎 杖 苷 回 歸 方 程 Y1＝2 017.363 X1＋182.490（R2＝0.999 2，n ＝6），野黃芩苷回歸方程Y2＝2 844.953 X2＋44.924（R2＝0.999 5，n ＝6）。結(jié)果表明，虎杖苷和野黃芩苷進(jìn)樣量分別在0.112 ～1.676 μg 和0.040 ～0.605 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果虎杖苷和野黃芩苷平均峰面積分別為2 675.672 和1 274.369，RSD 分別為0.68%和0.38%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液和供試品（批號(hào)為180501）溶液，室溫下按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果混合對(duì)照品溶液和供試品溶液中虎杖苷和野黃芩苷峰面積的RSD 分別為0.40%和0.32%，1.33%和1.19%（n ＝8），表明2 種溶液室溫下24 h 內(nèi)均穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為180501）樣品內(nèi)容物6 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果虎杖苷和野黃芩苷平均含量分別為8.351 5 mg／g 和2.657 6 mg／g，RSD 分別為0.63%和0.35%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱(chēng)取已知含量的樣品（批號(hào)180501）內(nèi)容物6 份，每份0.15 g，精密加入相當(dāng)于樣品中所含虎杖苷和野黃芩苷量100%的對(duì)照品貯備液，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取10 批樣品，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10 批樣品中虎杖苷和野黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果（mg／粒，n ＝2）Tab.2 Content determination of polydatin and scutellarin in 10 batches of samples（mg／capsule，n ＝2）

3 討論

3.1 TLC 條件篩選

雞血藤：雞血藤TLC 為新增項(xiàng)，在進(jìn)行方法摸索時(shí)，首先參照2015 年版《中國(guó)藥典(一部)》[1]（注：作者試驗(yàn)時(shí)2020 年版《中國(guó)藥典》尚未正式執(zhí)行，且2020 年版《中國(guó)藥典》此項(xiàng)無(wú)改動(dòng)，下同）中“雞血藤”鑒別項(xiàng)下方法，因樣品為復(fù)方制劑，其余處方藥材對(duì)雞血藤的干擾較大，TLC 結(jié)果欠佳，后參照2015 年版《中國(guó)藥典(一部)》“花紅片”項(xiàng)下鑒別（3）、“花紅膠囊”項(xiàng)下鑒別（3）、“止痛化片”項(xiàng)下鑒別（6）及文獻(xiàn)[2－3]的展開(kāi)系統(tǒng)確定了雞血藤的TLC 方法。以上資料中均僅使用對(duì)照藥材作為對(duì)照，通過(guò)文獻(xiàn)[4]確定芒柄花素為雞血藤中特征性成分，因此加入芒柄花素對(duì)照品協(xié)同雞血藤對(duì)照藥材作為雙對(duì)照。

燈盞細(xì)辛：燈盞細(xì)辛TLC 為新增項(xiàng)，由文獻(xiàn)[5]可知，燈盞細(xì)辛中含有野黃芩苷、咖啡酸等化學(xué)成分，通過(guò)文獻(xiàn)[6]確定了燈盞細(xì)辛的TLC 方法。在預(yù)試驗(yàn)中同時(shí)也增加了咖啡酸對(duì)照品，但相同的TLC 條件下咖啡酸對(duì)照品斑點(diǎn)不明顯，因此最終未選擇咖啡酸作為對(duì)照。

3.2 TLC 耐用性考察

分別采用前述不同來(lái)源的薄層板，分別在無(wú)飽和、預(yù)飽和30 min、預(yù)飽和60 min，低溫（5 ～15 ℃）、常溫（20 ～30 ℃）、高溫（40 ～50 ℃），低濕度（相對(duì)濕度30% ～40%）、高濕度（相對(duì)濕度65% ～75%）條件下考察，均能獲得良好的色譜分離效果，斑點(diǎn)清晰、圓整，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。雞血藤TLC 在不飽和的情況下會(huì)發(fā)生邊緣效應(yīng)，故規(guī)定預(yù)飽和時(shí)間為15 ～30 min，進(jìn)而形成文中有效的鑒別方法。

3.3 HPLC 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

通過(guò)文獻(xiàn)[5，7]可知，虎杖和燈盞細(xì)辛中分別含有虎杖苷、野黃芩苷2 種有效成分。分別取虎杖苷對(duì)照品和野黃芩苷對(duì)照品，用甲醇溶解后，以甲醇作空白對(duì)照，在紫外可見(jiàn)區(qū)進(jìn)行全波段掃描，虎杖苷和野黃芩苷分別在318 nm 和335 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，結(jié)合紫外響應(yīng)值大小、色譜峰峰形尖銳、陰性無(wú)干擾等條件，選擇335 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 HPLC 方法選擇

流動(dòng)相：在摸索虎杖和燈盞細(xì)辛的含量測(cè)定方法時(shí)，參考2015 年版《中國(guó)藥典(一部)》[1]中“虎杖”“護(hù)肝寧片”“燈盞細(xì)辛”“燈盞生脈膠囊”“燈盞花素片”含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件及文獻(xiàn)[8－9]，分別考察了乙腈－水（15 ∶85 和23 ∶17，V／ V），乙腈－0.2%磷酸溶液（15 ∶85 和14 ∶86，V／ V），甲醇－0.2%磷酸溶液（35 ∶65 和30 ∶70，V／ V），乙腈－四氫呋喃－0.2%磷酸溶液（14 ∶14 ∶72，V／ V／ V）等不同配比作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，乙腈－0.2%磷酸溶液（14 ∶86，V／ V）為最佳流動(dòng)相，能使被測(cè)成分與其他成分較好地分離，峰形好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

提取溶劑和提取方法：考察了水、稀乙醇、50%甲醇、甲醇4 種溶劑的提取效果，采用50%甲醇提取時(shí)得率最高，測(cè)定無(wú)干擾，測(cè)定峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度均在1.5 以上，故采用50%甲醇作為提取溶劑。同時(shí)考察了超聲處理（250 W，50 kHz）、60 ℃振搖、加熱回流3 種提取方法的效果，結(jié)果顯示，超聲提取和加熱回流提取對(duì)2 種有效成分的影響相似，但超聲提取操作簡(jiǎn)單易行，故采用超聲提??；以50%甲醇為溶劑時(shí)，考察了超聲處理（250 W，50 kHz）15，30，45，60 min 對(duì)2 種有效成分提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)超聲30 min 時(shí)2 種有效成分基本提取完全，故被選用。

耐用性：同時(shí)對(duì)不同廠家、型號(hào)色譜柱（Agilent Eclipse XDB－C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent 5 HC－C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），Thermo AcclaimTM120－C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Shiseido CAPCELL PAK MGⅡ－C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），不同柱溫（25，30，35，40 ℃），不同流速（0.8，1.0，1.2 mL／min）條件進(jìn)行了考察，結(jié)果上述色譜條件的色譜峰峰形、分離度、理論板數(shù)發(fā)生一定程度變化時(shí)，均能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，耐用性較好。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的TLC 法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高，HPLC 法簡(jiǎn)便可行，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可用于彝心康膠囊的質(zhì)量控制。