朱志承，楊 柏

(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院 超分子結(jié)構(gòu)與材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130012)

1 引 言

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的檢測方式難以滿足人們在環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷、生物檢測方面的信息獲取需求，如何制備與發(fā)展新型傳感器以求對生物分子及金屬離子實(shí)現(xiàn)快速靈敏檢測是亟待解決的問題。近年來，基于熒光的傳感技術(shù)因其靈敏度高、響應(yīng)時間短、成本低廉、檢測方便等優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注。研究者們設(shè)計開發(fā)了多種熒光傳感材料，其中常用的熒光基元包括有機(jī)熒光染料[1]、半導(dǎo)體量子點(diǎn)[2]和稀土熒光材料[3]，同時還有其他熒光材料如熒光蛋白、有機(jī)聚合物點(diǎn)和AIE納米點(diǎn)。但是在實(shí)際應(yīng)用的過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)這些材料都有著固有的、難以克服的缺陷。例如，有機(jī)熒光染料存在著光穩(wěn)定性差、壽命短以及斯托克斯位移小的問題，而當(dāng)研究者們嘗試將量子點(diǎn)與稀土熒光材料作為替代的熒光基元時，它們的高毒性以及高成本又成為了實(shí)際應(yīng)用的巨大阻礙。因此，開發(fā)一種合適的熒光基元是熒光生物傳感器制備的關(guān)鍵之一。碳點(diǎn)(Carbon dots, CDs)作為一種新型熒光納米材料[4]，由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征，在生物標(biāo)記成像、傳感、防偽、光電設(shè)備以及催化領(lǐng)域獲得了廣泛的關(guān)注。在熒光傳感方面，相較于傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)以及稀土熒光材料，碳點(diǎn)具有光學(xué)性質(zhì)突出、生物相容性好、毒性低、制備簡單等特點(diǎn)，這使得碳點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于生物成像與生物檢測的熒光生物傳感器制備當(dāng)中[5]。

熒光生物傳感器有兩個關(guān)鍵組成部分：目標(biāo)識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊。目標(biāo)識別依靠的是探針與目標(biāo)物質(zhì)的特異性結(jié)合能力，如離子對結(jié)合[6]、抗原抗體[7]、核酸雜交[8]、酶與底物相互作用[9]等，目前常用的識別材料有抗體、酶和適配體(Aptamer,Apt)[5,10]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)則是傳感器將目標(biāo)識別過程中所產(chǎn)生的物理化學(xué)變化轉(zhuǎn)換為可檢測的熒光信號，納米粒子是目前常用的轉(zhuǎn)導(dǎo)材料[11]。對碳點(diǎn)與適配體構(gòu)造的熒光生物傳感器而言，目標(biāo)識別的過程由適配體與目標(biāo)物質(zhì)的特異性結(jié)合完成，通過檢測結(jié)合前后碳點(diǎn)熒光行為(熒光強(qiáng)度、發(fā)射波長、熒光壽命等)的變化則可以實(shí)現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。本文將對基于碳點(diǎn)與適配體構(gòu)建的熒光生物傳感器發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，先簡要介紹碳點(diǎn)及適配體的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)特點(diǎn)，然后著重總結(jié)近年來基于碳點(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器的構(gòu)建方式、傳感機(jī)理及應(yīng)用范圍。

2 碳點(diǎn)的制備與性質(zhì)

碳點(diǎn)是一種尺寸小于10 nm的新型零維碳基納米材料，在2004年由Xu等首次通過物理方式從電弧放電產(chǎn)生的煙灰中純化得到[4]。兩年后，Sun等通過激光燒蝕法以石墨靶為碳源合成出熒光碳納米顆粒，并首次將其命名為碳點(diǎn)[12]。隨著研究的進(jìn)行，人們發(fā)展了“自上而下”和“自下而上”的制備途徑[13-14]?！白陨隙隆狈ㄖ饕峭ㄟ^氧化與剝離的方式切割具有大塊sp2碳結(jié)構(gòu)的石墨基材料，例如石墨粉、碳納米管、碳纖維、炭黑等[14]。涉及的主要方法有電弧放電[4]、激光燒蝕[12,15]、電化學(xué)氧化[16-17]、化學(xué)刻蝕[18-19]等。由“自上而下”法制備出的碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)較為清晰，易于進(jìn)行發(fā)光機(jī)制與結(jié)構(gòu)特征的研究，但其制備過程復(fù)雜，熒光量子產(chǎn)率較低，往往需要進(jìn)行后處理鈍化[20]，且原料來源單一，元素組成單調(diào)，這大大阻礙了碳點(diǎn)的進(jìn)一步發(fā)展。2013年，我們課題組Zhu等以檸檬酸、乙二胺為原料，采用一步水熱的方法制備出具有超高熒光量子產(chǎn)率(80%)的聚合物類碳點(diǎn)材料[21]，實(shí)現(xiàn)了碳點(diǎn)在熒光效率上的突破。自此之后，這種由小分子為原料出發(fā)的“自下而上”法廣泛地應(yīng)用于碳點(diǎn)的合成之中，碳點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與性能獲得了極大的豐富?！白韵露稀狈ㄖ苽涮键c(diǎn)通常涉及聚合、交聯(lián)、碳化的過程[22]，其具體制備方法主要包括水熱/溶劑熱法[21,23-25]、熱解法[6]、微波輔助法[26-27]以及模板法[28-29]。由“自下而上”法制備的碳點(diǎn)具有結(jié)構(gòu)組成獨(dú)特、熒光性質(zhì)突出、加工性能優(yōu)異等特點(diǎn)。

由于合成方式與前體材料的多樣化，碳點(diǎn)材料具有多種結(jié)構(gòu)特征，因此碳點(diǎn)是一大類材料的統(tǒng)稱。雖然目前關(guān)于碳點(diǎn)的分類仍有爭論，但人們逐漸接受將碳點(diǎn)依據(jù)結(jié)構(gòu)特征分為石墨烯量子點(diǎn)(Graphene quantum dots,GQDs)、碳量子點(diǎn)(Carbon quantum dots,CQDs)以及碳化聚合物點(diǎn)(Carbonized polymer dots,CPDs)[22,30-32]。GQDs是由單層或小于5層的石墨片層構(gòu)成的具有各向異性的二維納米材料，其表面或邊緣連接有化學(xué)基團(tuán)。CQDs的提出參考了傳統(tǒng)量子點(diǎn)的概念，但研究發(fā)現(xiàn)兩者在合成與結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與應(yīng)用方面有著較大差異，不能一概而論[33]。GQDs的發(fā)光行為主要受碳核上的π共軛域及表面化學(xué)基團(tuán)影響。CQDs通常具有三維類球形結(jié)構(gòu)，其橫向尺寸與縱向尺寸類似，可以通過“自上而下”法從大塊碳材料上剝落，也可由具有周期性高度對稱結(jié)構(gòu)的小分子通過“自下而上”法合成[22]。由小分子或聚合物通過“自下而上”的方式合成的碳點(diǎn)大部分屬于CPDs的范疇，其形成過程會經(jīng)歷聚合與碳化兩個階段，隨著碳化程度的增加，CPDs表面的功能基團(tuán)或聚合物鏈逐漸減少，碳核內(nèi)部的結(jié)晶度逐漸升高，最后形成結(jié)晶度較高的CQDs[22,31]。因此CPDs是適度交聯(lián)、適度碳化的表面存在聚合物短鏈與官能基團(tuán)，內(nèi)部輕微石墨化的具有核殼結(jié)構(gòu)的類球狀功能材料。CPDs的概念由我們課題組提出，其很好地闡述了碳點(diǎn)的形成過程與結(jié)構(gòu)特征，我們課題組近期也通過多種表征手段證明了CPDs表面的聚合物鏈結(jié)構(gòu)[23]。CPDs的合成前體物質(zhì)多樣，不僅可以選擇小分子、聚合物，還可選擇天然產(chǎn)物作為前體物質(zhì)，通過設(shè)計不同的前體物質(zhì)與反應(yīng)條件，可以實(shí)現(xiàn)B、N、O、S、金屬離子等多種元素?fù)诫s，這使得碳化聚合物點(diǎn)的性能更加多樣化。

碳點(diǎn)優(yōu)異的熒光性質(zhì)是其最引人入勝之處，例如較強(qiáng)的光吸收、高熒光量子產(chǎn)率、可調(diào)的熒光發(fā)射以及抗光猝滅性等。不同種類碳點(diǎn)的熒光吸收與熒光發(fā)射行為有著較大的差別，這些差別主要源于不同的前體原料與合成方法，它們會導(dǎo)致碳點(diǎn)具有不同的碳核結(jié)構(gòu)和表面基團(tuán)[30]。例如，Jiang等以苯二胺的鄰間對同分異構(gòu)體為原料，通過溶劑法合成了分別具有紅綠藍(lán)三種熒光發(fā)射的碳點(diǎn)材料[24]。這三種碳點(diǎn)具有相似的表面基團(tuán)結(jié)構(gòu)，但粒徑與含氮量有著較大區(qū)別，隨著熒光發(fā)射波長的紅移，碳點(diǎn)的粒徑與含氮量逐漸升高(圖1(a))。除了改變前體原料種類，碳點(diǎn)的熒光發(fā)射還可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)物的比例和反應(yīng)條件來調(diào)節(jié)。如圖1(b)所示，Miao等通過檸檬酸和尿素的熱裂解合成了多色發(fā)光碳點(diǎn)[25]。他們通過控制檸檬酸/尿素的比例和反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)了碳點(diǎn)熒光發(fā)射由藍(lán)到紅的可控調(diào)節(jié)。經(jīng)過多種儀器表征之后，他們認(rèn)為碳核內(nèi)有效共軛長度和碳點(diǎn)表面官能團(tuán)數(shù)量的增加是碳點(diǎn)熒光由藍(lán)到紅轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。除了可調(diào)的熒光發(fā)射，Tao等以聚丙烯酸與乙二胺為原料實(shí)現(xiàn)了無金屬室溫磷光發(fā)射碳點(diǎn)材料的制備，并在研究中詳細(xì)驗(yàn)證了交聯(lián)增強(qiáng)發(fā)射效應(yīng)對碳點(diǎn)室溫磷光發(fā)射的影響[34](圖1(c))。另一方面，具有超窄熒光發(fā)射半峰寬碳點(diǎn)的制備近期也取得了很大進(jìn)展。Liu等以紅豆杉干葉為原料制備了半寬峰達(dá)到20 nm、熒光量子產(chǎn)率達(dá)到59%的深紅色發(fā)光CPDs，并成功應(yīng)用于生物成像[23](圖1(d))。由于碳點(diǎn)有著光學(xué)性能出色、結(jié)構(gòu)性質(zhì)優(yōu)異、生物相容性好及易制備的性質(zhì)，在生物醫(yī)藥、防偽、傳感、催化、發(fā)光二極管、光伏器件等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[30,32,35-37]。

圖1 (a)(ⅰ)用3種不同的苯二胺異構(gòu)體制備紅綠藍(lán)三色CDs，(ⅱ)m-CDs、o-CDs和p-CDs在日光下(左)和λ=365 nm紫外線照射下(右)的照片[24]；(b)不同CA/尿素量比和不同反應(yīng)溫度下CDs的最大發(fā)射峰位[25]；(c)用于圖形安全和數(shù)字信息加密的RTP CPDs[34]；(d)具有超窄半峰寬的深紅熒色發(fā)射CPDs的合成過程和PL光譜[23]。

3 適配體

Ellington和 Tuerk 在1990年分別獨(dú)立地創(chuàng)建了體外指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)[38-39](Systematic evolution of ligands by exponential enrichment process,SELEX)，并首次提出了適配體的概念。適配體是一種與靶標(biāo)有強(qiáng)親和力且可以特異性結(jié)合的核苷酸單鏈，通常有功能性DNA單鏈與功能性RNA單鏈兩種類型，它們可以通過堿基互補(bǔ)配對作用、氫鍵作用以及范德華力等作用力折疊成明確三維結(jié)構(gòu)，通過空間構(gòu)型互補(bǔ)與目標(biāo)分子進(jìn)行特異性結(jié)合[40]。適配體的出現(xiàn)極大地豐富了生物檢測的范圍與手段，在此之前生物傳感平臺的建立主要依靠抗體與酶，但它們對生物樣品的分析有很大的局限性，難以分析有毒小分子、非免疫原性目標(biāo)、結(jié)構(gòu)相近的大分子目標(biāo)等。相對于使用抗體和酶的生物傳感器，基于適配體的生物傳感器具有前所未有的優(yōu)勢[41]：首先，適配體結(jié)構(gòu)靈活、設(shè)計方便，理論上來講可以在體外對任何給定的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性選擇。其次，篩選出的適配體可以在體外通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等技術(shù)進(jìn)行快速增殖，且產(chǎn)品的重復(fù)性好、純度高。再者，相對于抗體與酶，適配體在復(fù)雜環(huán)境中的化學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定，對于溫度等條件的敏感度更低。最后，相比于抗體，適配體更易穿透組織，且由于其尺寸較小，不易引起免疫反應(yīng)，更加適合于臨床應(yīng)用。適配體的靶標(biāo)十分廣泛，包括金屬離子[42-44]、有機(jī)分子[43, 45-46]、蛋白質(zhì)[47-49]，甚至整個細(xì)胞或微生物[50-51]。

適配體對靶標(biāo)的特異性識別作用只是傳感過程中的目標(biāo)識別部分，如何將探針與靶標(biāo)結(jié)合前后的變化通過可測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)出來同樣是傳感過程的關(guān)鍵問題。近年來，納米材料與適配體偶聯(lián)構(gòu)建生物傳感器引起了研究者們極大的興趣。由于納米材料特有的光學(xué)、電學(xué)、磁性和催化特性，將適配體與納米材料偶聯(lián)之后，可以通過檢測傳感器與靶標(biāo)結(jié)合之后納米粒子的光、電、磁等特性變化來實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的可測傳感，常見的納米材料有金納米顆粒[52-53]、碳納米管[11]、量子點(diǎn)[54]、磁性納米顆粒[45,48]、碳點(diǎn)[47-49]等。本文將著眼于由碳點(diǎn)與適配體構(gòu)建的熒光生物傳感器，著重對其構(gòu)建方式、傳感機(jī)理以及具體應(yīng)用進(jìn)行介紹。

4 基于碳點(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器構(gòu)建

構(gòu)建熒光生物傳感器的熒光探針應(yīng)具有靈敏度高、選擇性好、操作方便、不易受電磁作用干擾、能夠?qū)Π袠?biāo)進(jìn)行原位實(shí)時無損分析的特點(diǎn)。碳點(diǎn)相對于有機(jī)熒光分子、半導(dǎo)體量子點(diǎn)及稀土熒光材料等傳統(tǒng)熒光材料，具有熒光性質(zhì)穩(wěn)定、斯托克斯位移大、生物相容性好、毒性低、表面易修飾等優(yōu)勢，是理想的熒光傳感器構(gòu)筑基元[5]。利用熒光碳點(diǎn)與適配體構(gòu)建生物傳感器已經(jīng)成為了熒光傳感領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。選用碳點(diǎn)作為熒光生物傳感器的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊、適配體作為目標(biāo)識別模塊時，如何將碳點(diǎn)與適配體進(jìn)行偶聯(lián)，以及以什么樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式傳遞靶標(biāo)結(jié)合信號成為了問題的關(guān)鍵。結(jié)合近年來的文獻(xiàn)來看，碳點(diǎn)與適配體的偶聯(lián)主要有兩種方式：標(biāo)記法與免標(biāo)記法，下面我們將分別對其進(jìn)行介紹。

4.1 標(biāo)記法

標(biāo)記法是將碳點(diǎn)與適配體之間通過共價鍵進(jìn)行連接，連接過后，碳點(diǎn)與適配體成為一個整體(CDs-Apt)，這種方法的好處在于傳感過程明晰，靶標(biāo)與適配體的作用將直接影響到碳點(diǎn)熒光信號的變化，且傳感器不易受外界復(fù)雜環(huán)境的影響。應(yīng)該注意的是，單一的由碳點(diǎn)與適配體共價鍵連接所構(gòu)成的熒光生物傳感器難以實(shí)現(xiàn)信號的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)，還需要其他物質(zhì)的配合。其中一種方式是利用金銀納米粒子[55-56]、氧化石墨烯[44,57-65]、金屬化合物片[66-68]、磁納米粒子[69]、碳點(diǎn)[70]等納米粒子對CDs-Apt熒光的猝滅作用實(shí)現(xiàn)對碳點(diǎn)熒光行為的控制。具體方式是將納米粒子與CDs-Apt于一個體系中混合，CDs-Apt中的寡核苷酸鏈會通過堿基配對作用力、靜電作用力或氫鍵作用力與以上物質(zhì)結(jié)合并與納米粒子通過一定作用方式使得碳點(diǎn)熒光發(fā)生猝滅。當(dāng)體系中存在靶標(biāo)分子時，靶標(biāo)與上述納米粒子會發(fā)生競爭反應(yīng)，由于適配體與靶標(biāo)的特異性結(jié)合作用和強(qiáng)親和力，CDs-Apt會與上述納米粒子脫離，進(jìn)而使得碳點(diǎn)熒光恢復(fù)，通過檢測結(jié)合前后體系的熒光變化來實(shí)現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)(on-off-on模式)。另一類方式是利用適配體將靶標(biāo)與碳點(diǎn)一同固定在某一納米粒子之上[71]，通過檢測結(jié)合前后納米粒子的熒光增強(qiáng)程度來實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)物質(zhì)的定量檢測。例如，Qaddare等以組氨酸為原料，采用一步水熱的方法制備了具有藍(lán)色熒光發(fā)射的碳點(diǎn)，利用金納米粒子(AuNPs)與碳點(diǎn)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，將AuNPs作為碳點(diǎn)熒光的猝滅劑，成功制造了一種用于檢測HIV相關(guān)DNA序列的超靈敏均質(zhì)生物傳感器[55]。作者將5’端氨基修飾的寡脫氧核苷酸通過共價鍵連接到碳點(diǎn)表面，在靶標(biāo)存在的情況下，該熒光探針會從AuNPs表面釋放出來，從而恢復(fù)碳點(diǎn)的熒光(圖2(a))。得益于氧化石墨烯(GO)良好的水溶性、優(yōu)異的熒光猝滅能力以及較強(qiáng)的吸附能力，GO經(jīng)常被用作熒光猝滅劑[58-59]。Chen等基于CDs、Aptamer與GO構(gòu)建了一種熒光傳感器并將其用于三磷酸腺苷(ATP)的檢測[62]。碳點(diǎn)經(jīng)適配體修飾后形成的CDs-Apt通過π-π堆積與疏水相互作用力吸附在GO表面，并通過CDs與GO之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)過程猝滅CDs-Apt熒光。在ATP的存在下，它將與適配體結(jié)合進(jìn)而將CDs-Apt從GO表面解離，抑制FRET過程，從而恢復(fù)了碳點(diǎn)的熒光。在最佳條件下，檢測限為80 pmol/L，ATP濃度在0.1～5 nmol/L范圍內(nèi)與碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度呈線性變化(圖2(b))。除了石墨烯納米片，金屬化合物的納米片也可以用作熒光猝滅劑，如圖2(c)所示，Saberi等利用CDs、Aptamer與氫氧化鈷(CoOOH)納米片之間的相互作用，設(shè)計了一種簡單的熒光雙功能感應(yīng)傳感器，可同時檢測溶菌酶(LYS)和三磷酸腺苷(ATP)[68]。通過CoOOH對碳點(diǎn)熒光的猝滅作用以及Aptamer對靶標(biāo)的特異性吸附，實(shí)現(xiàn)碳點(diǎn)熒光的“on-off-on”變化。在最佳條件下，ATP和LYS的檢出限分別為4.0 nmol/L和1.8 nmol/L。除了熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用導(dǎo)致的碳點(diǎn)熒光猝滅以外，由碳點(diǎn)聚集所導(dǎo)致的熒光猝滅行為也可用于熒光生物傳感器的構(gòu)建。Jiao等研究開發(fā)了一種基于核酸適配體介導(dǎo)的碳量子點(diǎn)(CQDs-Apt)納米聚合體的新型生物傳感器，用于啶蟲脒的檢測[70]。作者將啶蟲脒適配體及其互補(bǔ)DNA在5’端修飾后分別標(biāo)記在CQDs上。適配體與其互補(bǔ)DNA的雜交引發(fā)了CQDs納米聚集體的形成，導(dǎo)致CQDs的熒光猝滅。加入啶蟲脒后，適配體對啶蟲脒的特異性識別引起cDNA-CQDs的釋放，碳點(diǎn)熒光恢復(fù)，且熒光強(qiáng)度與啶蟲脒的濃度呈線性相關(guān)。傳感器對啶蟲脒的線性范圍為0.2～20 ng/L，檢測限為0.04 ng/L(圖2(d))。磁納米粒子也可以猝滅碳點(diǎn)熒光，Ma等建立了一種基于多碳點(diǎn)和核酸適配體的信號放大比率熒光探針用于檢測蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)[69]。作者分別選擇適配體修飾的黃色熒光發(fā)射碳點(diǎn)y-CDs和藍(lán)色熒光發(fā)射碳點(diǎn)b-CDs作為信號檢測單元和內(nèi)部標(biāo)記單元。在沒有PTK7的情況下，將y-CDs修飾的適配體和cDNA修飾的Fe3O4MNPs組裝在一起，y-CDs的熒光被Fe3O4MNPs猝滅，加入PTK7后熒光恢復(fù)。經(jīng)過信號放大后，該傳感器對PTK7的檢測限可低至0.016 ng/mL(圖2(e))。對于另外一類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，雖然也是檢測碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化，但少了熒光猝滅的過程。如圖2(f) 所示，Xu等將硅納米粒子與碳點(diǎn)通過適配體功能化，構(gòu)筑了凝血酶的熒光傳感平臺[71]。當(dāng)凝血酶不存在時，碳點(diǎn)與硅納米粒子之間不存在相互作用，通過離心作用可以將碳點(diǎn)除去；但當(dāng)凝血酶存在時，它可以通過與適配體的特異性相互作用，誘導(dǎo)適配體修飾的熒光CDs與適配體功能化的二氧化硅納米顆粒形成三明治結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對凝血酶的靈敏傳感。

圖2 標(biāo)記法構(gòu)建熒光生物傳感器。 (a)基于AuNPs和CDs-Apt的檢測系統(tǒng)構(gòu)建方法[55]；(b)基于CDs-Apt和GO之間的FRET作用檢測ATP示意圖[62];(c)熒光生物傳感器對ATP和LYS檢測示意圖[68]；(d)基于ACQ效應(yīng)的生物傳感器用于啶蟲脒檢測示意圖[70]；(e)比值熒光探針的制備工藝及用于PTK7檢測的原理[69]；(f)“三明治”結(jié)構(gòu)熒光傳感器檢測凝血酶原理示意圖[71]。

4.2 免標(biāo)記法

相較于標(biāo)記法，免標(biāo)記的方法更加方便，且成本更低[42,72-74]。與標(biāo)記法依靠共價鍵將碳點(diǎn)與適配體鏈接為一個整體的作用方式不同，免標(biāo)記法是通過分子間的作用力，如范德華力、氫鍵作用力、π-π堆疊等將碳點(diǎn)與適配體通過物理方式進(jìn)行偶聯(lián)(CDs/Apt)[75]。這種偶聯(lián)是可逆的，當(dāng)適配體的靶標(biāo)出現(xiàn)時，這種偶聯(lián)將會被打破，碳點(diǎn)熒光行為發(fā)生變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。采用物理偶聯(lián)的方式對適配體空間結(jié)構(gòu)的影響最小，幾乎可以忽略不計，這對適配體實(shí)現(xiàn)其特異性識別功能是非常有利的[40]。因此，采用免標(biāo)記的方法構(gòu)建的熒光生物傳感器具有簡單、快速、靈敏的特點(diǎn)。由于適配體表面是顯負(fù)電性的，采用免標(biāo)記法構(gòu)建熒光生物傳感器時，碳點(diǎn)的表面狀態(tài)需要特殊注意，在合成或后修飾過程中要在不影響熒光性質(zhì)的前提下將碳點(diǎn)表面的電荷狀態(tài)調(diào)成正電性，這將更加利于物理偶聯(lián)[42,74]。如圖3(a) 所示，Saberi等開發(fā)了一種基于核酸適配體的熒光法靈敏檢測農(nóng)藥啶蟲脒的方法。他們以西曲溴銨(CTAB)為原料，采用一步水熱的方法合成了具有藍(lán)色熒光的陽離子碳點(diǎn)(cCDs)[74]。在帶有負(fù)電荷的啶蟲脒適配體存在的情況下，適配體由于靜電吸引而結(jié)合在cCDs表面，cCDs熒光被部分猝滅。在體系中加入啶蟲脒后，適配體與靶標(biāo)結(jié)合，進(jìn)而使得cCDs熒光恢復(fù)，且熒光強(qiáng)度隨啶蟲脒的濃度線性增加。該方法的檢出限為0.3 nmol/L，動態(tài)范圍為1.6～120 nmol/L，與其他方法相比具有較高的靈敏度。通過后修飾的方式也可以實(shí)現(xiàn)對碳點(diǎn)表面狀態(tài)的改變，Kong等以檸檬酸、乙二胺為原料，通過一步水熱法合成表面帶有負(fù)電荷的碳點(diǎn)，將該CDs與帶正電的聚乙烯亞胺(PEI)進(jìn)行組裝，然后通過靜電相互作用與DNA適配體AS1411結(jié)合，形成CDs-PEI-AS1411納米復(fù)合物，并成功應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的靶向成像[73]。在這項(xiàng)工作中，由于PEI的組裝，細(xì)胞膜對該納米復(fù)合物的通透性更好，且碳點(diǎn)毒性較低，進(jìn)入細(xì)胞后不會引起細(xì)胞的行為變化(圖3(b))。

圖3 免標(biāo)記法構(gòu)建的熒光生物傳感器。 (a)檢測啶蟲脒的熒光生物傳感器示意圖[74]；(b)CDs-PEI-AS1411檢測癌癥的原理示意圖[73]。

5 基于碳點(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器傳感原理

基于碳點(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器的構(gòu)建方式已經(jīng)在上文進(jìn)行了詳細(xì)介紹，不難發(fā)現(xiàn)，無論是使用標(biāo)記法還是免標(biāo)記法構(gòu)建的熒光生物傳感器，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時大部分會涉及到熒光的猝滅與恢復(fù)過程。目前基于碳點(diǎn)與適配體構(gòu)建的熒光生物傳感器的傳感機(jī)理主要有以下四種：熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescent resonance energy transfer,FRET)、內(nèi)濾效應(yīng)(Internal filter effect,IFE)、光致電荷轉(zhuǎn)移(Photo-induced electron transfer,PET)和聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)(Aggregation-caused quenching,ACQ)。

5.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程是福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(F?rster resonance energy transfer)的一種形式，它指的是能量供體與受體之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移過程[76]。FRET過程的發(fā)生需要一定的條件：首先，供體與受體間要存在偶極-偶極的相對取向；其次，能量供體與受體之間要存在合適的距離，一般為2～8 nm；再者，供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜重疊度要高。只有滿足這三個條件，F(xiàn)RET過程才能有效進(jìn)行。在基于碳點(diǎn)與適配體構(gòu)建的熒光生物傳感器中，能量供體是熒光碳點(diǎn)，受體則有多種選擇，如金/銀納米粒子、氧化石墨烯、金屬化合物納米片、碳點(diǎn)、有機(jī)熒光分子[77]等。FRET過程中最常用的受體是氧化石墨烯，近期Zhou等利用適配體功能化的CQDs和氧化石墨烯(GO)設(shè)計了一種基于FRET效應(yīng)的熒光生物傳感器，用于靈敏且特異性地檢測貝類過敏原[61]。利用GO對適配體的強(qiáng)吸收作用以及對CQDs熒光的強(qiáng)猝滅作用，通過檢測加入GO與靶標(biāo)前后碳點(diǎn)的“on-off-on”熒光強(qiáng)度變化，實(shí)現(xiàn)了對貝類過敏原的定量檢測(圖4(a))。

5.2 內(nèi)濾效應(yīng)

內(nèi)濾效應(yīng)是指當(dāng)熒光體與其他吸光物質(zhì)共存時，由于吸光物質(zhì)對于激發(fā)光或發(fā)射光的吸收而導(dǎo)致熒光體熒光減弱的現(xiàn)象[78-80]。IFE過程也依賴于熒光團(tuán)和受體之間的光譜重疊，但與FRET過程不同的是，IFE過程來源于輻射能量傳遞，供體的能量擾動主要發(fā)生在基態(tài)。因此，在IFE過程中只觀察到熒光猝滅，熒光壽命沒有明顯變化。此外，IFE與FRET的另一個主要區(qū)別在于在IFE過程中能量的供體與受體之間沒有距離限制。由于金納米粒子(AuNPs)有著高消光系數(shù)和寬吸收峰，常被用作IFE過程的受體材料。Qin等以檸檬酸鈉為原料，采用一步水熱法制備了具有藍(lán)色熒光發(fā)射的碳點(diǎn)，基于金納米粒子(AuNPs)在不同聚集狀態(tài)下對碳點(diǎn)熒光猝滅程度不同的原理，通過適配體來調(diào)控AuNPs的聚集狀態(tài)，在碳點(diǎn)的配合下構(gòu)建了一種簡便、新穎的用于靈敏檢測啶蟲脒的免標(biāo)記熒光傳感平臺[81]。沒有靶標(biāo)存在時，適配體將聚集在AuNPs表面，使得AuNPs在溶液中保持隔離與穩(wěn)定，通過內(nèi)濾效應(yīng)，AuNPs將對CDs熒光有效猝滅。當(dāng)靶標(biāo)存在時，適配體將會在靶標(biāo)的競爭作用下從AuNPs表面脫離，進(jìn)而使得AuNPs產(chǎn)生聚集而減弱內(nèi)濾效應(yīng)，碳點(diǎn)熒光會逐步恢復(fù)(圖4(b))。

深靜脈血栓的預(yù)防分為藥物預(yù)防和非藥物預(yù)防。藥物預(yù)防，包括肝素、低分子肝素、華法令等藥物使用，根據(jù)不同患者選擇合適藥物應(yīng)用。研究顯示，依諾肝素應(yīng)用使腹部大手術(shù)圍手術(shù)期血栓發(fā)生率更低[18] ，他汀類藥物可以有效預(yù)防血栓發(fā)生[19] 。但藥物使用存在出血風(fēng)險，有出血風(fēng)險和出血傾向患者則不能使用，尤其是部分危重病患者使用抗凝藥物存在禁忌癥。非藥物預(yù)防，包括早期活動[20] 、增加被動運(yùn)動、壓力梯度長襪、氣壓泵應(yīng)用[21] 等，為避免出血風(fēng)險發(fā)生或存在藥物應(yīng)用禁忌癥，可選擇使用非藥物預(yù)防方法，聯(lián)合使用多種非藥物預(yù)防方法，亦可達(dá)到很好預(yù)防效果。

5.3 光致電荷轉(zhuǎn)移

光致電荷轉(zhuǎn)移是指在光的作用下，電子在供體與受體之間傳遞的現(xiàn)象[44,80,82-83]。在PET過程中基態(tài)和激發(fā)態(tài)分子都可以是電子供體，也都可以是電子受體。當(dāng)激發(fā)光照射到探針分子上，電子從供體轉(zhuǎn)移到激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)上，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)分子失活，光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能。有一點(diǎn)需要注意的是，PET過程的發(fā)生需要供體與受體之間存在鍵連作用，以提供電子近距離轉(zhuǎn)移通道。Miao等利用番茄汁為碳源，構(gòu)建了一種快速綠色合成藍(lán)色熒光發(fā)射碳點(diǎn)的策略，并且作者基于適配體在CDs表面通過競爭機(jī)制吸附和解吸的原理，提出了一種連續(xù)、可循環(huán)的無標(biāo)記敏感檢測癌胚抗原的方法[72]。作者對體系中CDs/Apt復(fù)合體進(jìn)行表面電荷及透射電鏡表征，確定了適配體對CDs的熒光猝滅機(jī)制來自于光致電荷轉(zhuǎn)移過程，而非聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)(圖4(c))。

圖4 熒光生物傳感器的傳感機(jī)理。 (a)基于FRET效應(yīng)檢測AK的熒光傳感方案示意圖[61]；(b)基于IFE效應(yīng)的啶蟲脒檢測原理示意圖[81]；(c)基于PET原理檢測CEA的示意圖[72]；(d)基于ACQ機(jī)制的凝血酶和ATP檢測原理示意圖[49]。

5.4 聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)

熒光體在稀溶液中具有較高熒光強(qiáng)度，但在濃溶液或者固態(tài)下熒光強(qiáng)度降低甚至消失的現(xiàn)象稱為聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)[7,70]。多數(shù)研究認(rèn)為ACQ現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于熒光分子在濃度升高后會由于分子間的碰撞與堆疊產(chǎn)生自猝滅，或者由于濃度升高后體系中猝滅劑與熒光團(tuán)的相互作用。π-π堆疊、氫鍵作用、疏水效應(yīng)和靜電作用都會對這個過程產(chǎn)生影響。利用碳點(diǎn)的ACQ效應(yīng)構(gòu)建熒光生物傳感器十分常見，例如Guo等以蘋果酸和聚乙烯亞胺為前驅(qū)體制備了具有明亮綠色熒光的聚乙烯亞胺碳量子點(diǎn)(PEI-CDs)，在生理pH值下，PEI-CDs表面呈正電性，在靜電作用力下與表面呈電負(fù)性的適配體結(jié)合而產(chǎn)生聚集，熒光被猝滅[49]。在體系中加入靶標(biāo)之后，適配體與靶標(biāo)的特異性緊密結(jié)合使得PEI-CDs被釋放，碳點(diǎn)熒光恢復(fù)。在優(yōu)化條件下，以該傳感機(jī)制構(gòu)建的熒光生物傳感器可以分別對凝血酶和ATP實(shí)現(xiàn)1.2 nmol/L和13 nmol/L的靈敏檢測(圖4(d))。

6 基于碳點(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器應(yīng)用

碳點(diǎn)優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)結(jié)合適配體出色的識別能力完美地構(gòu)建了納米傳感器的目標(biāo)識別模塊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊。時至今日，基于碳點(diǎn)與適配體構(gòu)建的熒光生物傳感器在金屬離子、有機(jī)分子、核酸、蛋白質(zhì)乃至細(xì)胞的靈敏傳感領(lǐng)域取得了豐碩成果，極大地豐富了人類在環(huán)境監(jiān)測、生物檢測以及疾病診療過程中的檢測手段。

6.1 檢測金屬離子

金屬離子在自然界中廣泛存在，無論是對環(huán)境監(jiān)測還是人體健康檢測而言，對它的靈敏傳感都顯得尤為重要。傳統(tǒng)的檢測方法為電感耦合等離子體質(zhì)譜法和原子吸收/發(fā)射光譜法，但這兩種檢測設(shè)備都需要昂貴的設(shè)備以及復(fù)雜的檢測程序，不能滿足常規(guī)監(jiān)測中速度快、成本低的需求[43-44]?；谔键c(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器可以利用適配體對金屬離子的特異性吸附作用，實(shí)現(xiàn)對金屬離子的nmol/L級檢測。Srinivasan開發(fā)了一種基于MoS2納米片、適配體和碳點(diǎn)通過納米組裝而成的熒光傳感器，用于檢測環(huán)境樣品中的Hg2+[66]。作者以蜂蜜為原料通過一步水熱法制備了具有藍(lán)色熒光發(fā)射的碳點(diǎn)，碳點(diǎn)通過共價鍵作用與適配體結(jié)合，構(gòu)成了一種高效的熒光探針(CDs-Apt)。得益于MoS2納米片優(yōu)異的熒光猝滅性能，CDs-Apt吸附在MoS2納米片上后會通過二者間的FRET過程產(chǎn)生熒光猝滅。而伴隨著Hg2+的加入，Hg2+會與適配體上的裸露堿基強(qiáng)烈作用，進(jìn)而導(dǎo)致CDs-Apt與MoS2納米片的脫附，抑制了FRET過程，碳點(diǎn)熒光得以逐步恢復(fù)。該熒光傳感器可實(shí)現(xiàn)0～10 nmol/L內(nèi)Hg2+的靈敏傳感。此外，該傳感系統(tǒng)的回收實(shí)驗(yàn)顯示了良好的汞離子回收率(圖5(a))。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在適配體對金屬離子的特異性識別過程中，適配體的寡核苷酸單鏈會通過盤曲折疊與金屬離子形成G-quartet復(fù)合結(jié)構(gòu)。例如，Qian等報道了一種基于適配體功能化石墨烯量子點(diǎn)(GQDs-Apt)和氧化石墨烯(GO)的熒光生物傳感器用于Pb2+靈敏傳感[44]。通過GQDs與GO之間的高效光致電荷轉(zhuǎn)移過程實(shí)現(xiàn)對GQDs熒光的猝滅，而伴隨著Pb2+的加入，Pb2+會誘導(dǎo)適配體形成G-quartet- Pb2+復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使得GQDs熒光恢復(fù)?；谠摲椒ㄖ苽涞膫鞲衅骺梢詫?shí)現(xiàn)對Pb2+檢測的1 min快速響應(yīng)，同時具備400 nmol/L的線性檢測跨度及0.6 nmol/L的超低檢測限(圖5(b))。類似的報道還有，Wang等以檸檬酸三鈉為碳源、尿素為氮源，采用微波法快速制備了具有450 nm熒光發(fā)射的氮摻雜碳點(diǎn)(CDUN)。作者利用適配體與CDUN之間的相互作用，通過免標(biāo)記法構(gòu)建了K+的傳感平臺[42]。在K+存在時，適配體與K+會形成G-quartet- K+復(fù)合體，進(jìn)而減弱對CDUN熒光發(fā)射的抑制作用，通過檢測結(jié)合前后體系熒光強(qiáng)度的變化，可以實(shí)現(xiàn)0.008～0.27 μmoL/L 濃度范圍內(nèi)K+的定量檢測(圖5(c))。

圖5 檢測金屬離子。(a)通過二硫化鉬納米片對CDs-Apt的熒光猝滅作用檢測二價汞離子[66]；(b)基于石墨烯量子點(diǎn)與氧化石墨烯之間的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程檢測二價鉛離子[44]；(c)痕量K+的檢測原理[42]。

6.2 檢測小分子化合物

6.2.1 有機(jī)小分子

小分子增塑劑是一種常見的化學(xué)添加劑，可以提高聚合物的可塑性，因此在化妝品及食品的包裝材料中廣泛應(yīng)用。但這些油溶性有機(jī)小分子很容易溶解在食物或化妝品內(nèi)并通過消化道或皮膚進(jìn)入人體，威脅人類身體健康，因此對小分子增塑劑的快速靈敏檢測顯得尤為重要。近期，Wang等以抗壞血酸為原料合成了雙熒光發(fā)射碳點(diǎn)材料，通過與氨基修飾的核酸適配體共價偶聯(lián)之后，在氧化石墨烯的存在下構(gòu)建了一種雙熒光發(fā)射比值傳感器用于特異性檢測鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)[59]。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，DBP的線性范圍為12.5～1 500 μg/L，檢出限為5.0 μg/L。該方法對食用油樣品中DBP含量的檢測結(jié)果與氣相色譜法測定結(jié)果無顯著差異，可用于食品中DBP的快速檢測(圖6(a))。

圖6 檢測有機(jī)小分子。 (a)以適配體標(biāo)記的雙發(fā)射碳量子點(diǎn)構(gòu)建熒光比值傳感器檢測鄰苯二甲酸二丁酯[59]；(b)熒光傳感器檢測MTA示意圖[67]；(c)基于方法1的rGQDs/適體制備及DX測定原理示意圖[82]；(d)基于方法2的rGQDs-Aptamer制備、aptamer-rGQDs /CNT組裝和測定DX示意圖[82]。

基于碳點(diǎn)與適配體構(gòu)建的熒光生物傳感器還可用于人體尿液、血液及唾液樣本中毒品甲基苯丙胺(MTA)含量的快速靈敏檢測。Saberi等以葡萄葉為原料合成了一種具有藍(lán)色熒光發(fā)射的碳點(diǎn)，通過化學(xué)偶聯(lián)作用將適配體連接在CDs表面，形成CDs-Apt復(fù)合體，利用CoOOH納米片對CDs-Apt的吸附作用、熒光猝滅作用(FRET)，以及MTA對CDs-Apt的特異性結(jié)合作用實(shí)現(xiàn)對MTA濃度的線性靈敏檢測[67]。在最優(yōu)條件下，檢測限為1 nmol/L，動態(tài)檢測范圍為5～156 nmol/L(圖6(b))。理論研究表明，CoOOH納米片與CDs之間的距離約為0.76 nm，證明了發(fā)生FRET現(xiàn)象的可能性，同時作者利用分子動力學(xué)模擬研究了MTA與適配體的相互作用。

6.2.2 生物小分子

腺苷(AD)在人生理活動中起著重要作用，它可以調(diào)節(jié)心臟心肌耗氧量和血流量，調(diào)節(jié)多巴胺等大腦神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，同時它還有助于調(diào)節(jié)平滑肌收縮、神經(jīng)傳遞、腎血流動力學(xué)和腎素的釋放。對AD的實(shí)時監(jiān)控可反映人體的生理健康狀態(tài)。Wang等以一水合檸檬酸與二乙烯三胺為原料通過一步水熱法制備了具有藍(lán)色熒光發(fā)射的碳點(diǎn)[60]。碳點(diǎn)經(jīng)腺苷適配體修飾后形成的CDs-Apt可被納米石墨吸附在表面并通過FRET過程猝滅CDs-Apt熒光，在AD存在時CDs-Apt熒光可逐步恢復(fù)。在優(yōu)化條件下，AD的檢測范圍為2～50 nmol/L，檢出限為0.63 nmol/L(圖7(a))。利用FRET機(jī)制檢測AD的相似報道還有You等利用藍(lán)色熒光發(fā)射碳點(diǎn)為響應(yīng)性熒光團(tuán)、紅色熒光發(fā)射的硅涂層CdTe量子點(diǎn)為內(nèi)參照制備了一種雙發(fā)射比率熒光傳感器用于人尿液中AD的檢測(圖7(b))[64]。除此以外，Zhu等采用核酸適配體標(biāo)記的碳點(diǎn)作為熒光探針和選擇性識別元件(CDs-Apt)，以Fe3O4@polypyrrole(Fe3O4@PPY)作為熒光猝滅和磁分離材料，構(gòu)建了一種以AD為模型目標(biāo)分析物的高靈敏熒光檢測方法[84]。通過對游離CDs和CDs-Apt-AD絡(luò)合物進(jìn)行兩次磁分離純化，檢測限可從8 nmol/L降至0.15 nmol/L(圖7(c))。

圖7 檢測生物分子。 (a)基于CDs-Apt和NG的AD傳感器示意圖[60]；(b)利用熒光傳感器對腺苷進(jìn)行檢測的機(jī)制[64]；(c)利用Apt-CDs和Fe3O4@PPY NPs對腺苷檢測示意圖：直接檢測(ⅰ)和磁分離純化后檢測(ⅱ) [84]；(d)基于CDs/Apt的熒光傳感器檢測ATP原理圖[63]；(e)基于CDs-Apt/NG的生物傳感器檢測DA策略示意圖[85]。

類似于腺苷的檢測，由碳點(diǎn)與適配體構(gòu)建的熒光生物傳感器還可用于ATP 與多巴胺的快速、靈敏及特異性檢測。與傳統(tǒng)的“turn-on”型熒光變化方式不同，Luo等基于FRET機(jī)制設(shè)計了一種可進(jìn)行信號放大的“turn-off”型ATP檢測器[63]。在構(gòu)建的過程中，CDs與適配體的互補(bǔ)單鏈(cDNA)相連形成CDs-cDNA，CDs-cDNA與適配體鏈部分互補(bǔ)后吸附在氧化石墨烯(GO)上，當(dāng)體系中存在ATP分子時，ATP與適配體的特異性結(jié)合后會在燃料鏈的作用下改變體系中堿基互補(bǔ)配對形式，進(jìn)而導(dǎo)致CDs-cDNA被吸附到GO表面，并發(fā)生FRET作用導(dǎo)致CDs-cDNA的熒光猝滅。該文作者利用靶循環(huán)鏈置換技術(shù)對信號進(jìn)行放大的策略可將檢測限降低至3.3 nmol/L(圖7(d))。多巴胺(DA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)中起著重要作用。Zhu等研制了一種基于DA適配體標(biāo)記碳點(diǎn)(CDs-Apt)和納米石墨(NG)的DA熒光生物傳感器[85]。在該系統(tǒng)中，CDs-Apt作為DA識別單元，無DA存在時將通過π-π堆積和疏水作用吸附在NG表面，DA的存在會與適配體形成球鏈狀結(jié)構(gòu)并使得CDs-Apt從NG表面脫離，從而恢復(fù)CDs-Apt的熒光強(qiáng)度。最佳條件下，CDs-Apt的熒光強(qiáng)度在0.10～5.00 nmol/L范圍內(nèi)隨DA濃度的增加呈線性增加，檢出限為0.055 nmol/L(圖7(e))。

6.2.3 細(xì)菌分泌物

黃曲霉素與赭曲霉素通常在發(fā)霉的谷物中高度富集，如果不經(jīng)去除，將會殘留在二次加工的農(nóng)產(chǎn)品之中。這兩類毒素的毒性極高，對人體的危害極大，高劑量暴露之下會誘導(dǎo)肝癌。Guo等以檸檬酸和乙二胺為原料，采用水熱法合成藍(lán)色熒光發(fā)射碳點(diǎn)，在該碳點(diǎn)表面修飾黃曲霉素B1適配體作為熒光探針(CDs-Apt)，并在腐殖酸(HAs)的配合下對黃曲霉素B1進(jìn)行靈敏檢測[86]。腐殖酸表面存在大量的醌基、芳香環(huán)和糖基，很容易吸附CDs-Apt并猝滅碳點(diǎn)熒光，但當(dāng)黃曲霉素B1存在時，探針會與其作用進(jìn)而脫離腐殖酸表面并恢復(fù)熒光。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，該檢測器可在0.1～0.8 ng/mL濃度范圍內(nèi)對黃曲霉素B1呈線性響應(yīng)，檢測下限為70 pg/mL(圖8(a))。類似的檢測手段還有，Wang等利用金納米粒子對碳點(diǎn)熒光的猝滅效應(yīng)，通過免標(biāo)記法構(gòu)建了黃曲霉素B1的靈敏熒光傳感平臺[87]。作者以胰液素為原料合成了表面帶有正電荷的新型熒光氮摻雜碳點(diǎn)(N,CDs)并通過靜電作用將其組裝在核酸適配體修飾的金納米粒子(Aptamer/AuNPs)上，N,CDs的熒光被有效猝滅。當(dāng)黃曲霉素B1添加到檢測溶液中，其適配體之間的特異性相互作用會導(dǎo)致N,CDs的釋放。通過測定碳點(diǎn)熒光的強(qiáng)度變化可以對黃曲霉素B1實(shí)現(xiàn)5 pg/mL～2.00 ng/mL的線性檢測(圖8(b))。利用金銀納米粒子對碳點(diǎn)熒光的高效猝滅機(jī)制還可用于赭曲霉素A的檢測，Wang等基于FRET傳感機(jī)理，利用高熒光強(qiáng)度的氮摻雜碳點(diǎn)作為能量供體、適配體修飾的銀納米粒子(AgNPs)作為能量受體搭建了熒光生物傳感器用于農(nóng)產(chǎn)品中OTA的快速檢測[56]。作者將核酸適配體與其互補(bǔ)DNA分別修飾在AgNPs和CDs上，通過雜交反應(yīng)來限制兩者間的空間距離，誘導(dǎo)FRET過程的發(fā)生，而OTA的加入會破壞體系的雜交反應(yīng)，使得CDs熒光恢復(fù)。該方法對OTA的濃度檢測范圍可達(dá)10～5 000 nmol/L(圖8(c))。

卡那霉素是一種常見的獸用抗生素，但卡那霉素的過度使用可能導(dǎo)致其殘留在動物性食品中，對人體健康造成威脅。Wu等采用免標(biāo)記法以金納米顆粒(AuNPs)作為吸收體，通過內(nèi)濾效應(yīng)猝滅碳點(diǎn)的熒光，構(gòu)建了一種新型卡那霉素?zé)晒鈧鞲衅鱗88]。該策略主要依賴于AuNPs的吸收光譜與熒光團(tuán)的熒光激發(fā)光譜重疊，以及適配體與卡那霉素的特異性結(jié)合能力。在沒有卡那霉素的情況下，適配體可以吸附在AuNPs表面并使其分散，從而有效地熄滅CDs的熒光。當(dāng)加入卡那霉素后，適配體脫離AuNPs表面，導(dǎo)致AuNPs在高鹽濃度下聚集。因此，AuNPs的吸收光譜發(fā)生變化，不再與CDs的熒光發(fā)射光譜重疊，從而使CDs的熒光恢復(fù)。在最佳檢測條件下，該傳感器對卡那霉素的檢測線性范圍為0.04～0.24 μmol/L，檢測限為18 nmol/L(圖8(d))。

圖8 檢測細(xì)菌分泌物。 (a) AFB1傳感器工作原理示意圖[86]；(b) AFB1檢測原理示意圖[87]；(c)基于熒光分析法檢測啤酒和面粉中的OTA示意圖[56]；(d)基于內(nèi)部過濾效應(yīng)檢測卡那霉素的熒光傳感器傳感示意圖[88]。

6.3 檢測蛋白質(zhì)

癌胚抗原(CEA)是人體組織和胎兒細(xì)胞中常見的一種作為抗原的細(xì)胞表面糖蛋白，它能參與細(xì)胞粘附，并在細(xì)胞識別和相互作用中起調(diào)節(jié)作用。通常情況下它在血液中的含量很少，而一旦體內(nèi)出現(xiàn)腫瘤，它就會在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)并分泌到體液中，因此確定CEA在體液中的含量對腫瘤的早期預(yù)警、篩查、診斷及預(yù)后分析具有重要意義[72]。Shao等將谷胱甘肽溶解在甲酰胺中，以溶劑熱的方法制備了具有近紅外熒光發(fā)射的碳點(diǎn)(NIR-CDs)，基于NIR-CDs與金納米棒(AuNRs)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，構(gòu)建了一種新型的高信噪比熒光傳感裝置，實(shí)現(xiàn)了對CEA的高靈敏度檢測[89]。作者通過相應(yīng)的羧基和氨基之間的共價鍵合反應(yīng)制備了AuNRs@SiO2-Aptamer和NIR-CDs-cDNA探針，cDNA與適配體雜交后會限制AuNRs和NIR-CDs之間的空間距離，進(jìn)而猝滅NIR-CDs熒光。而CEA與適配體的特異性結(jié)合會破壞DNA雜交鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致NIR-CDs-cDNA從AuNRs@SiO2表面分離，NIR-CDs的熒光恢復(fù)強(qiáng)度與CEA濃度在0.1～5 000 pg范圍內(nèi)呈線性相關(guān)(圖9(a))。不同于以上檢測機(jī)制，Miao等采用免標(biāo)記法構(gòu)建了一種更加簡便的CEA熒光傳感器。他們以番茄汁為碳源，合成了一種具有高量子產(chǎn)率、高光穩(wěn)定性且無毒的碳點(diǎn)[72]。該CDs表面豐富的羧基使得適配體通過π-π疊加作用吸附在CDs表面，并且適配體通過光致電荷轉(zhuǎn)移過程猝滅CDs熒光。當(dāng)體系中存在CEA時，CEA與適配體的競爭性結(jié)合使得CDs熒光恢復(fù)，基于該策略構(gòu)建的熒光傳感器可實(shí)現(xiàn)對1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)CEA濃度的定量檢測(圖9(b))。

Singh等以谷氨酸為原料采用熱解法一步合成具有藍(lán)色熒光發(fā)射的碳點(diǎn)，并通過化學(xué)反應(yīng)將惡性瘧原蟲谷氨酸脫氫酶(PfGDH)適配體偶聯(lián)到碳點(diǎn)表面[47]。利用適配體對碳點(diǎn)熒光的部分猝滅及蛋白誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了血清樣本中0.5～25 nmol/L范圍內(nèi)PfGDH的快速檢測(圖9(c))。Ghayyem等利用核酸適配體生物分子與碳點(diǎn)(CDs)表面的相互作用，采用免標(biāo)記法構(gòu)建了一種熒光生物傳感器用于細(xì)胞色素c(Cyt c)蛋白的快速靈敏檢測，檢出限為25.90 nmol/L，線性范圍為40～240 nmol/L[90]。Shi等利用碳點(diǎn)熒光作為指示信號構(gòu)建了β-乳球蛋白(β-LG)的快速檢測器[48]。作者將適配體固定在磁鐵礦(Fe3O4)納米顆粒(MNPs)上，適配體互補(bǔ)寡核苷酸(cDNA)固定在CDs表面形成CDs-cDNA，在β-LG存在下，CDs-cDNA將會被釋放到溶液中，經(jīng)過磁分離之后，通過測定上清液中的熒光強(qiáng)度可以實(shí)現(xiàn)0.25～50 ng濃度范圍內(nèi)β-LG的線性檢測(圖9(d))。

圖9 檢測蛋白質(zhì)。 (a)基于NIR-CDs的熒光傳感器檢測靶標(biāo)CEA[89]；(b)CDs合成示意圖及CEA檢測過程[72]；(c)基于蛋白熒光增強(qiáng)(PIFE)現(xiàn)象對血清中PfGDH的檢測示意圖[47]；(d)傳感器的制備示意圖(ⅰ)和β-LG檢測的原理(ⅱ)[48]

6.4 檢測細(xì)胞

基于碳點(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器對細(xì)胞的識別本質(zhì)大部分是基于適配體對細(xì)胞膜上的特定膜蛋白的特異性識別作用[51]。例如，Wang等構(gòu)建了一種基于碳點(diǎn)和核酸適配體組合的熒光探針，用于鼠傷寒沙門菌的靈敏定量檢測[50]。在傳感過程中，碳點(diǎn)與適配體的偶聯(lián)體(CDs-Apt)將會特異性地結(jié)合到細(xì)菌外膜蛋白上，進(jìn)而對細(xì)菌實(shí)現(xiàn)靈敏檢測(圖10(a))。Zhang等在其研究論文中對該過程進(jìn)行了更為清晰的描繪，他們以色氨酸與苯丙氨酸為原料，在鹽酸的催化下制備了藍(lán)色熒光碳點(diǎn)(ACDs)[91]。將該ACDs通過EDC/NHS反應(yīng)與DNA適配體連接形成ACDs-Apt，基于適配體對人乳腺癌細(xì)胞上MUC-1蛋白的特異性結(jié)合，該ACDs-Apt能夠?qū)崿F(xiàn)對人乳腺癌細(xì)胞的特異性粘附識別(圖10(b))。

圖10 檢測細(xì)胞。 (a)CD-Apt對細(xì)菌細(xì)胞的傳感過程[50]；(b)ACDs-Apt的結(jié)構(gòu)和對癌細(xì)胞的成像原理示意圖[91]。

7 總結(jié)與展望

碳點(diǎn)材料具有光學(xué)性質(zhì)突出、生物相容性好、毒性低、易修飾、制備簡便等優(yōu)良性質(zhì)，是一種非常出色的熒光納米材料。適配體在特異性識別靶標(biāo)分子方面有著優(yōu)異的性能，是優(yōu)異的目標(biāo)識別材料。本文對基于碳點(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器結(jié)構(gòu)組成(碳點(diǎn)、適配體)、構(gòu)建方式(標(biāo)記法、免標(biāo)記法)、傳感機(jī)理(FRET、IFE、PET、ACQ)和應(yīng)用范圍(金屬離子、小分子化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞)進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)。目前來看，該種類型的傳感器性質(zhì)很突出、應(yīng)用很廣泛，但仍存在著一些問題：(1)碳點(diǎn)的熒光發(fā)射機(jī)理不明確，這阻礙了對傳感機(jī)理的探究；(2)碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)不明晰，合成過程的不可控性使得碳點(diǎn)的表面狀態(tài)具有宏觀相似微觀不同的特點(diǎn)，這對探針的精細(xì)結(jié)構(gòu)設(shè)計影響較大；(3)碳點(diǎn)熒光需要向長波長方向設(shè)計以抵抗生物體的背景熒光干擾，這是臨床應(yīng)用的關(guān)鍵；(4)適配體與靶標(biāo)的特異性結(jié)合位點(diǎn)及作用方式需要進(jìn)一步研究。這些問題的解決將極大地提高基于碳點(diǎn)與適配體的熒光生物傳感器的靈敏性、特異性以及檢測范圍。

我們認(rèn)為，碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)的精確設(shè)計是解決上述問題的關(guān)鍵之一，通過調(diào)節(jié)前驅(qū)體的結(jié)構(gòu)與優(yōu)化反應(yīng)條件可以實(shí)現(xiàn)碳點(diǎn)大小與組成的精確控制，但目前仍缺少普適性的指導(dǎo)方法。另一個關(guān)鍵問題是如何通過控制合成前體與路徑實(shí)現(xiàn)碳點(diǎn)的熒光發(fā)射峰位向長波長移動以及優(yōu)化生物相容能力。CPDs是近年來提出的一類具有核殼結(jié)構(gòu)的碳點(diǎn)材料，其表面的聚合物鏈與基團(tuán)結(jié)構(gòu)賦予了CPDs易修飾的性質(zhì)，易于與生物體之間相容，并且CPDs可以調(diào)節(jié)熒光發(fā)射至近紅外區(qū)，這在臨床應(yīng)用中有很大的前景。總體來看，碳點(diǎn)與適配體結(jié)合用于熒光傳感器件有著廣闊的應(yīng)用前景，但精確的器件結(jié)構(gòu)設(shè)計以及適配體與靶標(biāo)的作用形式仍需要從理論計算和譜學(xué)表征方面進(jìn)行深入的研究。

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