聶煜東,耿媛媛,張賢明,蔣光明 (.重慶工商大學,廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心,重慶 400067；2.重慶理工大學化學化工學院,重慶 400054；3.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心,環(huán)境水質(zhì)學國家重點實驗室,北京 00085)

為應(yīng)對全球變暖等環(huán)境惡化問題并解決能源需求,開發(fā)可再生,環(huán)境友好型替代能源進而實現(xiàn)能源多元化成為人們的共識[1].當前,以生物柴油為代表的生物質(zhì)能源越來越受到人們的關(guān)注.基于不同的原料來源,生物柴油的發(fā)展可劃分為三代.以玉米,大豆等農(nóng)作物為原料轉(zhuǎn)化的生物柴油屬于第一代生物質(zhì)能源,但其不僅直接消耗糧食,同時會由于占用耕地而間接影響糧食產(chǎn)量[2-3].

以油棕,麻風樹等非糧食類油料植物制備的生物柴油屬于第二代生物質(zhì)能源,其對耕地無直接影響,且對環(huán)境的影響小,但轉(zhuǎn)化率低,經(jīng)濟可行性差制約了其發(fā)展[4].以微藻衍生的生物柴油屬于第三代生物質(zhì)能源,目前已應(yīng)用于航空燃料[5].與玉米,大豆,油棕等相比,微藻光合效率更高,因而在生物量,油脂和生物柴油產(chǎn)率方面更具潛在優(yōu)勢[6];微藻生物柴油相比普通柴油而言,氧,硫含量低,燃燒時產(chǎn)生的一氧化碳和硫化物較少,并且無芳香烴污染;此外,微藻作為生物柴油的原料,能夠有效減少用于糧食生產(chǎn)的耕地壓力[7-8].因此,微藻生物柴油被認為是極具潛力的環(huán)保型化石燃料替代能源.

然而,當前微藻產(chǎn)油成本仍然不能滿足微藻生物柴油的大規(guī)模商業(yè)推廣,其中微藻油脂產(chǎn)率是影響產(chǎn)油成本的關(guān)鍵因素之一,其主要取決于微藻種類及其培養(yǎng)環(huán)境[9-10].從藻種方面看,小球藻,柵藻,布朗葡萄藻,三角褐藻等被認為是最具產(chǎn)油潛力的能源微藻(表 1),然而常規(guī)培養(yǎng)下其油脂產(chǎn)率仍然不能滿足需求[11].構(gòu)建基因工程藻種提高其產(chǎn)油能力固然是一種選擇,但適合用于改造的藻種不多,相關(guān)基因表達調(diào)控機制未完全明確,且缺乏具體的生物學工具(如有效的核轉(zhuǎn)變,啟動子和選擇標記以及轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達等)[12];此外,基因工程藻種在使用過程中存在一定生態(tài)風險.因此,通過控制培養(yǎng)環(huán)境促進微藻油脂合成成為提高微藻油脂產(chǎn)率,降低微藻生物柴油成本的有效途徑之一[13].例如,提高或降低培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素含量,被證明有助于微藻油脂積累[14-15];提高或降低光強,升高或降低溫度,改變培養(yǎng)環(huán)境的pH值,提高鹽度等手段也常被用來誘導微藻油脂積累[16-18].這類改變培養(yǎng)條件的手段通常會對微藻生長造成脅迫,一定程度上刺激了胞內(nèi)油脂合成.這些脅迫主要可分為三類,包括以改變碳氮磷等營養(yǎng)元素為代表的營養(yǎng)脅迫,以改變溫度,光照,pH值等為代表的環(huán)境脅迫,以及以不同脅迫方式耦合而來的聯(lián)合脅迫.本文從影響產(chǎn)油微藻生長的主要因素出發(fā),對相關(guān)脅迫培養(yǎng)策略進行了綜述,并對微藻脅迫培養(yǎng)促進生物油脂合成的機理進行了概述;最后結(jié)合實際案例,對未來微藻脅迫產(chǎn)油的策略選擇進行了建議和展望.

表1 常見淡水和海水微藻的油脂含量[19-20]Table 1 The lipid content of the normal freshwater and seawater microalgae

續(xù)表1

1 主要脅迫培養(yǎng)手段

當前,大部分微藻的油脂產(chǎn)率仍不夠理想,為進一步提高微藻的產(chǎn)油能力,根據(jù)影響微藻生長和產(chǎn)油的因素,相應(yīng)的開發(fā)出了包括營養(yǎng)脅迫,環(huán)境脅迫及營養(yǎng)-環(huán)境聯(lián)合脅迫等微藻脅迫培養(yǎng)手段(表2).

表2 各種脅迫培養(yǎng)手段特點Table 2 Features of the diverse stress cultivaton methods

續(xù)表2

續(xù)表2

2 營養(yǎng)脅迫

微藻生長及其油脂組成與培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分密切相關(guān),培養(yǎng)基中碳,氮,磷等營養(yǎng)元素的脅迫作用,會直接影響藻細胞的代謝過程,從而讓更多的物質(zhì)和能量進入油脂代謝,促使微藻油脂快速積累.雖然營養(yǎng)脅迫對不同藻種的脅迫效果有所差異,但其總體來說仍被認為是促進微藻油脂積累最常用和有效的方法之一,且營養(yǎng)脅迫不僅會影響油脂的產(chǎn)量,還會調(diào)節(jié)極性脂質(zhì)和非極性脂質(zhì)的相對比例,因此其對油脂的量和質(zhì)有同步影響.

2.1 碳脅迫

碳是構(gòu)成微藻細胞的基本元素之一,在藻細胞的光合作用和呼吸代謝兩個過程中起至關(guān)重要的作用.碳源主要分為無機碳源(CO2,HCO3-,CO32-等)和有機碳源(葡萄糖,乙酸,甘油等)兩大類,其很大程度上影響著微藻脂肪酸的組成和代謝.CO2對微藻生長及油脂積累有十分重要的作用.郭琪等[69]利用 5% vol CO2,10% vol CO2培養(yǎng)兩株柵藻,結(jié)果表明 10% vol CO2濃度使柵藻FACHB-1545和柵藻FACHB-1600培養(yǎng)18d后最大生物量分別是空氣組的2.3倍和1.6倍,最大油脂產(chǎn)率是空氣組的1.48和1.26倍.部分微藻如小球藻,微擬球藻等可利用有機碳源進行異養(yǎng)或兼性培養(yǎng),如Patidar等通過外加5g/L葡萄糖,20g/L果糖,獲得最大油脂含量,分別為 39.06%,26.71%[70],但有機碳源的價格使得該方法推廣受到限制.近些年來,為解決有機碳源脅迫產(chǎn)油成本問題,以廢水中的有機物(糖類,淀粉,乙酸鹽)作為微藻碳源受到研究人員的廣泛關(guān)注.劉香華等[27]考察了 3種碳源(葡萄糖,NaHCO3,乙酸鈉)對小球藻生長和產(chǎn)油的脅迫影響,研究結(jié)果表明葡萄糖相對于其它兩種無機碳源更能促進微藻的生長和油脂積累.綜上,控制碳源含量和形態(tài)是碳脅迫微藻生長和產(chǎn)油的重要途徑.

碳脅迫條件下微藻油脂積累的主要機制如圖 1所示,在 15% vol CO2的脅迫下,丙酮酸脫氫酶(PDHC)和乙酰輔酶a羧化酶(ACC)相關(guān)的基因表達均增加,丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為丙酮酸進而由乙酰輔酶 a通向丙二酰輔酶 a的通路增強;中間代謝物丙酮酸鹽能更多地流向了丙二酰輔酶a和丙二酰載體蛋白,并與較短的碳鏈反應(yīng)生成較長的碳鏈,強化了脂肪酸的合成通路.此外,碳脅迫下催化第一步碳鏈加氫反應(yīng)的 3-酮脂酰基載體蛋白還原酶的基因上調(diào),增強了脂肪酸的氫化過程,使脂肪酸的不飽和度下降,其與碳鏈加長過程的增強共同促進整個脂肪酸的合成代謝,最終提高了藻細胞內(nèi)油脂含量,同時也改變了油脂的成分[22].

圖1 碳脅迫下藻細胞油脂積累的代謝途徑[22,71]Fig.1 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under carbon stress

綜上所述,在高碳脅迫條件下,藻細胞內(nèi)油脂代謝途徑會發(fā)生變化,進而誘導藻細胞積累更多油脂.基于提高微藻油脂產(chǎn)率的目的,可通過控制碳源形態(tài)和含量,并結(jié)合藻細胞光合活性和油脂代謝途徑的相關(guān)基因表達調(diào)控來進一步強化高碳脅迫對微藻生長和油脂積累的促進作用.

2.2 氮脅迫

氮是微藻合成葉綠素,生物大分子如蛋白質(zhì),核酸及含氮脂質(zhì)等物質(zhì)的基本元素,是微藻細胞生長最重要的營養(yǎng)元素之一.此外,對于諸多微藻物種,脂質(zhì)含量與氮源濃度之間存在線性關(guān)系.例如,蘇怡等[31]通過分別控制 NaNO3,NH4HCO3,(NH2)2CO 的濃度為 18,9,6,3mmol四個梯度對真眼點藻屬,魏氏藻屬,眼點擬微綠球藻進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)氮濃度與油脂含量具有顯著相關(guān)性.這是由于氮脅迫能夠影響藻細胞的其他代謝途徑,進而間接影響微藻脂質(zhì)代謝.相關(guān)研究表明真核微藻光合固碳量的 40%與氮素經(jīng)三羧酸循環(huán)共同合成蛋白質(zhì),然而在氮缺乏條件下,三羧酸循環(huán)代謝速率下降,從而促使本應(yīng)進入三羧酸循環(huán)的碳源轉(zhuǎn)而流向脂肪酸代謝[72-73].進一步的工作表明,微藻對不同氮源的利用能力存在差異,例如 NH4Cl為氮源的中肋骨條藻生長和產(chǎn)油情況優(yōu)于NaNO3和尿素[74].因此,缺氮或氮源形態(tài)的控制均能夠影響微藻的生長及油脂積累.

氮脅迫條件下微藻油脂積累的主要機制如圖 2所示.一方面,氮脅迫降低了蛋白質(zhì)對碳源的競爭,更多碳源進入了卡爾文循環(huán),為后續(xù)甘油三酯和脂肪酸積累奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[75];另一方面,細胞內(nèi)源性含氮化合物如蛋白質(zhì)或葉綠素降解,為油脂代謝提供了碳源和能量[76].在缺氮條件下,參與脂質(zhì)積累的相關(guān)代謝酶的表達會上調(diào),如與催化脂肪酸合成密切相關(guān)的乙酰輔酶a,以及甘油三酯合成相關(guān)的幾種酶,如甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT),甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶(DAGAT),磷脂酸磷酸酯酶(PAP),溶血性磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)等,這些酶活性的變化進一步促進了碳源向油脂的轉(zhuǎn)化[77].

圖2 氮脅迫下藻細胞油脂積累的代謝途徑[75-77]Fig.2 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under nitrogen stress

總體來說,在氮脅迫條件下,微藻油脂含量顯著增加,其主要原因是在氮脅迫條件下細胞內(nèi)碳源的重新分配,促使本該流向蛋白質(zhì)合成的碳源轉(zhuǎn)而流向油脂合成.因此,在使用氮脅迫的過程中,可通過調(diào)整氮的含量和形態(tài)來營造合適的缺氮環(huán)境,同時結(jié)合碳源的供給,將更多的碳源引導至油脂代謝.

2.3 磷脅迫

磷是影響微藻生長和產(chǎn)油的主要營養(yǎng)元素之一,是構(gòu)成磷脂,DNA,RNA,ATP等的必要元素,參與微藻的細胞分裂,物質(zhì)合成,能量傳遞及信號傳導等各種代謝活動[20].磷主要分為無機磷(PO43-,HPO42-等)和有機磷(ATP,2-磷-甘油酸等)兩類.研究表明,磷濃度及其形態(tài)對微藻脂質(zhì)含量有一定影響[78]. Mandal等[79]在磷濃度為0.06～0.1g/L的情況下培養(yǎng)柵藻,油脂含量從 29.5%下降至 10%,Arora[35]和 Chu等[36]通過對小球藻無磷限制培養(yǎng)也得到相似的結(jié)果.然而,Reitan等[39]將微擬球藻和扁球藻在磷濃度為 0.05～0.09mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)油脂含量均有所降低.因此,對于不同藻種,磷脅迫對其產(chǎn)油效果的影響各不相同,采用磷脅迫時,除需要優(yōu)化磷的形態(tài)和濃度外,還需針對性的選擇合適藻種.

磷脅迫條件下藻細胞油脂積累的機制如圖3所示,磷酸鹽通過淀粉分支酶(SBE)和淀粉酶(DIS)的活性進而影響淀粉和油脂合成途徑之間的碳流流向[80].淀粉合成與脂質(zhì)合成具有共同的碳前體(甘油-3-磷酸鹽),通過磷脅迫降低 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD),醛縮酶(ALD)等關(guān)鍵酶活性從而阻斷淀粉合成途徑,可以增加脂質(zhì)積累的代謝通量.同時,參與編譯DAGAT和丙酮酸激酶的基因會上調(diào),進而進一步促進了葡萄糖向油脂的轉(zhuǎn)化[81].

圖3 磷脅迫下藻細胞的油脂代謝途徑[71,80-81]Fig.3 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under phosphorus stress

綜上所述,缺磷脅迫對微藻油脂合成具有促進作用,但同時也存在藻種在磷缺乏時含油量下降的情況,因此不同藻種在磷脅迫下其產(chǎn)油特征具有一定差異性.在采用缺磷脅迫培養(yǎng)微藻時首先要選擇合適的藻種,同時要考慮到磷形態(tài)對微藻的影響.此外,由于磷脅迫培養(yǎng)下微藻油脂積累主要是通過抑制淀粉合成相關(guān)酶的活性,從而使更多的碳流向油脂代謝而來,因此缺磷脅迫中適當提高碳源供給,能夠進一步促進油脂的合成.

3 環(huán)境脅迫

環(huán)境因素在影響微藻生長的同時,也影響微藻的代謝過程,從而導致包括油脂在內(nèi)的細胞營養(yǎng)物質(zhì)的含量變化.

3.1 光脅迫

光照是微藻生長和代謝的能量來源,是影響其生長速率和油脂積累最主要的因素之一.其中,光照強度,光暗周期,光照波長是調(diào)控光照的三個主要方向.光照強度主要影響微藻的光合電子傳遞鏈,一定范圍內(nèi),隨著光強的增加,藻細胞的生物量也增加,當光照強度超過一定范圍時,則會抑制藻細胞的生長,甚至導致藻細胞死亡[17].光照強度對微藻細胞內(nèi)油脂含量的影響與微藻藻種有關(guān).如小球藻在 200μmol/(m2·s)脅迫下能獲得最大生物量,在 400μmol/(m2·s)脅迫下生物量受到抑制,油脂含量顯著增加[82],但微擬球藻在低光強 2000Lux脅迫下會誘導油脂積累,在高光強10000Lux脅迫下生物量增加了2.8倍[83].光暗周期同樣會對微藻生物量和油脂含量產(chǎn)生影響,Ahmad等通過對不同光照下柵藻進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)12:12(光:暗)下的生物量最大,24:0(光:暗)下生物量最低[41].然而,Wahidin等[84]分別將微擬球藻在12:12(光:暗),18:6(光:暗)和 24:0(光:暗)下培養(yǎng)時,在18:6(光:暗)下時可以獲得最大的生物量和油脂含量,因此光暗周期對微藻產(chǎn)油的脅迫影響也是因藻種而異.尹繼龍等[42]發(fā)現(xiàn)光照波長也會對微藻生長和產(chǎn)油有著顯著的影響,小球藻在藍光脅迫下油脂含量最高, Das等[85]也得到了相似的結(jié)果.總之,通過光照影響微藻生長及產(chǎn)油時,可同時通過光強,光暗比以及光質(zhì)進行調(diào)節(jié).

光照脅迫影響油脂合成的主要機理如圖4所示.在微藻的可耐受范圍內(nèi),高光強通過提升光合作用促進微藻生長,同時通過提高 GPAT,LPAAT,DAGAT等活性促進甘油三酯的合成,通過促進糖酵解,檸檬酸鹽循環(huán)等增加了乙酰輔酶 a的表達,進而在丙二酰輔酶 a等的催化下進行脂肪酸的大量合成[86].脂肪酸的生物合成需要三磷酸腺苷(ATP)和還原型氫(NADPH),糖酵解和磷酸戊糖這兩種途徑為脂肪酸的生物合成提供ATP和NADPH.Wang等[87]研究表明在高光照脅迫條件下,糖酵解和磷酸戊糖這兩種途徑的表達會上調(diào),因此促進了脂肪酸的合成.Wang等[87]同時研究了低光照脅迫對微藻產(chǎn)油的影響,低光照脅迫對脂肪酸的合成同樣具有一定促進作用,低光照脅迫下,糖酵解,卡爾文循環(huán),三羧酸循環(huán)等碳循環(huán)會產(chǎn)生更多的乙酰輔酶 a,同時對丙二酰輔酶 a等脂肪酸合成關(guān)鍵酶活性具有一定促進作用,因此有效地促進了脂肪酸的合成.

圖4 光脅迫下藻細胞的油脂代謝途徑[86,88]Fig.4 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under light stress

實際上,每種藻對光照的需求各異,光照強度,光照周期,光質(zhì)等脅迫對微藻生長和油脂積累的影響效果還與藻種有關(guān),因此在光脅迫時需要選擇與其相適應(yīng)的藻種.光脅迫對微藻油脂積累的影響主要通過調(diào)節(jié)其光合作用來實現(xiàn),這涉及到過程中的一系列物質(zhì)轉(zhuǎn)化及細胞器間的物質(zhì)轉(zhuǎn)移過程[86],進一步找到光脅迫過程中調(diào)控光合作用的關(guān)鍵點,對于開發(fā)相應(yīng)的光脅迫輔助措施從而促進油脂的合成至關(guān)重要.

3.2 溫度脅迫

溫度是影響微藻生長和油脂合成的重要因素之一.一般情況下,微藻的最佳生長溫度為20～30℃之間,在適宜溫度范圍之內(nèi),升高溫度可以促進微藻光合作用相關(guān)酶的活性及功能,從而加快微藻生長,溫度過高或過低時,微藻生長代謝率將急劇下降,從而導致微藻生物量的減少[88-89].微藻對溫度脅迫的應(yīng)激與細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性有很大相關(guān)性[90]. Richmond等[91]研究表明低溫脅迫下微藻為維持細胞膜的流動性以提高其對低溫的耐受性,會大量合成不飽和脂肪酸.類似地,韓飛等[47]研究表明四尾柵藻在 40℃高溫脅迫下,迅速將藻細胞內(nèi)的多糖轉(zhuǎn)化為油脂,以此抵抗不利環(huán)境,進而提高微藻自身的抗逆性.總之,溫度適宜時將有利于微藻的生物量增長,而溫度不利時將在一定程度上刺激油脂的合成.

溫度脅迫對微藻油脂積累的影響機理如圖5所示.其中,溶血磷脂酸的合成是胞內(nèi)油脂生物合成的關(guān)鍵步驟.在低溫脅迫下,催化甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酸的GPAT增加,同時催化甘油二酯向單半乳糖甘油二酯,雙半乳糖甘油二酯及磷酯酰甘油等轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶如半乳糖甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶(MS)和磷脂酰甘油磷酸脂酶(PGPA)活性增加,使得極性脂及油脂含量增加[92].在高溫脅迫下,甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)和 DAGAT的表達增加,G3PDH能將二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸,其中,二羥丙酮磷酸是最終轉(zhuǎn)化為TAG或極性脂的第一步;與此同時,高溫脅迫下甘油三酯脂肪酶(ATGL)表達下調(diào),使得TAG轉(zhuǎn)化為甘油二酯的量減少,因此TAG和總酯含量增加[93].

圖5 溫度脅迫下藻細胞油脂積累代謝途徑[92-93]Fig.5 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under temperature stress

總的來說,高溫和低溫脅迫均能夠促進微藻油脂的積累,高溫條件下偏向于合成 TAG,而低溫條件下更偏向于極性脂的合成.因此,在應(yīng)用溫度脅迫調(diào)控微藻油脂合成時,不但能夠控制微藻油脂的量,還能夠影響微藻油脂的質(zhì),這是溫度脅迫較其他脅迫獨有的特點.在實際工藝中合理利用溫度脅迫的這個特點,有助于生物柴油最終品質(zhì)的提升.

3.3 pH值脅迫

環(huán)境pH值同樣是影響微藻生長代謝的重要因素之一.Peng等[52]研究表明南極冰藻在 pH值為7.5～9.5的范圍內(nèi),pH值的增加會促進藻細胞的生長和油脂的積累.Gardne等[53]認為不同藻種具有不同的最適pH值.例如南極冰藻等在較高的pH值下可以積累更多的油脂[52],而柵藻在pH值超過6時,脂質(zhì)含量會隨 pH 值的增加而下降[94].因此,選擇與藻種相適宜的pH值范圍對于微藻油脂積累十分重要.

pH值脅迫對微藻生長及油脂積累的影響機理主要包括兩個方面.首先,pH值對環(huán)境中各元素的形態(tài)有著直接的影響.例如水樣中碳形態(tài)的分布受 pH值的直接影響,而碳的形態(tài)又進一步影響著微藻的生長和油脂積累[95];pH值還會對某些營養(yǎng)元素的形態(tài)具有調(diào)控作用,如磷酸鹽,鐵和銨等,這同樣影響微藻的生長和產(chǎn)油[96-97].其次,pH值對微藻細胞的增殖和分化有著重要影響.Bartley等[98]研究表明高pH值脅迫能夠誘導細胞從增殖階段轉(zhuǎn)換至生物質(zhì)生產(chǎn)階段.即在該脅迫條件下,藻細胞會將部分細胞增殖分裂的能量轉(zhuǎn)化到胞內(nèi) TAG合成代謝中.堿性 pH值脅迫下微藻的油脂積累主要是由于藻細胞分裂減緩,因此微藻在該pH值條件下通過犧牲細胞密度及膜脂含量,促進了胞內(nèi)TAG的積累[99].

總而言之,在利用 pH 值脅迫微藻產(chǎn)油時,首先要根據(jù)藻種來選擇合適的脅迫 pH值;其次要將 pH值與碳氮磷等元素的形態(tài)變化聯(lián)系起來,從而更好地促進微藻生物量和油脂產(chǎn)率;最后要注意pH值對微藻的生理影響,在實際調(diào)控pH值時注意將其維持在一個合理范圍內(nèi).

3.4 鹽度脅迫

鹽度是影響微藻生長和代謝產(chǎn)物積累的重要因素之一.有研究表明鹽脅迫使螺旋藻細胞對強光的敏感性增強,會導致其光合放氧能力顯著下降[100].類似地,魚腥藻的凈光合放氧速率和呼吸速率隨NaCl濃度的升高而降低,使得魚腥藻的生長被抑制[101].另一方面,有研究表明高鹽度雖會抑制生物量,但卻能促進藻細胞大量積累油脂.Miyasaka等[102]的研究表明萊茵衣藻HS-5在高鹽濃度下會積累大量的油脂,同樣Ben-Amotz等[103]的研究表明鹽脅迫下的杜氏鹽藻細胞會大量合成甘油,且胞內(nèi)甘油含量與外部鹽濃度成正相關(guān).

鹽脅迫對微藻產(chǎn)油的影響機理如圖 6所示,其被認為是微藻細胞內(nèi)碳流由淀粉向脂類轉(zhuǎn)變的重要調(diào)節(jié)因素之一.微藻在鹽脅迫條件下會產(chǎn)生一些代謝物質(zhì)以保護自身不受鹽分傷害,同時維持自身與外界的滲透壓平衡,因此在鹽脅迫條件下,油脂含量增加,淀粉的含量則降低[104].有研究發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下與油脂合成相關(guān)的關(guān)鍵物質(zhì)乙酰輔酶a上調(diào),而與淀粉合成相關(guān)的關(guān)鍵酶焦磷酸化酶表達下調(diào),與此同時,鹽脅迫下 DIS的活性上升,使得胞內(nèi)淀粉更快的分解為葡萄糖,進而轉(zhuǎn)化為果糖 1,6-二磷酸和二羥基丙酮磷酸,在G3PDH和DAGAT的作用下,依次轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸和溶血磷脂酸;甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油后成為TAG的前體物,而溶血磷脂酸經(jīng)過Kennedy代謝后同樣轉(zhuǎn)化為TAG[105-107].由于鹽脅迫下G3PDH和DAGAT的活性也會上升,因此油脂得到進一步積累.

圖6 鹽脅迫下油脂積累代謝途徑[104-107]Fig.6 Metabolic pathway of lipid accumulation of microalgae under salt stress

鹽脅迫的成本較低且操作簡便,但在使用時需注意將鹽濃度控制在合理范圍內(nèi).低濃度鹽脅迫下生物量較高,但油脂積累不明顯;高濃度鹽脅迫下微藻胞內(nèi)的油脂合成將得到大幅提升,但生物量會受到一定抑制;而鹽濃度一旦超過了微藻的耐受性,將可能導致微藻的生物量大幅下降甚至死亡.此外,由于不同微藻對鹽的耐受性不同,因此在實際操作時需根據(jù)藻種相應(yīng)的選擇其鹽濃度范圍.

4 其他脅迫

除碳,氮,磷等營養(yǎng)脅迫以及光,溫度,pH 值,鹽度等環(huán)境脅迫外,近年來,各種天然或人工合成的外源分子脅迫也引起了廣泛關(guān)注,例如阻斷劑,固定劑等.

阻斷劑主要指的是能夠抑制微藻胞內(nèi)代謝過程的物質(zhì),通過抑制部分代謝能夠讓更多的碳源及能量流向油脂代謝,從而獲得更高的油脂產(chǎn)率.研究表明,丁苯嗎啉,布雷菲德菌素 A,疊氮化物等均屬于這類物質(zhì),其能夠影響微藻細胞內(nèi)基本功能代謝,進而誘導甘油三酯大量積累.例如,Kim 等[60-61]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中分別添加丁苯嗎啉和布雷菲德菌素A,經(jīng)過丁苯嗎啉處理1h后的萊茵衣藻細胞TAG含量至少是未添加組的 4倍,添加了布雷菲德菌素 A的培養(yǎng)基中 TAG含量是未添加對照組的 1.3倍.Zalogin等[62]研究表明20μmol/L的疊氮化鈉會抑制藻細胞硝酸鹽還原酶的產(chǎn)生,影響微藻對氮的利用,形成胞內(nèi)的缺氮環(huán)境,從而增加藻細胞油脂的合成.阻斷劑的最大特點是見效較快,且由于投加量較小,因此成本較低;但在實際使用過程中要注意其毒性的影響,避免二次污染.

固定劑是一類能夠與二氧化碳等微藻營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合,并加快營養(yǎng)物質(zhì)被微藻利用的小分子物質(zhì).如氫氧化鈉,一乙醇胺(MEA),二乙醇胺(DEA)等均可強化微藻固碳進而促進微藻生長和油脂積累.Rosa等[63]在培養(yǎng)基中周期性的添加 50mg/LMEA,油脂含量和蛋白質(zhì)含量分別增加了30.8%和44%.Sun等[64]探索MEA對微藻生長及代謝的影響時,發(fā)現(xiàn)當MEA濃度從0增加至100mg/L時,生物質(zhì)較常規(guī)培養(yǎng)提高了 16.7%,但當 MEA濃度增加至150mg/L時,微藻生長和胞內(nèi)代謝活動均受到抑制.醇胺類固定劑在實際使用時濃度不能過高,否則會生成具有毒性的中間體氨基甲酸鹽,對微藻生長產(chǎn)生抑制作用;同時過高濃度的醇胺對設(shè)備具有嚴重腐蝕作用.此外,固定劑在實際使用中也具一定的局限性,如該類物質(zhì)具有明顯的時效性,固碳效果隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸下降,因此在實際使用中需要注意及時補充固定劑.

除上述兩類外源分子外,隨著研究人員對該領(lǐng)域研究的深入,更多的脅迫物質(zhì),手段及思路被發(fā)現(xiàn)或提出.例如 Taoka等[65]在培養(yǎng)基中添加表明活性劑如吐溫 80,通過影響細胞膜通透性使更多的營養(yǎng)物質(zhì)進入胞內(nèi),結(jié)果表明 1%的吐溫 80使生物量提高了1.89倍,多不飽和脂肪酸含量增加了37%.李大菲等[66]在脅迫條件下添加抗氧化劑褪黑素用以消除脅迫過程中產(chǎn)生的氧化損傷,結(jié)果顯示在 1,10和100 μmol/L的褪黑素投加量下,藻細胞中性油脂含量分別比對照組提高1.32,1.24,1.16倍.總而言之,上述諸多手段為微藻脅迫產(chǎn)油提供了除營養(yǎng)脅迫和環(huán)境脅迫外的更多選擇.

5 聯(lián)合脅迫

以上各類脅迫在特定環(huán)境條件下應(yīng)用于誘導微藻脂質(zhì)合成時,均取得了較好效果.目前,在當前國內(nèi)外不多的微藻生物柴油應(yīng)用案例中,也大多采取突出單一脅迫效果的策略,例如荷蘭 Algae Link公司通過新型光生物反應(yīng)系統(tǒng)控制微藻生長的光學條件,以此促進產(chǎn)油微藻的生長及產(chǎn)油代謝;以色列錫姆公司利用廢棄中的高濃二氧化碳促進微藻的生長和產(chǎn)油;我國的新奧科技在內(nèi)蒙采用煤化工高純二氧化碳尾氣培養(yǎng)微藻,降低了能源微藻培養(yǎng)成本并促進了微藻油脂積累[108].然而,上述單一脅迫手段雖對微藻油脂含量或油脂產(chǎn)率具有明顯效果,但油脂產(chǎn)率仍然不能滿足擴大化生產(chǎn)的要求,項目離實現(xiàn)盈利尚有差距.多項研究表明,多種脅迫策略相結(jié)合將比單一脅迫更有利于微藻脂質(zhì)的生成[109].

Pal等[110]對微擬球藻進行培養(yǎng)時,發(fā)現(xiàn)在氮源充足的培養(yǎng)環(huán)境下,添加40g/L氯化鈉同時增強光照至700 μmolm-2.s-1,甘油三酯含量較單一脅迫增加了25%.Kwak等[67]通過3株不同的萊茵衣藻,分別研究氮饑餓與高溫度脅迫,氮饑餓和鹽脅迫,高溫和鹽脅迫,高 pH值和鹽脅迫相結(jié)合的策略,研究結(jié)果表明不同策略之間的脅迫效果存在一定差異,但兩種不同條件的聯(lián)合脅迫均比單一脅迫更加明顯地促進油脂的積累.因此,根據(jù)實際環(huán)境情況靈活選用脅迫方式,并采取多脅迫聯(lián)合的策略,可以達到最大限度提高微藻油脂產(chǎn)量的目的,從而降低微藻產(chǎn)油成本.

6 結(jié)論與建議

6.1 結(jié)論

綜上,各類脅迫培養(yǎng)均能不同程度地提升藻細胞油脂產(chǎn)率,但使用特點,方式及作用機理等各有差異.采用包括碳,氮,磷在內(nèi)的營養(yǎng)脅迫時,可通過調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的形態(tài)和含量來控制效果,通過營養(yǎng)的脅迫讓更多碳素流向油脂代謝,從而提高油脂的產(chǎn)率.采用光脅迫時,可通過調(diào)節(jié)光強,光照周期,光質(zhì)等影響其光合作用,進一步影響一系列物質(zhì)轉(zhuǎn)化及細胞器間的物質(zhì)轉(zhuǎn)移,最終達到促進油脂合成的目的.采用溫度脅迫時,根據(jù)高低溫對油脂成分的不同影響,可調(diào)控微蘊生物柴油的品質(zhì).而在采用 pH值脅迫培養(yǎng)微藻時,需要與營養(yǎng)鹽形態(tài)結(jié)合起來考慮,且要注意 pH值需維持在合理的范圍內(nèi).鹽脅迫與pH值脅迫類似,需要根據(jù)藻種來選擇合理的鹽度范圍.

總而言之,無論是傳統(tǒng)的營養(yǎng)脅迫和環(huán)境脅迫,還是各種新型的各類脅迫手段,歸根結(jié)底是圍繞著物質(zhì)和代謝兩方面來進行.因此,如何加大碳素供應(yīng),如何讓更多碳素流向油脂合成代謝,是微藻產(chǎn)油脅迫中的最關(guān)鍵問題.

6.2 建議

針對未來微藻產(chǎn)油的相關(guān)研究以及實際應(yīng)用中的脅迫策略選擇,本文建議一是開發(fā)和采用更高效率的新型脅迫培養(yǎng)手段;二是針對性的建立和采用多脅迫聯(lián)合的策略.通過這兩個方向的努力,進一步提升微藻的產(chǎn)油效率,從而降低微藻生物柴油成本,最終實現(xiàn)微藻生物柴油的產(chǎn)業(yè)化.