戴銀 胡曉苗 趙瑞宏 張丹俊 潘孝成 沈?qū)W懷 尹磊 周學(xué)利 侯宏艷

摘要 [目的]為快速地鑒別鵝細小病毒（GPV）、番鴨細小病毒（MDPV）和禽腺病毒血清4型（FAdV-4）3種病毒，建立一種特異強、敏感高、重復(fù)性好的三重PCR檢測方法。[方法]根據(jù)Genbank登錄的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列，設(shè)計3對特異性引物，以提取的核酸為模板，進行PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗。[結(jié)果]采用所建立的方法能夠擴增出GPV、MDPV和 FAdV-4 特異性片段，且不能檢出鴨黃病毒（DFV）、鴨 I 型肝炎病毒（DVH-Ⅰ）和禽呼腸孤病毒（ARV）;GPV、MDPV 和 FAdV-4 核酸模板的最低檢測量分別為20、2、2 pg;對8份陽性臨床病料進行檢測，可見MDPV、GPV和FAdV-4的檢出率均為100%。[結(jié)論]建立的三重PCR檢測方法能夠?qū)DPV、GPV和FAdV-4這3種病毒進行快速、準確的診斷。

關(guān)鍵詞 鵝細小病毒（GPV）;番鴨細小病毒（MDPV）;禽腺病毒4型（FAdV-4）;三重PCR檢測

中圖分類號 S 855 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2021）15-0183-02

Abstract [Objective]In order to quickly identify three kinds of goose parvovirus （GPV）， muscovy duck parvovlrus （MDPV） and fowl adenovirus serotype 4 （FAdV4）， to establish a triple virus with strong specificity， high sensitivity and good repeatability PCR detection method.[Method]According to the gene sequences of MDPV， GPV and FAdV4 registered in Genbank， 3 pairs of specific primers were designed and the extracted nucleic acid was used as a template to perform PCR specificity， sensitivity and repeatability tests.[Result]The established method could amplify specific fragments of GPV， MDPV and FAdV4， and cannot detect duck flavivirus （DFV）， duck viral hepatitis typeⅠ（DVHⅠ） and avian reovirus （ARV）.The minimum detection levels of GPV， MDPV and FAdV4 nucleic acid templates were 20， 2 and 2 pg， respectively.The detection of 8 positive clinical materials showed that the detection rates of MDPV， GPV and FAdV4 were all 100%.[Conclusion] The established triple PCR detection method can quickly and accurately diagnose the three viruses MDPV， GPV and FAdV4.

Key words Goose parvovirus （GPV）;Muscovy duck parvovlrus （MDPV）;Fowl adenovirus serotype 4 （FAdV4）;Triplex PCR detection

基金項目 安徽省科技重大專項（202003a06020012）;安徽省畜禽疫病研究中心項目（2020YL094）;安徽省家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（AHCYJSTX-06）。

作者簡介 戴銀（1980—），女，安徽蒙城人，副研究員，博士，從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。*通信作者，研究員，從事畜禽傳染病學(xué)研究。

收稿日期 2020-10-10;修回日期 2021-01-28

番鴨細小病毒（muscovy duck parvovlrus，MDPV）和鵝細小病毒（goose parvovirus，GPV）都是細小病毒科、細小病毒亞科、依賴病毒屬成員[1]。MDPV可引起雛番鴨的細小病毒病，又稱番鴨3周病，該病具有高度的傳染性，主要導(dǎo)致雛番鴨消化道、腸道等部位的病變，發(fā)病率和死亡率較高[2-3]。GPV又稱小鵝瘟，是一種急性或亞急性敗血性傳染病，傳播速度快[4];該病以腸道的病變?yōu)橹饕卣?，主要侵?0日齡以下雛鵝，也可感染雛番鴨，發(fā)病率、死亡率可高達100%[5]。禽腺病毒（fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，是雞、鴨、鵝等禽類體內(nèi)常見的傳染性病源[6]。血清4 型I 群禽腺病毒（fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）可引起以心包積液，以及包涵體肝炎為特征的心包積水-肝炎綜合征（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS），病禽主要表現(xiàn)在精神沉郁、扭頭等神經(jīng)癥狀，死亡率可達20%～30%[7]。

GPV和MDPV基因組具有高度的同源性，抗原性也高度相似，用常規(guī)的血清學(xué)檢測方法很難區(qū)分。FAdV也可分為5個種、12個血清型，其中以血清4型為主[8]。相對酶聯(lián)免疫吸附試驗、瓊脂擴散試驗、免疫熒光技術(shù)等方法，PCR方法則可同時對多個病毒進行準確、快速的鑒別診斷。三重 PCR 實現(xiàn)了一管三檢的目的，具有成本低、效率高、速度快等優(yōu)點。目前，應(yīng)用三重PCR 技術(shù)同時對GPV、MDPV和FAdV-4的3種病毒進行檢測和診斷的研究鮮見報道，該研究設(shè)計了3對特異性引物，建立了GPV、MDPV和FAdV-4的三重 PCR 快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

DL2000 DNA Marker、Taq酶等購自寶生物工程（大連）有限公司;RNA/DNA 快速提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖（電泳純）等購自生工生物工程科技（上海）股份有限公司。

1.2 病毒株

GPV、MDPV和FAdV-4，以及對照毒株鴨黃病毒（duck flavivirus，DFV）、鴨 I 型肝炎病毒（duck viral hepatitis type Ⅰ，DVH-Ⅰ）和禽呼腸孤病毒（avian reovirus，ARV）由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實驗室分離、鑒定并保存。

1.3 三重PCR方法的建立

1.3.1 引物的設(shè)計與合成。根據(jù)GPV、MDPV和 FAdV-4的基因保守序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3對特異性擴增引物（表1），由生工生物工程科技（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)病毒 DNA/RNA 快速提取試劑盒說明書，提取GPV、MDPV、 FAdV-4、DFV、DVH-Ⅰ和ARV的 DNA/RNA。核酸蛋白測定儀測定核酸的濃度和純度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩NA 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

1.3.3 PCR反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μL，上、下游引物各1.0 μL， Taq ?DNA 聚合酶Mixture 14 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 特異性檢測

把含有GPV、MDPV和 FAdV-4核酸模板的樣品，以及含有其他對照病原體（DFV、DVH-Ⅰ和ARV）的核酸樣品，分別加至GPV、MDPV和 FAdV-4的三重PCR反應(yīng)體系中進行擴增，以檢測其特異性。

1.5 敏感性檢測

測定GPV、MDPV和 FAdV-4的核酸模板濃度后，將其作10倍遞進稀釋至10-7。分別對上述模板進行三重PCR擴增，以檢測其敏感性。

1.6 重復(fù)性檢測

利用建立的三重PCR方法，在相同條件下，對收集的8份已鑒定的禽病料進行基因組提取和PCR擴增檢測，以驗證該PCR方法的重復(fù)性。

1.7 PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測序

取5 μL PCR產(chǎn)物于上樣孔中，同時點DNA Marker作為參照，以90～120 V的電壓于1×TAE電泳緩沖液中電泳，在紫外凝膠成像儀上觀察結(jié)果，分析并記錄。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 三重PCR的特異性

采用該方法對GPV、MDPV和 FAdV-4及對照病原體DFV、DVH-Ⅰ和ARV的核酸樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），GPV、MDPV和 FAdV-4的混合核酸模板及單獨模板均能擴增出與試驗設(shè)計大小相符的628、432、979 bp的條帶，而對照病原體在相同位置卻無特異性擴增條帶。

2.2 三重PCR的敏感性

經(jīng)敏感性試驗測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），GPV、MDPV和 FAdV-4三重PCR 最低能同時檢測到2 pg的MDPV和 FAdV-4核酸模板以及20 pg GPV核酸模板。

2.3 三重PCR的重復(fù)性

利用建立的三重PCR方法，對已鑒定的病料進行檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖3），8份混合核酸模板的PCR擴增結(jié)果均出現(xiàn)了3條清晰明亮的目的條帶。結(jié)果表明，建立的GPV、MDPV和FAdV-4三重PCR檢測方法具有良好的重復(fù)性。

3 討論與結(jié)論

番鴨細小病毒（MDPV）只感染番鴨，鵝細小病毒（GPV）則既可感染鵝，又可感染番鴨，新型鵝細小病毒還可導(dǎo)致鴨的短喙和侏儒綜合征[9-10];研究發(fā)現(xiàn)MDPV和GPV在自然環(huán)境中可發(fā)生基因重組，形成重組型的水禽細小病毒株[11-13]，產(chǎn)生新的危害。禽腺病毒血清4型（FAdV-4）不僅在雞群中造成危害，也可感染鵝和鴨[14-15]，但目前還未引起廣泛的重視。這3種病毒病近年來不斷有發(fā)生的報道，已成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原，建立準確、快速的檢測方法尤為重要。相對常規(guī)血清學(xué)方法，PCR方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強和重復(fù)性好等優(yōu)點，多重PCR則可一次同時檢測多種病毒，更為簡便、快速。

由于多重PCR反應(yīng)體系中存在2種以上的引物和模板，反應(yīng)過程中相互之間可能會存在一定的干擾，因此要求各引物要有較強的特異性，且反應(yīng)條件盡可能地接近一致。該研究根據(jù)GPV、MDPV和FAdV-4各自的基因組序列設(shè)計多對特異性引物，通過多次反應(yīng)條件的優(yōu)化，篩選了退火溫度一致的3對引物，進行一次PCR擴增，即可鑒別GPV、MDPV和FAdV-4這3種病毒。采用該三重PCR 方法，GPV、MDPV和 FAdV-4核酸模板的最低檢出量分別為20、2和2 pg;對8份臨床病料進行檢測，發(fā)現(xiàn)MDPV、GPV和FAdV-4的檢出率均為100%。這說明該三重 PCR檢測方法具有較好的特異性、敏感性和可重復(fù)性，可為鴨細小病毒、鵝細小病毒和禽腺病毒鑒別診斷提供準確的結(jié)果，對3種疫病的預(yù)防控制具有重要意義。

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