田德福，吳宏，楊洲明

1陜西省第四人民醫(yī)院普外科，西安 710043

2陜西省西電集團(tuán)醫(yī)院普外科，西安 710074

膽囊癌指膽囊組織出現(xiàn)的惡性病變，且多發(fā)生于膽囊底部、體部、頸部及膽囊管。膽囊癌作為臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居消化系統(tǒng)惡性腫瘤的第5 位，但膽囊癌的臨床癥狀缺乏特異性，早期診斷較為困難，一經(jīng)確診惡性程度就已經(jīng)較高，增加了膽囊癌患者的臨床治療難度，降低了患者的生存率，增加了患者及家屬的精神及經(jīng)濟(jì)壓力。腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲可影響患者的預(yù)后及治療效果，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤新生血管生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族成員MMP2 可降解細(xì)胞外基質(zhì)，增強(qiáng)了細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中突破細(xì)胞外基質(zhì)的能力。本研究探討MMP2、VEGF 在膽囊癌患者中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2017 年12 月陜西省第四人民醫(yī)院和陜西省西電集團(tuán)醫(yī)院收治的膽囊癌和膽囊息肉患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)病理活檢確診為膽囊癌或膽囊息肉；②均為首次確診，入院后均接受根治性手術(shù)治療；③術(shù)前無(wú)相關(guān)抗腫瘤藥物使用史；④未接受腫瘤相關(guān)放療、化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并一定程度的肝臟系統(tǒng)疾?。ǜ窝住⒏斡不龋?；②合并呼吸、循環(huán)等系統(tǒng)病變，存在一定程度的腦血管疾??；③合并精神系統(tǒng)疾病，無(wú)法正常交流；④病歷資料不完整。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入96 例膽囊癌患者和96 例膽囊息肉患者。膽囊癌患者中男52 例，女44 例；年齡60～79 歲，平均（71.4±4.02）歲；美國(guó)癌癥聯(lián)合委 員 會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7 版TNM 分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期35 例，Ⅲ期36 例，Ⅳ期4 例；分化程度：低分化17 例，中分化30 例，高分化49 例：病理類型：腺癌81 例，鱗狀細(xì)胞癌15 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例；浸潤(rùn)深度：淺肌層35 例，深肌層43 例，全肌層18 例。膽囊息肉患者中男63 例，女33 例；年齡60～79 歲，平均（72.0±3.16）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清MMP2、VEGF水平

術(shù)前1 天及術(shù)后1 周，取兩組患者空腹靜脈血2 ml置于抗凝管內(nèi)，靜置2 h，1000 r/min離心20 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA 檢測(cè)兩組患者血清MMP2、VEGF、VEGFC 受體VEGFR3（Flt4）水平，按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋及加樣、孵育，并采用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)光密度值（optical density，OD），計(jì)算樣本濃度。

1.3 免疫組化法檢測(cè)不同組織中MMP2、VEGF 蛋白表達(dá)情況及結(jié)果判定

取膽囊癌患者的膽囊癌組織和膽囊息肉患者的膽囊息肉組織，切片，室溫脫蠟，予以適量的2%過(guò)氧化氫清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，經(jīng)過(guò)微波修復(fù)處理，予以適量的5%山羊血清封閉處理，加入一抗（MMP2、VEGF），4 ℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育10 min，再予以適量的二氨基聯(lián)苯胺溶液染色。結(jié)果判定：VEGF 定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，每個(gè)視野下10%以上膽囊癌細(xì)胞質(zhì)（或細(xì)胞膜）呈棕黃染色判定為陽(yáng)性。MMP2定位于細(xì)胞質(zhì)，以視野中細(xì)胞質(zhì)呈棕色或褐色染色，且著色程度明顯重于背景色，判定為陽(yáng)性，僅對(duì)呈陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行最終的計(jì)數(shù)（間質(zhì)染色除外）。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分，未著色計(jì)0 分、著色弱計(jì)1 分、中等著色計(jì)2 分、著強(qiáng)色計(jì)3 分；依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為1%～25%計(jì)0 分、陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為26%～50%計(jì)1分、陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＞50%計(jì)2分。將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分相加，0～2 分判定為MMP2、VEGF 蛋白表達(dá)陰性，3～5分判定為MMP2、VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性。

1.4 隨訪

膽囊癌患者術(shù)后，采用電話、門(mén)診隨訪等方式進(jìn)行為期3 年的隨訪，隨訪截止時(shí)間為2020 年12月，記錄膽囊癌患者的生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清MMP2、VEGF、Flt4 水平的比較

術(shù)前1 天，觀察組患者血清MMP2、VEGF、Flt4水平均明顯高于對(duì)照組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。術(shù)后1 周，兩組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明顯低于本組術(shù)前1 天，且觀察組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明顯高于對(duì)照組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表1）

表1 手術(shù)前后兩組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平的比較

2.2 不同組織中MMP2、VEGF蛋白表達(dá)情況的比較

膽囊癌組織中MMP2 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為64.58%（62/96），明顯高于膽囊息肉組織的35.42%（34/96），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=16.333，

P

=0.000）；膽囊癌組織中VEGF 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為42.71%（41/96），明顯高于膽囊息肉組織的0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=52.133，

P

=0.000）。（圖1）

圖1 膽囊癌組織和膽囊息肉組織中MMP2、VEGF蛋白表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

2.3 不同臨床特征膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF 蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、病理類型膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。隨著浸潤(rùn)深度的加深，膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=12.409、21.751，

P

＜0.05）；TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為低分化膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度為中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=9.383、32.752、5.052，

P

＜0.05）；TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為低分化膽囊癌患者膽囊癌組織中VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度為中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=37.825、16.082、22.852，

P

＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

2.4 生存情況的比較

隨訪3 年，MMP2 陽(yáng)性表達(dá)膽囊癌患者3 年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移4 例，病死22 例；MMP2 陰性表達(dá)膽囊癌患者3 年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移1 例，病死4 例；MMP2 陽(yáng)性表達(dá)膽囊癌患者3 年生存率為64.52%（40/62），低于陰性表達(dá)患者的88.24%（30/34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=5.572，

P

=0.018）。VEGF 陽(yáng)性表達(dá)患者3 年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移3 例，病死20 例；VEGF 陰性表達(dá)膽囊癌患者3 年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移1 例，病死2 例；VEGF 陽(yáng)性表達(dá)膽囊癌患者3 年生存率為51.22%（21/41），明顯低于VEGF 陰性表達(dá)患者的96.36%（53/55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=27.100，

P

=0.000）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程受多個(gè)層級(jí)、多個(gè)環(huán)節(jié)的共同調(diào)控，是一種比較復(fù)雜的生物學(xué)行為表達(dá)的過(guò)程，且腫瘤細(xì)胞具有局部浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力，監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)情況，能有效預(yù)測(cè)腫瘤及患者的預(yù)后。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)后1 周，兩組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明顯低于本組術(shù)前1 天，且觀察組患者血清MMP2、VEGF、Flt4 水平均明顯高于對(duì)照組患者，表明手術(shù)可在一定程度上維持患者體內(nèi)VEGF、Flt4、MMP2 的平衡，觀察組患者術(shù)后雖然存在一定程度的下降，但仍始終高于對(duì)照組患者，表明VEGF、Flt4、MMP2 可能與膽囊癌有一定關(guān)聯(lián)。因此，本研究進(jìn)一步探討MMP2、VEGF 表達(dá)情況與膽囊癌的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，膽囊癌患者通過(guò)手術(shù)切除病變組織，可在一定程度上減輕膽囊癌細(xì)胞的侵襲、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，同時(shí)，MMP2 的高表達(dá)可降解細(xì)胞基質(zhì)膜及相關(guān)結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞表達(dá)多種惡性生物學(xué)信息，促進(jìn)下游因子VEGF 的表達(dá)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成；而VEGF 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)可與特異性受體Flt4 結(jié)合，促進(jìn)局部組織內(nèi)VEGF 的表達(dá)，從而促使腫瘤細(xì)胞向淋巴遷移及自身的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，隨著浸潤(rùn)程度的加深，MMP2、VEGF 水平逐漸升高，TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為低分化膽囊癌患者膽囊癌組織中MMP2、VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度為中高分化的患者，與王紹勇和鄧小凡的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，隨訪3 年，MMP2 陽(yáng)性表達(dá)膽囊癌患者3 年生存率為64.52%，低于MMP2 陰性表達(dá)患者的88.24%，VEGF 陽(yáng)性表達(dá)膽囊癌患者3年生存率為51.22%，低于VEGF 陰性表達(dá)患者的96.36%。這可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞不同的浸潤(rùn)深度及分化程度使MMP2、VEGF 的表達(dá)存在差異，且隨著腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)肌層程度的加深，TNM 分期的增大、分化程度的降低，均可導(dǎo)致MMP2、VEGF 的表達(dá)上調(diào)。此外，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽囊癌患者膽囊癌組織MMP2、VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率升高，表明膽囊癌發(fā)展程度越高，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲情況越明顯，腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力的增強(qiáng)還可促使腫瘤新生血管內(nèi)MMP2、VEGF 蛋白的表達(dá)，從而促使膽囊癌細(xì)胞間質(zhì)血管網(wǎng)及淋巴管的大量產(chǎn)生，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步向淋巴管轉(zhuǎn)移，不同分化程度膽囊癌患者M(jìn)MP2、VEGF 的差異，可以作為腫瘤患者病情嚴(yán)重程度的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，同時(shí)也對(duì)預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后有重要意義，與Zhao等的研究結(jié)果一致。

綜上所述，膽囊癌患者血清MMP2、VEGF、Flt4 的表達(dá)水平較高，且MMP2、VEGF 蛋白的表達(dá)情況對(duì)膽囊癌患者的預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，其陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后較差。