余 英 楊潔鈺 易桂林 王 茜 余學(xué)軍

(1 宜賓林竹產(chǎn)業(yè)研究院 四川宜賓 644000；2 浙江農(nóng)林大學(xué) 杭州 311300)

糠殼是白酒釀造過程中最常用的輔料之一，其主要作用是為白酒釀造過程中的微生物生長(zhǎng)繁殖提供優(yōu)良的附著條件與微氧環(huán)境，但糠殼本身含有大量糠嗅味、泥腥味等邪雜氣味，若控制不好糠殼清蒸工藝，容易給酒體帶來異味[1]。竹葉中含有竹纖維，竹纖維的組織結(jié)構(gòu)具有一定的硬度和吸水性，可為固態(tài)白酒發(fā)酵過程中的微生物繁殖代謝提供一定的空間支撐，且竹材料成本相比糠殼更低廉。目前已有研究表明，可以將竹材料應(yīng)用到白酒固態(tài)釀造中，有效避免糠殼使用對(duì)酒體的影響，相比傳統(tǒng)白酒其主體酯含量升高，糠醛等不利于口感的物質(zhì)含量降低，酒體風(fēng)味成分變豐富[2－3]。竹葉的提取物中含有竹葉黃酮、多糖、氨基酸及其衍生物等與人體生命活動(dòng)有關(guān)的化合物，多種成分復(fù)合的竹葉提取物有著顯著的抗氧化性能、防腐性能，具有降血脂、抗衰老、抗癌等作用，在食品、醫(yī)療、化妝品領(lǐng)域有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[4－5]。但也有研究表明，竹葉中的活性成分有一定的抑菌作用，不同竹葉活性成分提取物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)影響也可能不同[6]。因此，本研究旨在探究宜賓市當(dāng)?shù)?0 種代表性竹種的竹葉提取物的活性成分含量及其差異，并探究不同竹葉提取物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響，以期為多種竹葉活性成分的合理開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，并篩選出適宜替代糠殼進(jìn)行白酒釀造的竹種，以期為竹葉資源的開發(fā)利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)選用的竹葉源自佯黃竹 (Bambusa changningensisYi et B.X.Li)、綿竹 (Bambusa intermediaHsueh et Yi)、硬頭黃竹 (Bambusa rigidaKeng et Keng f.)、慈竹(Neosinocalamus affinis)、麻竹 (Dendrocalamus latiflorusMunro)、綠竹[Dendrocalamopsis oldhami(Munro) Keng]、楠竹[Phyllostachys heterocycla(Carr.) Mitford cv.Pubescens]、方竹[Chimonobambusa quadrangularis(Fenzi) Makino]、苦竹 [Pleioblastus amarus(Keng) keng]、箬竹 [Indocalamus tessellatus(Munro) Keng f.]等10 種宜賓代表性竹種，分別采摘自宜賓市翠屏區(qū)、南溪區(qū)、江安縣、長(zhǎng)寧縣、興文縣等區(qū)(縣)。

酵母菌:安琪酵母菌股份有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，福林酚試劑(北京索萊寶試劑限公司)；氯化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，乙醇，檸檬酸鈉，碳酸氫鈉，鋅粉，苯酚，濃硫酸，碳酸鈉，酒石酸鉀鈉，硫酸銅，硫酸鈉，碘化鉀，碘酸鉀，鹽酸，亞鐵氰化鉀，硫酸鋅，草酸，硫酸，硫代硫酸鈉，淀粉，酚酞，醋酸鉀，均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高壓蒸汽滅菌鍋:DSX-18L-I，上海申安醫(yī)療器械廠；循環(huán)水式真空泵:SHZ-Ⅲ，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠；鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9070A，真空干燥箱:DZF-6050，蘇州江東精密儀器有限公司；超聲波清洗機(jī):F-060P，深圳福洋科技集團(tuán)有限公司；振蕩器:HY-3A，常州邁科諾儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì):UV-1750，日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；粉碎機(jī):S4-M71，九陽股份有限公司；集熱式磁力攪拌器:DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 竹葉提取物的制備

將新鮮采集的竹葉用清水沖洗，瀝干，置于鼓風(fēng)干燥箱中分?jǐn)偅?0 ℃干燥至恒重，用粉碎機(jī)將其粉碎得竹葉干粉，精密稱取竹葉粉末15 g 于250 mL 錐形瓶中，加入150 mL 60%乙醇，超聲30 min，抽濾得竹葉提取物溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，50 ℃真空干燥得到竹葉60%乙醇提取物，冷藏備用[7]。

1.3.2 竹葉提取物成分測(cè)定方法

1) 總黃酮含量測(cè)定。采用比色法測(cè)定竹葉提取物中總黃酮含量，具體方法參考國(guó)標(biāo)SN/T4592—2016。

2) 總多酚含量測(cè)定。福林－酚比色法測(cè)定竹葉提取物中總多酚含量，具體方法參考李巨秀等[8]的方法，具體操作為:0.05 g 竹葉提取物60%乙醇定容至50 mL，得到樣品液，取0.5 mL樣品液，1.0 mL Folin-Ciocalteu 試劑及2.0 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至25 mL，20 ℃避光反應(yīng)2 h 后，以試劑空白為對(duì)照，在波長(zhǎng)760 nm 處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其多酚含量。

3) 總糖含量測(cè)定。測(cè)定方法參考國(guó)標(biāo)SN/T4260—2015。

4) 還原糖含量測(cè)定。測(cè)定方法參考國(guó)標(biāo)NY/T1278—2007。

5) 多糖含量測(cè)定。竹葉提取物中的總糖含量減去還原糖含量，即為竹葉多糖的含量[9]。

1.3.3 竹葉提取物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

竹葉提取物抑菌活性的測(cè)定采用濾紙片法，又稱抑菌圈法或瓊脂平板法。濾紙片法實(shí)驗(yàn)步驟如下:

1) 濾紙片的制備:用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm 的圓片，放入干燥潔凈的試管中經(jīng)121 ℃濕熱滅菌20 min，浸入各濃度竹葉提取液中，1 h后取出。

2) 菌懸液的制備:取一定量安琪酵母菌于30℃無菌生理鹽水中，恒溫培養(yǎng)箱30 ℃活化1 h，制得酵母菌菌原液。吸取1 mL 菌原液加入9 mL無菌生理鹽水中，得到稀釋10 倍的菌懸液，依次進(jìn)行梯度稀釋。將不同稀釋度的菌懸液各吸取150 μL 分別加入到已滅菌冷卻的酵母菌浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，涂布均勻，28 ℃培養(yǎng)48 h觀察，酵母菌能長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿且分布均勻?yàn)檫m宜的菌液濃度。

3) 無菌移液管移取菌懸液150 μL 加在已倒好的平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻，用無菌鑷子夾取已制備好的濾紙片，放到含菌平皿上，每皿4片，培養(yǎng)皿28 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察量取抑菌圈直徑，抑菌圈直徑越大表明抑菌活性越強(qiáng)[10]。

酵母菌浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方:1%酵母菌膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次，各樣品的指標(biāo)平行測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (當(dāng)P<0.05 時(shí)判斷組間存在顯著差異)，用Origin 2016 64Bit 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉提取物黃酮含量分析

從圖1 可見，在不同竹種竹葉中黃酮含量不同，竹葉60%乙醇提取物中黃酮含量從高到低排序依次為佯黃竹>方竹>苦竹>綿竹>綠竹>楠竹>箬竹>慈竹>麻竹>硬頭黃竹；黃酮含量最高的為佯黃竹、達(dá)到12.86%，含量最低的是硬頭黃竹、僅有3.24%，其余竹種竹葉黃酮含量在4.14%～9.88%；不同竹種間竹葉提取物中黃酮含量差異顯著(P<0.05)。竹種竹葉活性成分含量與遺傳、氣候、環(huán)境等因素有關(guān)，佯黃竹、方竹、苦竹竹葉中黃酮含量豐富，可作為黃酮提取的重要潛在植物來源。

圖1 不同竹種竹葉提取物總黃酮含量Fig.1 The flavonoids content of bamboo leaf extracts from different bamboo species

2.2 竹葉提取物多酚含量分析

從圖2 可見，在竹葉60%乙醇提取物中多酚含量從高到低排序依次為慈竹>佯黃竹>方竹>楠竹>綠竹>苦竹>硬頭黃竹>綿竹>箬竹>麻竹；含量最高的為慈竹、達(dá)到10.32%，含量最低的是麻竹、僅有4.54%；在部分竹種間竹葉提取物中多酚含量差異顯著(P<0.05)，部分竹種間多酚含量差異不顯著(P>0.05)，如佯黃竹和方竹多酚含量均在8.22%左右，楠竹、苦竹、綠竹多酚含量在7.40%左右。

圖2 不同竹種竹葉提取物總多酚含量Fig.2 The polyphenol content of bamboo leaf extracts from different bamboo specie

與圖1 比較可以發(fā)現(xiàn)，在竹葉提取物中黃酮含量與多酚含量沒有明顯關(guān)系，黃酮和多酚含量豐富的竹種為佯黃竹、方竹、苦竹、慈竹，在其竹葉提取物中黃酮和多酚總含量均在15%以上，說明這幾種竹葉可作為黃酮、多酚的重要潛在植物來源。但黃酮和多酚均具有一定抑菌性，其含量高的竹葉作為白酒釀造輔料時(shí)可能抑制酵母菌生長(zhǎng)，且在不同地域或季節(jié)的竹葉中活性成分含量可能不同，其對(duì)酵母菌的抑制作用也不同。

2.3 竹葉提取物總糖含量分析

從圖3 可見，在不同竹種竹葉60%乙醇提取物中總糖含量均不高，含量為0.61%～1.16%，從高到低排序依次為楠竹>慈竹>綠竹>麻竹>硬頭黃竹>綿竹>箬竹>方竹>佯黃竹>苦竹；提取物中總糖含量最高的為楠竹和慈竹，分別為1.16%和1.13%，且二者間含量差異不顯著(P>0.05)；含量最低的為苦竹、佯黃竹，分別為0.61%、0.63%，二者間含量差異亦不顯著(P>0.05)。測(cè)定結(jié)果比陸志科等[11]測(cè)定的竹葉總糖含量偏低，這是因?yàn)樘崛》椒ǖ牟顒e，且在本研究中由60%乙醇提取得到的糖不含不溶性糖，總糖含量低，說明用60%乙醇提取得到的竹葉中的活性物質(zhì)主要是黃酮和多酚。

圖3 不同竹種竹葉提取物總糖含量Fig.3 The sugar content of bamboo leaf extracts from different bamboo species

2.4 竹葉提取物還原糖含量分析

還原糖是指具有還原性的糖類，分子中含有游離醛基或酮基的單糖和含有游離醛基的二糖都具有還原性，還原性糖主要有葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖等。從圖4 可看出，在不同竹種竹葉60%乙醇提取物中還原糖含量均不高，含量為0.09%～0.29%，從高到低排序依次為慈竹>方竹>箬竹>硬頭黃竹>麻竹>苦竹>綠竹>綿竹>佯黃竹>楠竹；還原糖含量最高的是慈竹，最低的是楠竹。

圖4 不同竹種竹葉提取物還原糖含量Fig.4 The reducing sugar content of bamboo leaf extracts from different bamboo species

2.5 竹葉提取物多糖含量分析

將樣品溶液中的總糖含量減去還原糖含量，即為竹葉多糖的含量[9]。圖5 為不同竹種竹葉提取物多糖含量，在不同竹種竹葉60%乙醇提取物中多糖含量為0.46%～1.07%，從高到低排序依次為楠竹>慈竹>綠竹>麻竹>綿竹>硬頭黃竹>佯黃竹>苦竹>箬竹>方竹；多糖含量最高的是楠竹，最低的是方竹；在部分不同竹種間竹葉提取物中多糖含量差異顯著(P<0.05)。結(jié)合圖3 和圖4可發(fā)現(xiàn)，不同竹種竹葉內(nèi)總糖、還原糖、多糖含量無明顯關(guān)系。有文獻(xiàn)報(bào)道竹葉多糖對(duì)人體有獨(dú)特的保健功效，丁紅秀[12]研究發(fā)現(xiàn)竹葉多糖綜合表現(xiàn)為廣譜抗菌活性，但對(duì)真菌無抑制作用，說明竹葉多糖可能對(duì)酵母菌生長(zhǎng)無抑制作用。

圖5 不同竹種竹葉提取物多糖含量Fig.5 The polysaccharide content of bamboo leaf extracts from different bamboo species

2.6 竹葉提取物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

圖6 是不同竹種竹葉提取物濃度為16 mg/mL時(shí)對(duì)酵母菌抑制生長(zhǎng)的情況，分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)竹葉提取物在一定濃度范圍時(shí)，不同竹種竹葉提取物對(duì)酵母菌的抑菌圈直徑僅為6.15～9.20 mm，說明在濃度較高時(shí)，不同竹種竹葉提取物的抑菌作用均不明顯，其中除佯黃竹和方竹外，其余竹葉的抑菌圈大小均<7 mm，可認(rèn)為對(duì)酵母菌無抑菌作用[13]，在方菊等[14]、許鋼等[15]的研究中也發(fā)現(xiàn)高濃度的竹葉提取物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)無明顯抑制作用。在本研究中，佯黃竹對(duì)酵母菌的抑菌圈直徑最大為9.20 mm，說明佯黃竹竹葉提取物對(duì)酵母菌的抑菌作用強(qiáng)于其他竹種，根據(jù)圖1—圖5對(duì)竹葉提取物各成分含量分析，黃酮和多酚物質(zhì)可能在竹葉提取物抑菌性中占主導(dǎo)作用。在本研究中，部分結(jié)果與陸志科等[11]研究結(jié)果不同，這可能是因竹葉中抗菌成分的含量受種類、遺傳因素、環(huán)境條件等多種因素影響所致。

圖6 不同竹種竹葉提取物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of bamboo leaf extracts from different bamboo species on yeast growth

在白酒釀造過程中，輔料對(duì)釀酒微生物生長(zhǎng)繁殖的影響主要在于輔料中各種物質(zhì)成分對(duì)微生物生長(zhǎng)的促進(jìn)或抑制作用，原理是物質(zhì)環(huán)境對(duì)微生物體內(nèi)酶的活性的影響[16]。除佯黃竹外，其余竹種竹葉中的主要活性成分對(duì)白酒釀造過程中的主要微生物酵母菌的抑制作用極小，說明竹葉作為白酒釀造輔料具有可行性。

3 結(jié)論

在宜賓10 種不同竹種竹葉提取物中黃酮、多酚、總糖、還原糖、多糖含量受竹種類、遺傳、環(huán)境等因素影響，不同竹種60%乙醇提取物中的活性成分含量不同，其主要活性成分是黃酮和多酚，總糖、還原糖、多糖含量較少。其中，黃酮含量為3.24%～12.86%，黃酮含量最高的為佯黃竹，含量最低的是硬頭黃竹，且不同竹種間黃酮含量差異顯著(P<0.05)；多酚含量為4.54%～10.32%，多酚含量最高的是慈竹，最低的是麻竹，部分不同竹種間竹葉多酚含量差異顯著(P<0.05)；在不同竹種竹葉提取物中總糖、還原糖、多糖含量均不高，總糖含量為在0.61%～1.16%，還原糖含量為0.09%～ 0.29%，多糖含量為0.46%～1.07%。黃酮和多酚含量最豐富的竹種為佯黃竹、方竹、苦竹、慈竹，竹葉提取物中黃酮和多酚總含量均在15%以上，可作為黃酮、多酚的重要潛在植物來源。

在不同竹種竹葉提取物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在高濃度下，除佯黃竹竹葉提取物對(duì)酵母菌出現(xiàn)明顯抑菌圈外，其余竹種均無明顯抑菌圈，表明在一定濃度下，竹葉中的主要活性成分對(duì)白酒釀造過程中的主要微生物酵母菌的生長(zhǎng)無影響，竹葉作為白酒釀造輔料具有可行性，可結(jié)合地域資源和各活性成分含量情況選擇適宜的竹種作為釀酒輔料，以資源豐富、活性成分含量高、對(duì)酵母菌生長(zhǎng)無抑制作用的竹種為佳。利用竹葉替代糠殼作為輔料生產(chǎn)白酒，可提升宜賓竹資源利用率，豐富宜賓竹文化、酒文化，并帶來直接的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)推動(dòng)宜賓竹產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展將有重要意義。