朱永興，關雅靜，李 新，張春義

（1寧夏農林科學院農業(yè)生物技術研究中心，銀川750002；2中國農業(yè)科學院生物技術研究所，北京100081）

0 引言

土壤鹽漬化是一個世界性的資源和生態(tài)難題，嚴重制約著農業(yè)產業(yè)的發(fā)展和進步。中國存在有鹽堿地面積為3.6×107hm2，其中，具有可以利用潛力的鹽漬土面積約1.3×107hm2，約占總耕地面積的10%[1-2]，這是中國開發(fā)利用鹽堿荒地的主要資源。玉米是中度鹽敏感作物，突然鹽漬化嚴重制約了玉米產業(yè)的發(fā)展，缺乏耐鹽品種是目前嚴重制約玉米產業(yè)發(fā)展的主要問題[3]。在加強鹽堿地土壤改良的同時，挖掘作物本身的耐鹽能力，篩選耐鹽品種是加快利用鹽堿土壤最為經濟有效的途徑。因此，開展玉米品種的耐鹽性綜合評價和耐鹽品種篩選，對于鹽堿地高產栽培及抗性品種選育具有重要意義。

鹽脅迫是造成農作物減產的主要非生物脅迫之一，是一種多形態(tài)脅迫，通過滲透脅迫、營養(yǎng)脅迫和離子毒害三種途徑來降低作物產量甚至導致植物死亡[4]。滲透脅迫和離子效應是鹽脅迫對植物體傷害的兩個主要方面。鹽脅迫下植物通過液泡中積累無機鹽離子進行滲透調節(jié)，以葉片中積累的Na+、K+、Cl-起主要作用。有研究表明，植物體內因過度積累鈉離子而減少了對鉀離子、鈣離子等的吸收，致使生殖生長和營養(yǎng)生長不良，進而導致作物死亡[5-7]。丁順華[8]認為小麥苗期受NaCl脅迫后，地上部和根部Na+含量都增加；王煥文等[9]認為鹽敏感小麥植株內的Na+、Cl-積累量較耐鹽小麥品種的增加量不顯著；韓金龍等[10]認為玉米受到鹽脅迫時，隨著NaCl濃度的增加，葉片和根中Na+、K+升高，且根中的Na+、K+高于葉片中；高雪等[11]認為，青儲玉米在鹽環(huán)境下，與對照相比，在鹽脅迫下，甜高粱根系、葉片K+含量降低，青貯玉米根系、莖基K+含量降低。研究也表明，植物為了應對鹽脅迫，會保持低的Na+水平以及正常的K+：Na+比，從而提高其耐鹽水平[12-13]。盡管目前有關植物耐鹽的分子機理還不完全清楚，但是一些有關的調控因子也已經被發(fā)現。目前研究表明，植物體內離子轉運蛋白主要在液泡膜或者其他細胞器膜上表達，當植物受到鹽脅迫時該類蛋白可以將Na+局域化在液泡內從而維持細胞內的離子穩(wěn)態(tài)AtNHX1就是典型的液泡膜型的Na+/H+逆向轉運蛋白在其他物種中也克隆到了該基因的同源基因[14-15]。在玉米中，研究表明，不同的玉米自交系也表現出對鹽脅迫的不同的響應，也說明玉米的耐鹽機理比較復雜玉米Na+/H+逆向轉運蛋白ZmNHX1是液泡膜型的[16-17]，當玉米受到鹽脅迫時，根中的ZmNHX1基因表達量上調，提高玉米的耐鹽性[18]。張凌霄等[19]分離了ZmNHX7，它編碼一個玉米質膜陽離子/質子逆向轉運蛋白，在緩解Li+對植物的毒害和維持細胞內的離子平衡等方面發(fā)揮重要作用。然而，對于玉米幼苗期離子響應的機理還知之甚少。

鑒于此，本研究以4份玉米自交系為研究對象，在高鹽脅迫下，對玉米自交系根部和地上部的Na+、K+、Ca2+進行了測定分析，并對K+:Na+、Ca2+:Na+進行了分析，以此為基礎，借助轉錄組學，初步探索玉米耐鹽生理以及調節(jié)機制，為選育耐鹽新品種提供理論支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用的玉米(Zea mays L.)自交系均為本實驗室保存，挑選籽粒飽滿、大小均勻種子用于本實驗的后續(xù)操作。

1.2 實驗方法

1.2.1 離子測定 挑選籽粒飽滿的玉米自交系S420、S487、S388、B73的種子，用蒸餾水浸泡一天，去除不飽滿的種子，播種于裝滿營養(yǎng)土（草炭土和蛭石3:1）的營養(yǎng)缽中（高12 cm，口徑12 cm），每個材料種植6盆，其中3盆澆水作為對照，另外3盆澆灌200 mmol/L NaCl進行脅迫，置于光照強度3000～5000 Lx，光照時間16 h/8 h，溫度20℃～25℃條件下進行種子萌發(fā)。14天后選取長勢一致的材料，取其地上、地下部分進行Na+、K+、Ca2+進行測定，并地上、地下K+:Na+、Ca2+:Na+進行了分析；

1.2.2 轉錄組測定 以S420、S388為研究對象，處理方法與離子測定相同，鹽脅迫14天后，選取長勢一致株系，取相同部位的葉片進行提取RNA，進行RNA-seq。每個樣品進行3次重復。

1.3 測定方法

玉米地上、地下部分的Na+、K+、Ca2+測定運用火焰光度計進行，具體方法參照[20]。

1.4 數據分析

各樣本Na+、K+、Ca2+之間的相關性分析運用DPS7.05進行分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下Na+含量變化研究

本研究中4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫21天后，取其葉片、根進行Na+含量的測定，并對葉片、根中Na+含量在鹽脅迫前后的累積量進行了分析，結果顯示：鹽脅迫后，4個材料葉片中Na+含量都不同程度的升高，其中最高的是S388，其次是S420、B73，最低的是S487，鹽脅迫后葉片中Na+含量S388與S487呈顯著性差異（圖1A）；鹽脅迫后根中Na+含量也表現出增加的趨勢，其中根中Na+含量最高的是S420，其次是B73、S487，最低的是S388，根中Na+含量S420與S487、S388呈顯著性差異，而S487、S388的Na+含量沒有顯著性差異（圖1B）；4個材料鹽脅迫前后葉片和根部的Na+含量的累積量也存在明顯差異，鹽脅迫前后葉片中Na+的累積量最高的是B73，其次是S487、NX420，最低的是S388，而根中Na+的累積量最高的是S420、B73，其次是S388、S487（圖1C），這說明S388、S487的根部相對于S420、B73積累了較少的Na+。

圖1 玉米自交系鹽脅迫下Na+含量變化研究

2.2 鹽脅迫下Ca2+含量變化研究

本研究中4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫14天后，取其葉片、根進行Ca2+含量的測定，并對葉片中Ca2+含量在鹽脅迫前后的累積量進行了分析，結果顯示：鹽脅迫后，4個材料葉片中Ca2+含量都不同程度的降低，其中最低的是S388，其次是S420、S487、B73，鹽脅迫后葉片中Ca2+含量S388與S420呈顯著性差異（圖2A）；鹽脅迫后根中Ca2+含量也表現出降低的趨勢，其中根中Ca2+含量最高的是S420，其次是S388、B73，最低的是 S487，根中 Ca2+含量 S420 與S487、S388呈顯著性差異，而S487、S388、B73的Ca2+含量沒有顯著性差（圖2B）異；4個材料鹽脅迫前后葉片和根部的Ca2+的減少量也存在明顯差異，鹽脅迫前后葉片中Ca2+的減少量最多的是S388，其次是S487、B73，減少最少的是S420，而根中Ca2+的減少量最高的是 S420，其次是 S388、B73，減少最低的是 S487（圖2C）。

圖2 玉米自交系鹽脅迫下Ca2+含量變化研究

2.3 鹽脅迫下K+含量變化研究

本研究中4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫21天后，取其葉片、根進行K+含量的測定，并對葉片中K+含量在鹽脅迫前后的累積量進行了分析，結果顯示：鹽脅迫后，4個材料葉片中K+含量都不同程度的降低，鹽脅迫后葉片中K+含量4個材料沒有存在顯著性差異（圖3A）；鹽脅迫后根中K+含量也表現出降低的趨勢，其中根中K+含量降低最高的是B73，其次是S487、S388、S420，根中 K+含量 B73 與 S487、S388、S420呈顯著性差異，而S487、S388、S420的K+含量沒有顯著性差異（圖3B）；4個材料鹽脅迫前后葉片和根部的K+含量的減少量也存在明顯差異，鹽脅迫前后葉片中K+的含量減少最多的是S420，其次是S487、S388、B73，而根中K+的減少量最高的S388，其次是S420、B73、S487，但它們之間沒有存在顯著性差異（圖3C）。

圖3 玉米自交系鹽脅迫下K+含量變化研究

2.4 鹽脅迫下Na+：K+的變化研究

4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫14天后，取其葉片、根進行Na+、K+含量的測定，并進行了K+:Na+比值分析，結果顯示：4個材料鹽脅迫后葉片中Na+:K+比最高的是S388、S420，其次是S487、B73，相關性分析顯示4個材料葉片的K+:Na+比不存在顯著性差異；而根中K+:Na+比最高的是S487、B73，其次是S388、S420，結果也顯示，S420根中K+:Na+比與S388、S487、B73呈顯著性差異（圖4）。

圖4 玉米自交系鹽脅迫下K+：Na+比的變化研究

2.5 鹽脅迫下Ca2+：Na+比的變化研究

4份玉米自交系，在200 mmol/L NaCl溶液脅迫14天后，取其葉片、根進行Na+、Ca2+含量的測定，并進行了Ca2+:Na+比值分析，結果顯示：4個材料鹽脅迫后葉片中 Ca2+:Na+比最高的是 S388，其次是 S487、S420、B73，并且S388葉中Ca2+:Na+比與其他3個自交系呈顯著性相關；而根中Ca2+:Na+比最高的是S388，其次是S420、S487、B73，相關性分析顯示沒表現出顯著性差異（圖5）。

圖5 玉米自交系鹽脅迫下Ca2+：Na+比的變化研究

2.6 鹽脅迫下玉米自交系的轉錄組分析

以S388、S420為研究對象，選取籽粒飽滿的種子播種于營養(yǎng)缽中（營養(yǎng)土:蛭石=3:1），每個營養(yǎng)缽播種8粒，每6個營養(yǎng)缽放置于一個托盤中，每個材料種植6盆，置于一個托盤中，然后在每個托盤中加入2 L 200 mmol/L NaCl溶液，并以同樣的方式種植，澆灌2 L淡水，作為對照(CK)，每隔7天每個托盤澆1 L淡水，保持足夠的生長所需的水分。14天后分別挑選處理組、對照組長勢一致的株系，取同一部位葉片進行轉錄組分析，進行3次重復。結果顯示：GO分析顯示可以發(fā)現2個材料差異基因參與到了離子轉運途徑、逆境信號以及離子跨膜運輸。VENE分析顯示，2個材料在鹽脅迫下240個基因共表達，其中S388有6254個基因表達，而S420為880個基因表達，這對今后候選基因的確定提供了重要的保障（圖6）。

圖6 玉米自交系轉錄組分析

3 討論

玉米作為一個中度鹽敏感作物，當植物遭受鹽脅迫時，會產生兩種脅迫階段，一是滲透調節(jié)，另一種是離子毒害[21]。由于種間差異，耐鹽種質會產生不同的應對鹽脅迫的調控機制，會將進入植物體內的Na+排出體外或者區(qū)隔化到液泡里，從而保持體內的離子平衡[22]。本試驗中4份玉米自交系在200 mmol/L NaCl溶液脅迫14天后，通過對根部及地上部進行Na+、K+、Ca2+測定分析，結果顯示：4個自交系中葉片和根中Na+累積量最少的是S388，而其體內K+、Ca2+也發(fā)生了比較明顯的變化，Fricke等[23]研究表明，當植物受到鹽脅迫時，其體內Na+會明顯增多，從而影響營養(yǎng)元素的吸收，會表現出鹽敏感的表型，S388在鹽脅迫前后Na+的累積量最少，說明其具有明顯的抗鹽表型，這與前人的研究基本一致。同時也發(fā)現，S388的Ca2+:Na+比在4個材料中表現出最高，這也說明S388的耐鹽機理是否參與到鈣代謝通路中[24]。轉錄組分析顯示，S388相對于S420參與了離子轉運途徑、逆境信號以及離子跨膜運輸等代謝途徑，從離子測定的結果也驗證了這一點，當然僅目前的數據還不足以完全證明這一點，還需要進一步更深入的進行研究證明，為后續(xù)的育種提供更多的證據和資源。

4 結論

玉米作為重要的農業(yè)及經濟作物，在西北乃至全國占有非常重要的地位，而中國存在大量鹽堿荒地亟待開發(fā)利用，選育有利耐鹽玉米種質是最有效的途徑，通過本研究的數據證明，4份玉米自交系中S388對鹽的耐受性最高，表型出葉片和根中積累了較少的Na+含量，轉錄組數據也顯示，S388在鹽脅迫下離子轉運、逆境信號以及跨膜轉運代謝途徑，這為今后研究其耐鹽機理提供了更多的證據，也為培育耐鹽品種培育提供材料基礎。