張 博，張悅麗，馬立國，祁 凱，劉 蘋，李長松，齊軍山

（1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/山東省植物病毒學(xué)重點實驗室，濟南250100；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，濟南250100）

0 引言

小麥根腐病是由多種土壤傳播病原菌單獨或混合侵染引起的重要病害，在小麥整個生育期均可發(fā)生，導(dǎo)致小麥減產(chǎn)，一般在20%～30%，嚴(yán)重時達(dá)50%以上[1]。該病主要病原是多種鐮刀菌和小麥根腐蠕孢菌。近些年，腐霉菌導(dǎo)致的根腐病日趨頻繁，小麥出苗期造成缺苗斷壟，在分蘗和返青拔節(jié)期造成植株萎蔫矮化，生長不良，嚴(yán)重時引起根部和莖基部腐爛，造成植株枯死，產(chǎn)量降低[2-4]。目前，該病害的防治主要利用內(nèi)吸性殺菌劑為活性成分的種衣劑進(jìn)行種子包衣，或利用三唑類殺菌劑進(jìn)行拌種，防治效果明顯且藥效能持續(xù)至拔節(jié)期[5-6]，但化學(xué)制劑的長期和超量使用，造成了土壤中有益微生物的種群的破壞，重金屬超標(biāo)等環(huán)境污染問題[7]。因此，生物防治倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，植物提取物等天然物質(zhì)研究應(yīng)用得到發(fā)展，國外報道無患子果皮提取物皂苷對蘋果黑星病菌(Venturia inaequalis)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)具有很好的抑菌活性[8]；石榴皮提取物能夠抑制橄欖炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)菌絲生長且防病效果明顯[9]；另有研究發(fā)現(xiàn)白芥子的水提取物中的Pure Yellow Mustard and Tillecur對Fusarium graminearum抑制效果顯著，濃度為1%時完全抑制病菌菌絲生長[10]；國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)大黃、博落回和狼毒提取物對4種病原細(xì)菌的抑菌活性顯著[11]；博落回、木醋酸、八角、丁香、細(xì)辛醚、石菖蒲6種植物提取物對番茄4種主要病害病原菌的抑制率達(dá)到60%以上[12]；生姜、花椒、八角和辣椒提取物對蕎麥立枯病菌的抑制效果顯著，抑制率能達(dá)75%以上[13]。本研究針對小麥根腐病的病原菌禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、刺腐霉菌(Pythium spinosum)和小麥根腐離蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，收集21種天然抑菌物質(zhì)，研究其對3種病原菌的抑制活性，為拓寬該病害生物防治的新思路提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及小麥品種

禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、刺腐霉菌(Pythium spinosum)和小麥根腐離蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，由本研究室分離、純化、鑒定并保存。

1.2 供試天然物質(zhì)

大黃素、白藜蘆醇、青蒿素、槲皮素、芹菜素、反式細(xì)辛醚、順式細(xì)辛醚從抑菌植物中提取獲得（本課題組對抑菌成分分離并鑒定）。

供試精油為薰衣草油、肉桂油、月桂油、丁香酚油、天竺葵油、薄荷酮油、桉樹油、香茅油、葡萄籽油、迷迭香油、野菊精油、檸檬精油、茶樹油、柚皮苷精油，均為單方精油，購自上海香匯生物科技有限公司。

1.3 室內(nèi)抑菌活性測定

采用菌絲生長法測定[14-19]：初次篩選按照100 mg/L濃度進(jìn)行，選出有效天然物質(zhì)；二次篩選將有效天然物質(zhì)與滅菌PDA培養(yǎng)基均勻混合，配制成不同濃度梯度，倒入培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中制成含藥培養(yǎng)基平板，滅菌水作對照，每濃度重復(fù)3次。在預(yù)培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌、刺腐霉菌和小麥根腐離蠕孢菌菌落邊緣打取菌餅（直徑0.5 cm），挑出置于PDA平板中間，分別在25℃（刺腐霉菌）和28℃（禾谷鐮刀菌和離蠕孢菌）的暗培養(yǎng)7～10天，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率并運用DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，得到EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 21種天然產(chǎn)物對小麥根腐病菌的抑菌活性初篩

將天然產(chǎn)物（需用丙酮溶解），按照100 mg/L濃度與PDA培養(yǎng)基混勻，進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，21種天然產(chǎn)物對小麥根腐病菌抑菌活性具有顯著差異性，其中，白藜蘆醇抑菌活性顯著，對禾谷鐮刀菌抑制率為18.75%，刺腐霉菌抑制率為85%，對離蠕孢菌抑制率為75%；其次是順式細(xì)辛醚，對禾谷鐮刀菌抑制率為56.25%，對刺腐霉菌抑制率為62.5%，對離蠕孢菌抑制率為56.2%；反式細(xì)辛醚對禾谷鐮刀菌抑制率為51.25%，對刺腐霉菌抑制率為37.5%，對離蠕孢菌抑制率為62.5%；丁香酚對禾谷鐮刀菌和刺腐霉菌抑制率均為37.5%，對離蠕孢菌抑制率為71.25%；薰衣草精油對3種病原菌均無抑菌活性；就小麥根腐病菌對天然產(chǎn)物的敏感程度而言，禾谷鐮刀菌對順式細(xì)辛醚最敏感，其次是反式細(xì)辛醚；刺腐霉菌對白藜蘆醇最敏感，其次是順式細(xì)辛醚和檸檬精油；離蠕孢菌對白藜蘆醇最敏感，其次是丁香酚。因此，說明小麥根腐病菌對21種天然產(chǎn)物的敏感程度同樣具有顯著差異性。

圖1 不同天然抑菌產(chǎn)物對小麥根腐病菌的抑制效果

2.2 天然產(chǎn)物對禾谷鐮刀菌抑菌EC50值測定

依據(jù)初篩結(jié)果，設(shè)計濃度梯度，順式細(xì)辛醚為250、100、75、50、10 mg/L，反式細(xì)辛醚為 500、250、100、75、50、10 mg/L，分別結(jié)果如表1所示。

表1 天然產(chǎn)物對禾谷鐮刀菌的抑菌活性

由圖表可以看出，反式細(xì)辛醚抑菌活性明顯，EC50值為69.9972 mg/L，順式細(xì)辛醚效果不顯著，EC50值為130.2344 mg/L（圖2、圖3）。

圖2 反式細(xì)辛醚對禾谷鐮刀菌的抑菌活性

圖3 順式細(xì)辛醚對禾谷鐮刀菌的抑菌活性

2.3 天然產(chǎn)物對刺腐霉菌抑菌EC50值測定

依據(jù)初篩結(jié)果，設(shè)計濃度梯度，白藜蘆醇為100、75、50、10、5 mg/L，順式細(xì)辛醚為250、100、75、50、10 mg/L，檸檬精油為500、250、100、50、10、5 mg/L，如表2所示。

表2 天然產(chǎn)物對刺腐霉菌的抑菌活性

由表可以看出，白藜蘆醇對刺腐霉菌有明顯抑菌活性，EC50值為24.4683 mg/L，其次是順式細(xì)辛醚和檸檬精油效果較好，EC50值分別為71.0284 mg/L和79.8388 mg/L。

2.4 天然產(chǎn)物對離蠕孢菌抑菌EC50值測定

依據(jù)初篩結(jié)果，設(shè)計濃度梯度，將白藜蘆醇為250、100、50、10、5 mg/L，丁香酚為200、100、50、10、1、0.5 mg/L。結(jié)果如表3所示。

表3 天然產(chǎn)物對離蠕孢菌的抑菌活性

由圖表可以看出，丁香酚對離蠕孢菌有明顯抑菌活性，EC50值為14.0664 mg/L，其次是白藜蘆醇，EC50值為22.0968 mg/L。

3 討論與結(jié)論

目前，國家大力倡導(dǎo)化學(xué)農(nóng)藥減施技術(shù)研究，植物提取物等天然產(chǎn)物在病害防治方面的研究和應(yīng)用得到進(jìn)一步提升，例如張亮等[20]測定了4種植物提取物對茶炭疽病菌抑制效果，結(jié)果表明蘆柑皮抑制效果顯著，EC50值為8.981 mg/L，艾蒿對分生孢子的抑制率為85.54%；張格杰等[21]測定26種植物乙醇提取物對植物病原菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)黃花草木樨、艾草、鐵桿蒿和黃花蒿抑菌效果好可應(yīng)用于無公害植物源殺菌劑的開發(fā)；沈佳鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)山茶葉提取物對蘋果腐霉病菌和小麥赤霉病菌抑制率在80%以上，可應(yīng)用于無公害植物源殺菌劑的開發(fā)；楊婷[23]研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物香芹酚、丁香酚、異丁香酚、枯茗醛、百里香酚對炭疽菌和鏈格孢有較好的抑菌活性，其中香芹酚抑菌活性最強，IC50分別為40.89 mg/L和18.19 mg/L。同時，在小麥根腐病防治方面，發(fā)現(xiàn)黃瑞香提取物對Fusarium graminearum有很好的效果[24]；蒼耳提取物對小麥根腐病菌也有較好的抑制作用[25]；張維庫等[26]發(fā)現(xiàn)牛心樸子所產(chǎn)生的生物堿能夠很好地抑制小麥根腐病菌的生長。本研究基于國內(nèi)外學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，較全面的收集天然產(chǎn)物，有針對性的篩選出對3種小麥根腐致病菌分別具有抑菌活性的天然產(chǎn)物，尤其是刺腐霉防治方面研究在國內(nèi)鮮有報道，為小麥根腐病生物防治具有指導(dǎo)意義，在協(xié)同化學(xué)防控小麥根腐病和開發(fā)新型植物源農(nóng)藥提供參考依據(jù)。同時，天然產(chǎn)物也具有一定的局限性，例如生物提取量較低、很多研究局限在室內(nèi)研究階段、在田間的持效性較短及田間多方因素對防效的影響等均是今后需要進(jìn)一步探索研究的新方向。

圖4 白藜蘆醇對離蠕孢菌的抑菌活性

圖5 丁香酚對離蠕孢菌的抑菌活性

本文研究了21種天然產(chǎn)物對小麥根腐病的主要病原菌禾谷鐮刀菌、刺腐霉和小麥離蠕孢菌的抑菌活性，明確了天然產(chǎn)物反式細(xì)辛醚、白藜蘆醇、丁香酚對3種病原菌具有顯著抑菌活性，其中，反式細(xì)辛醚對禾谷鐮刀菌活性顯著，EC50值為69.9972 mg/L；白藜蘆醇對刺腐霉菌活性顯著，EC50值為24.468 mg/L；丁香酚對離蠕孢菌活性顯著，EC50值為14.0664 mg/L。同時，說明了小麥根腐病菌對21種天然產(chǎn)物的敏感程度同樣具有顯著差異性，例如：白藜蘆醇抑菌活性對3種病原菌的抑制率分別為18.75%、85%和75%；反式細(xì)辛醚對3種病原菌的抑制率分別為51.25%、37.5%和62.5%；丁香酚對禾谷鐮刀菌和刺腐霉菌抑制率均為37.5%，對離蠕孢菌抑制率為71.25%；薰衣草精油對3種病原菌均無抑菌活性。因此，要有針對性的選擇天然抑菌物質(zhì)，提高小麥根腐病的生物防治效果。