胡曉婧,白 鑫,曲娟娟,劉俊杰,孔令輝,王光華

(1.中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081; 2.東北農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

0 引 言

環(huán)境微生物是自然生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是驅(qū)動地球各圈層物質(zhì)循環(huán)與能量交換的引擎。微生物介導的特定生態(tài)功能過程主要通過活性微生物來執(zhí)行[1]?；钚晕⑸锸侵妇哂谢驖撛诰哂猩L代謝特性和適應改變既定環(huán)境能力的微生物[2]，也是微生物生態(tài)學中微生物分離培養(yǎng)或功能鑒定的主要目標。盡管高通量測序已成為研究環(huán)境微生物多樣性及其結構功能的主流技術[3]，但環(huán)境樣品中DNA的直接擴增測序無法反映出真實的活性微生物群，很可能高估了環(huán)境中活性微生物的種類和數(shù)量[4]。這是因為，環(huán)境微生物總DNA主要包括：(1)活性細胞DNA，具有代謝活性且可培養(yǎng)的完整細胞DNA[5]；(2)休眠細胞DNA，低代謝活性且不可培養(yǎng)的活細胞和抗生素持留菌細胞，但在一定條件下或可恢復其代謝活性和可培養(yǎng)性的完整細胞DNA[6]；(3)死細胞DNA，包括細胞膜受損且正在裂解的和已死亡的非完整細胞DNA[7]；(4)胞外DNA，包括游離DNA和附著于其他物質(zhì)上的DNA[8]。盡管細胞死亡后，其所含DNA可能被環(huán)境中的脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)快速降解，但這種降解是不充分的，仍有大量死細胞DNA和胞外DNA長期存留于環(huán)境中[9]。因此，如何準確區(qū)分并量化環(huán)境活性微生物群，是當前環(huán)境微生物生態(tài)學研究中亟待解決的關鍵問題。

目前，國際上對活性微生物的判定主要有三個標準：(1)具有完整且有功能的細胞膜；(2)存在細胞代謝和能量流動過程；(3)具有能夠自我復制的DNA并能轉錄成RNA，進而翻譯成蛋白[10]。在此基礎上，多種活性微生物篩選區(qū)分方法被逐步開發(fā)出來(圖1)，它們的相對優(yōu)缺點見表1，主要分為兩大類：可培養(yǎng)法和不可培養(yǎng)法[2]?？膳囵B(yǎng)法已遠不能滿足探究環(huán)境微生物多樣性的需求。而ATP生物發(fā)光技術、微生物呼吸法、酶活性檢測法以及基于等溫微熱量法的熱流動技術等都受到通量的限制，對環(huán)境活性微生物的檢測沒有普適性[11-13]。在滿足高通量檢測的基礎上，基于RNA轉錄組學或蛋白組學技術、穩(wěn)定性同位素示蹤技術(DNA-SIP)已被廣泛用于檢測具有代謝活性的微生物類群，并適用于多種環(huán)境樣品[14-16]。然而，這些方法的實驗步驟較為繁瑣，實驗成本較高，且實驗過程中也存在很多限制因素，如RNA極易降解從而增加了實驗操作難度[17]；穩(wěn)定性同位素示蹤技術通常針對某些特定的功能微生物，且存在培養(yǎng)周期長、同位素耗材昂貴等問題[18]。因此，急需建立更加普適性且操作簡便的環(huán)境活性微生物的研究方法。

圖1 活性微生物篩選方法概括[2]Fig.1 Highlight of techniques to distinguish live from dead microbes

表1 活性微生物檢測的常用技術手段Table 1 Comparison of commonly used techniques to examine viable microbes

維持細胞膜的完整性是保持微生物活性的必要條件[19]，因此，細胞膜也可以被當作活性微生物細胞的分子標記物。針對細胞膜完整性的檢測，一系列核酸熒光染料應運而生，也為基于DNA的活性微生物檢測開辟了新的思路。其中，碘化丙錠(Propidium iodide,PI)、疊氮溴化乙錠(Ethidium monoazide,EMA)和疊氮溴化丙錠(Propidium monoazide,PMA)是常用的光敏性核酸染料[20-22]。這類染料自身的熒光非常微弱，但與核酸結合后熒光信號增強，它們通常不能穿透活性細胞完整的細胞膜，但能夠進入膜損傷后的死細胞，修飾鈍化其DNA[22]。PI染料法只能在熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡或流式細胞儀等儀器輔助下進行活性細胞的檢測，無法實現(xiàn)樣品的高通量測定，而PMA和EMA可與熒光定量PCR及高通量測序等技術相結合，更適合于復雜環(huán)境樣品中活性微生物組的檢測[23]。

1 PMA篩選活性微生物的基本原理

PMA染料法是一種簡便、快速的篩選區(qū)分活性微生物的方法。它對DNA具有高度親和性，在暗培養(yǎng)過程中可高效穿透死細胞的細胞膜，與暴露出來的DNA產(chǎn)生共價交聯(lián)。在可見光(最大吸收波長460 nm左右)的作用下，PMA所攜帶的光敏性疊氮基團會轉化為高反應性的氮賓自由基，并與其結合位點附近的任意碳氫化合物反應形成穩(wěn)定的共價碳氮鍵，致使DNA分子被永久修飾，最后阻斷DNA分子后續(xù)的PCR擴增等反應(圖2)。同時那些殘留在溶液中沒有與DNA分子發(fā)生交聯(lián)的PMA，在強光照射下可與水分子反應生成沒有活性的羥胺[22,24-25]。以上過程均在環(huán)境樣品DNA提取之前完成，由于PMA不能穿透活性細胞完整的細胞膜，故不會影響后續(xù)活性微生物的DNA提取和PCR擴增，最終使relic DNA在核酸純化中被選擇性剔除。PMA篩選后的活性微生物樣品可用于后續(xù)的高通量測序等多組學研究[26-27]。

圖2 PMA染料法選擇性檢測活性微生物細胞的流程Fig.2 Procedure of PMA dye in selectively detecting viable microbial cells

需要說明的是，EMA與PMA的工作原理基本類似，但EMA在隨后的實驗中被發(fā)現(xiàn)可穿透一些活性微生物的細胞膜，如EscherichiacoliO157:H7、Streptococcussobrinus、Micrococcusluteus、Staphylococcusaureus和Mycobacteriumavium等都能夠吸收EMA[22]，致使這些活性細胞被當作死亡的細胞而造成了假陰性結果。此外，由于EMA比PMA多攜帶一個正電荷，更易穿透活細胞的細胞膜，與帶負電荷的DNA結合[27]，因此，EMA被發(fā)現(xiàn)較PMA具有更高的細胞毒性，可能會殺死一些本來具有完整細胞膜的活性微生物[28-29]，如EMA對Listeriamonocytogenes和Legionellapneumophila的細胞毒性就要比PMA強[24-25]。相比而言，PMA因其較高的活性細胞選擇特異性，更適用于復雜環(huán)境樣品中活性微生物的研究。

目前，基于光敏性核酸染料篩選區(qū)分活性微生物的方法大多應用于臨床診斷、食品安全和動植物病原菌檢驗檢疫等方面[26,29-30]，并初步應用在復雜環(huán)境樣品中活性微生物群的研究中，但仍處于起步階段。本文結合最新國內(nèi)外研究進展，從底泥、土壤和水體等環(huán)境樣品方面綜述了目前PMA染料法在微生物生態(tài)學中的應用，并提出PMA技術現(xiàn)存的一些問題及改進對策，為切實有效地開展環(huán)境活性微生物多樣性及功能研究提供參考。

2 PMA在底泥研究中的應用

微生物是底泥生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，驅(qū)動著底泥中養(yǎng)分循環(huán)與轉化，是底泥生物活性的源泉[31]。Nocker等[32]首次將PMA應用于海洋和水庫的底泥樣品研究，結合PCR-DGGE技術研究發(fā)現(xiàn)，與未處理樣品相比，PMA能夠有效地抑制底泥樣品中relic DNA的PCR擴增，導致微生物群落的DGGE指紋圖譜和條帶密度產(chǎn)生改變，從而篩選區(qū)分出底泥樣品中活性微生物。Ramirez等[33]采集了北冰洋和太平洋區(qū)域多個地點的海洋底泥，用PMA去除樣品中relic DNA，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)樣品處理前后的細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)沒有顯著差異；基于細菌16S rRNA基因的測序結果顯示，盡管有個別地點的relic DNA含量相對較高，但它們對原核微生物的群落組成并未造成顯著影響；物種水平分析表明，原位的relic DNA可能來源于不同時期海洋底泥中的微生物，顯示了PMA染料法也有助于海洋底泥微生物起源與演化的研究。Wagner等[34]采用PMA染料法篩選發(fā)酵罐底泥中活性微生物，發(fā)現(xiàn)與處理前樣品相比，PMA處理降低了底泥微生物的DNA產(chǎn)量，且底泥中活性微生物數(shù)量與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法得到的結果存在很大差異；底泥質(zhì)地的復雜性可能對微生物DNA或PMA分子產(chǎn)生吸附作用，從而影響DNA與PMA的結合，導致結果出現(xiàn)假陽性；而發(fā)酵底泥暗黑色的表面也可能會阻礙可見光的透射性，進而使DNA與PMA無法發(fā)生有效的交聯(lián)反應。因此，應用PMA染料法篩選區(qū)分環(huán)境底泥中活性微生物群具有可行性，但現(xiàn)有實驗方法還需進一步優(yōu)化改進。

3 PMA在土壤研究中的應用

微生物在陸地生物地球化學循環(huán)和維持土壤肥力方面扮演著重要角色[35]。土壤微生物總DNA中除活性微生物DNA外，還包括大量relic DNA[36]，它們能夠與土壤礦物質(zhì)和腐殖質(zhì)結合并可長期存留于土壤中[8,37]。Carini等[38]首次利用PMA對采自美國地區(qū)大尺度下不同生態(tài)類型的31份土壤樣品進行活性微生物的研究，他們對去除relic DNA的土壤樣品提取微生物DNA，以細菌16S rRNA和真菌ITS基因為靶標，進行熒光定量PCR測定和高通量測序，結果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)PMA處理的土壤相比，去除relic DNA后的土壤微生物豐度平均降低達40%，微生物群落多樣性降低最高達到55%，表明土壤中relic DNA的存在明顯干擾了樣品處理對微生物群落結構影響的解讀，以及空間尺度上微生物群落分布與環(huán)境條件之間關系的建立。需要說明的是，盡管該研究發(fā)現(xiàn)，relic DNA對微生物物種相對豐度影響的偏差最高能達到25%，但該研究也顯示絕大多數(shù)土壤優(yōu)勢微生物物種在去除relic DNA后仍然可被檢測到，并且不同的土壤類型對微生物群落的影響要明顯大于relic DNA的影響，表明relic DNA的存在對土壤微生物的群落組成并未產(chǎn)生實質(zhì)性的改變。Heise等[39]將PMA應用于土壤活性產(chǎn)甲烷古菌的研究中，發(fā)現(xiàn)PMA篩選活性產(chǎn)甲烷古菌的有效性與土壤質(zhì)地緊密相關，黏土和粉土中的relic DNA不能被PMA有效地去除，而PMA可以成功地抑制砂土中relic DNA擴增。Gustave等[40]針對裝配有微生物燃料電池的稻田土壤，經(jīng)PMA處理后發(fā)現(xiàn)，盡管微生物燃料電池運行過程中增加了土壤中relic DNA的含量，且影響了一些物種(如Geobacter和CandidatusMethanoperedens)的相對豐度，但relic DNA對活性微生物的群落組成和結構并沒有產(chǎn)生顯著影響，這可能是由于土壤中微生物活性細胞和非活性殘體的周轉速率始終保持著動態(tài)平衡。盡管PMA在篩選土壤活性微生物群及評估relic DNA殘留對土壤微生物群落結構的影響程度方面已有一定報道，但PMA對不同類型土壤和微生物類群的適用性及其最佳實驗條件仍需大量數(shù)據(jù)的積累。例如，某些微生物細胞死亡后可能仍保持有完整的細胞膜，而濃度尚不充足的PMA或許無法有效地穿透這些完整的細胞[41]。因此，PMA在復雜土壤樣品的應用中仍存在許多問題亟待解決。

4 PMA在水體研究中的應用

相比底泥和土壤樣品，水體中的relic DNA可能會更快速地被脫氧核糖核酸酶降解，因而其含量相對較少，如Dell′Anno和Danovaro[42]報道過水體中relic DNA的降解比其相應的底泥中的所需時間少7～100倍之多。目前，針對水體樣品，PMA染料法大多應用于選擇性檢測飲用水等水體中活性病原菌的研究。仝鐵錚等[43]以大腸桿菌(Escherichiacoli)作為模式菌，應用PMA-qPCR技術研究了氯和一氯胺消毒對飲用水中病原菌的滅活效果，結果表明，PMA能夠鈍化99.94%和99.99%的分別來自非活性大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella)的DNA，說明PMA-qPCR技術可有效區(qū)分活性菌與非活性菌，并有助于更準確地評價氯和一氯胺消毒對飲用水病原菌的滅菌效果。Singh等[44]采用PMA-qPCR技術對印度北部昌迪加爾市的飲用水及其源頭水中活性沙門氏菌進行檢測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)飲用水及其源頭水中活性沙門氏菌含量分別為2～7 160 CFU·100 mL-1和2.1×104～2.6×106CFU·100 mL-1，而凈化處理后的飲用水中未檢出活性沙門氏菌，表明該技術能夠有效地用于城市飲用水污染的監(jiān)管。Yuan等[45]采集了美國密蘇里地區(qū)城市管道飲用水和多處河流水樣品，并對這些水樣接種動物糞便大腸桿菌，研究發(fā)現(xiàn)添加5 μmol的PMA并曝光處理10 min，即可抑制1×105CFU·mL-1大腸桿菌死細胞DNA的擴增。該研究還顯示，PMA的添加濃度和曝光時間根據(jù)采樣季節(jié)的不同而有所差異，表明需確定合適的PMA前處理方法才能較為準確地量化水樣中的活性病原菌，從而有效地評估水樣質(zhì)量。

5 PMA在其他環(huán)境樣品研究中的應用

除底泥、土壤和水體等常見環(huán)境樣品外，PMA染料法在篩選區(qū)分其他環(huán)境樣品活性微生物的應用僅有少量報道。Vaishampayan等[46]采用PMA結合高通量測序技術對國際空間站宇航員居住艙內(nèi)的活性微生物進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)，太空艙內(nèi)總微生物和活性微生物的群落組成差異很大，這可能是由于艙內(nèi)屬極度潔凈區(qū)域，僅有的微生物大多屬于稀有物種，而PMA會完全結合某些稀有物種的全部DNA(它們可能只以relic DNA形式存在)，如加入PMA后，無法再檢測到一些具有抗性生理特性的細菌。Seidel等[47]等利用PMA對人和多種動物糞便中活性擬桿菌(Bacteroides)進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)添加0.5%的二甲基亞砜(DMSO)能夠顯著增強PMA對擬桿菌死細胞PCR擴增信號的抑制效果；同時，增加目的片段的擴增長度，可提高PMA去除擬桿菌死細胞DNA的效率。由此可見，除PMA添加濃度、暗培養(yǎng)和曝光時間等應用條件需進一步優(yōu)化外，還應對后續(xù)的定量PCR和高通量測序等結合技術進行相應調(diào)整和改進，以期進一步提高PMA篩選區(qū)分環(huán)境樣品活性微生物的有效性和準確性。

6 存在的問題及展望

PMA染料法用于環(huán)境活性微生物的篩選研究尚處于起步階段，由于環(huán)境樣品的復雜性，該方法的廣泛應用仍受到很多限制，還需大量研究加以改進和完善：

(1)針對不同類型的環(huán)境樣品，需首先確定最佳的PMA添加濃度、暗培養(yǎng)和曝光時間。在暗培養(yǎng)和曝光過程中，需輕微震蕩離心管以避免局部染料過多破壞細胞的活性，同時使PMA與relic DNA充分結合并產(chǎn)生共價交聯(lián)，以及多余的PMA與溶液中水分子發(fā)生結合形成羥胺，避免影響后續(xù)活菌裂解及其DNA的擴增反應。也可通過多循環(huán)PMA處理加以改進，即樣品添加PMA后曝光之后再次添加PMA并曝光。

(2)可見光類型和光照強度也是影響PMA處理效果的因素之一。目前絕大多數(shù)基于PMA染料法的研究，在其曝光步驟中，都是采用500～650 W鹵素燈對樣品進行照射10～20 min，同時將樣品放置距離鹵素燈15～20 cm左右的冰面上，以避免溫度過高對活性微生物造成損傷。然而，鹵素燈可變的光強度和未知的光譜特性，可能會造成實驗結果難以解釋或產(chǎn)生偏差，加之鹵素燈的溫度非常高，當樣品受熱不均時可能會造成完整細胞膜的破損或是塑料管子的熔化，存在一定實驗風險。目前可應用專業(yè)的PMA LED光解儀來代替鹵素燈，其自動的冷卻循環(huán)系統(tǒng)和適當?shù)腜MA光解波長有助于提高實驗的準確性。

(3)環(huán)境樣品的濁度、pH和鹽分含量等也會影響PMA篩選活性微生物的有效性。如土壤樣品，可通過稀釋土樣使土壤顆粒充分分散于緩沖液中，從而提高PMA與relic DNA的結合效率。與此同時，稀釋后的土壤懸液可能存在微生物濃度較低、定量不準確等問題，或可采用數(shù)字PCR對樣品中微生物的絕對豐度進行準確定量。

(4)適當增加目的基因的片段擴增長度和PCR循環(huán)次數(shù)也可提高PMA去除環(huán)境樣品中relic DNA的準確性。擴增較長的目的基因片段有助于減少實驗中relic DNA的假陽性結果。此外，也可采用兩步擴增的巢式PCR法，以達到準確檢測活性微生物數(shù)量的目的。

(5)添加適當?shù)腜MA促進劑也可提高其處理效果，如脫氧膽酸鹽可促進PMA對革蘭氏陰性死細菌的結合效率，同時不會對活性細胞產(chǎn)生影響[48]。二甲基亞砜(DMSO)和乙二胺四乙酸(EDTA)可增強PMA對細胞膜的穿透性[49]。盡管如此，這些促進劑的使用需在保證不損傷活性細胞的前提下進行。

(6)盡管PMA染料法的廣泛應用尚存在一些問題，但它具有快速、準確、靈敏度高和低成本等優(yōu)點，不僅能增強人們對復雜環(huán)境樣品中活性微生物類群的認識，還可與高通量測序等多組學技術相結合，在環(huán)境微生物的種質(zhì)資源挖掘與功能開發(fā)利用等方面具有較大的應用前景。