盧 軒，孫業(yè)青，程子芪，馮寶民

矮紫杉中紫杉烷類成分及其抗腫瘤活性研究

盧 軒，孫業(yè)青，程子芪，馮寶民*

大連大學生命科學與生物技術學院，遼寧 大連 116622

研究矮紫杉cv. Nana中紫杉烷類化合物成分及其抗腫瘤活性，以期發(fā)現(xiàn)紅豆杉資源的替代品種。采用高通量測序技術進行轉(zhuǎn)錄組測序，并采用分子對接的方式初步預測矮紫杉具有產(chǎn)生紫杉烷類化合物的能力。采用硅膠、Sephadex LH-20和HPLC等色譜方法進行分離純化，并根據(jù)理化性質(zhì)及波譜學數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構。采用噻唑藍（MTT）法、流式細胞術、Western blotting等方式，以肺癌NCI-H1299細胞、乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR、胃癌AGS細胞以及肝癌HepG 2細胞為模型，對所分離鑒定的部分化合物進行體外抗腫瘤活性評價。從分子層面上驗證矮紫杉具有代謝產(chǎn)生紫杉烷類化合物的能力，在此基礎上從矮紫杉中分離得到6個紫杉烷類化合物，分別鑒定為紫杉醇（taxol，1）、三尖杉寧堿（cephalomannine，2）、巴卡亭III（baccatin III，3）、2-去乙酰氧基紫杉寧J（2-deacetoxytaxinine J，4）、2-去乙酰氧基-13-去乙酰去桂皮酰-紫杉寧J（2-deacetyloxy-13-deacetyldecinnamyl-taxinine J，5）、2-去乙酰氧-5α-羥基紫杉寧J（2-deacetoxy-5α-hydroxytaxinine J，6）。化合物1～3對目標細胞株均具有良好的抗腫瘤活性。栽培品種矮紫杉具有代謝產(chǎn)生紫杉烷類化合物的能力，可以在一定程度上作為紅豆杉替代資源使用。

矮紫杉；紫杉醇；三尖杉寧堿；巴卡亭III；2-去乙酰氧基紫杉寧J；2-去乙酰氧基-13-去乙酰去桂皮酰-紫杉寧J；2-去乙酰氧-5α-羥基紫杉寧J；資源替代；分子模擬；抗腫瘤活性

紫杉烷類化合物是一類廣譜、高效、不良反應較小的天然抗腫瘤藥物，是治療晚期卵巢癌、晚期乳腺癌、非小細胞癌、肺癌、食道癌等疾病的重要藥物[1]。紫杉烷類化合物的結(jié)構特點就是骨架類型多，取代基多而且?guī)缀醵际呛豕δ芑鶊F，紫杉烷類化合物為二萜類化合物，按其骨架可分為9大類，包括五元環(huán)、六元環(huán)、七元環(huán)、八元環(huán)、十元環(huán)和十二元環(huán)等[2]。其主要植物來源為紅豆杉，目前世界上共有天然野生紅豆杉屬植物11種，大部分分布在在溫帶地區(qū)以及熱帶地區(qū)，還有少數(shù)一部分分布在北美洲。天然紅豆杉生長周期長、生長條件要求苛刻，在我國被列為稀有和瀕危植物資源，且紫杉醇及其衍生物的含量低，無法滿足臨床需求[3]。因此尋找替代資源仍為一個研究熱點。矮紫杉cv. Nana為東北紅豆杉的變種，具有株形矮、分枝多、生長快等特點[4]，可大量栽培，對于矮紫杉化學成分的研究目前較少，根據(jù)化學成分種屬同源理論，推測矮紫杉可能作為紅豆杉替代資源使用。

紫杉二烯合酶作為紫杉烷類化合物生物合成的第一個關鍵酶，它的主要功能為催化牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸（GGPP）環(huán)化生成紫杉烯[taxa-4(5),11(12)-diene]，此步反應的目的是生成紫杉醇化合物的獨特骨架結(jié)構，因此紫杉二烯合酶為目前用于判斷前體復合物能否合成紫杉醇的關鍵酶[5]。在植物體內(nèi)，如果含有紫杉二烯合酶那么就可以表明植物中具有紫杉醇生物合成途徑基因的同源基因，這是一個強有力的基因證據(jù)[6]。因此本實驗首先對矮紫杉中紫杉二烯合酶基因進行研究，在此基礎上進行模擬分子對接，初步判斷矮紫杉是否具有代謝產(chǎn)生紫杉烷類化合物的能力。進而采用經(jīng)典色譜方法從矮紫杉95%乙醇提取物中分離得到6個紫杉烷類化合物，分別鑒定為紫杉醇（taxol，1）、三尖杉寧堿（cephalomannine，2）、巴卡亭III（baccatin III，3）、2-去乙酰氧基紫杉寧J（2-deacetoxytaxinine J，4）、2-去乙酰氧基-13-去乙酰去桂皮酰-紫杉寧J（2-deacetyloxy-13- deacetyldecinnamyl-taxinine J，5）、2-去乙酰氧-5α-羥基紫杉寧J（2-deacetoxy-5α- hydroxytaxinine J，6）。由于三尖杉寧堿和巴卡亭III與紫杉醇具有相同的母核結(jié)構，且具有構成活性的關鍵基團之一的四元環(huán)，因此選取三尖杉寧堿和巴卡亭III這2個化合物與紫杉醇做對照進行抗腫瘤活性研究。以肺癌NCI-H1299細胞、乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR、胃癌AGS細胞以及細胞HepG2肝癌為模型，通過MTT法檢測對不同人源性腫瘤細胞增殖的抑制作用，采用流式細胞術檢測對不同人源性腫瘤細胞凋亡的促進作用，通過Western blotting檢測凋亡相關標志物的表達水平觀測對腫瘤細胞Cleaved-caspase 3表達的影響。

1 儀器與材料

LC-20AR 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Bruker 500 HMz核磁共振儀（德國Bruker公司）；IKA RV8/BH 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA集團）；VARIOSKAN FLASH型多功能全波長酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工公司）；GF254/H薄層色譜硅膠（青島海洋化工公司）；Sephadex LH-20凝膠（GE Healthcare公司）。

樣品采自大連大學校內(nèi)，經(jīng)《中國植物志》比對鑒定為矮紫杉cv. Nana。對照品紫杉醇購自Solarbio公司，質(zhì)量分數(shù)大于98%，實驗用肺癌NCI-H1299細胞、乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR、胃癌AGS細胞以及肝癌HepG2細胞，購于中國科學院上海細胞庫，MTT試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司），所用試劑為分析純和色譜純。

2 基因測序與分子模擬

利用高通量測序技術對紅豆杉屬的近緣屬中的代表植物東北紅豆杉、大連大學校園內(nèi)矮紫杉進行轉(zhuǎn)錄組測序，得到其中紫杉二烯合酶[taxa- 4(5),11(12)-diene synthease，TS]基因的同源基因。隨后將測序2組TS通過DNAman翻譯為氨基酸序列，加上一組文獻報道的序列[7]共3組，經(jīng)序列對比共有5個不同氨基酸。在此基礎上進行同源模建和初步分子對接，通過疊合建模蛋白A、B、C和模板蛋白的結(jié)構，根據(jù)模板蛋白的結(jié)合位點確定了蛋白A、B、C潛在結(jié)合位點，根據(jù)已知條件可設置Grid Box坐標以及盒子大小，并采用Autodock vina.1.1.2進行分子對接。將exhaustiveness參數(shù)調(diào)整為20，其目的為增加計算的準確性。無特別注明情況，其他參數(shù)均設置為默認值。最后，選取結(jié)合能打分最高的構象用Free Meastro 11.9進行結(jié)作圖分析。結(jié)果見表1和圖1。結(jié)果表明，矮紫杉中紫杉二烯合酶序列與東北紅豆杉略有差異，但是不影響其與底物GGPP結(jié)合的能力，據(jù)此推測矮紫杉具有代謝產(chǎn)生紫杉烷類化合物的能力。

表1 蛋白A～C與GGPP結(jié)合能

圖1 蛋白A、B、C與小分子結(jié)合的疊合

3 提取與分離

矮紫杉枝葉干燥粉碎（1.8 kg），95%乙醇超聲提取3次，每次30 min，得乙醇提取物（150.8 g）。依次使用等體積石油醚、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層萃取液減壓濃縮得浸膏（45.2 g）。

二氯甲烷層浸膏（45.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜（200～300目）分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0→100∶100）梯度洗脫，得到203個流分。根據(jù)薄層色譜結(jié)果，將各流分合并為17個子流分（Fr. G1～G17），結(jié)合高效液相色譜分析結(jié)果，其中Fr. G6、G7含紫杉烷類化合物最多。

進一步采用Sephadex LH-20凝膠色譜（甲醇）對G6、G7進行分離得146個流分（Fr. N1～N146），其中N7、N12、N15含有紫杉烷類化合物最多。采用制備型高效液相色譜對N7、N12、N15進行分離純化，檢測波長227、274 nm，進樣量為200 μL，體積流量4.0 mL/min，采用LC-20AR檢測器，Ultimate XB-C18色譜柱，N7在乙腈-水（45∶55）的條件下經(jīng)分離純化得化合物1（15 mg）、2（26 mg）、3（21 mg），N12在乙腈-水（45∶55）的條件下經(jīng)分離純化得化合物4（8 mg），N15在乙腈-水（45∶55）的條件下經(jīng)分離純化得化合物5（18 mg）、6（14 mg）。

4 結(jié)構鑒定

化合物1：白色針型晶體（甲醇），紫外254 nm處有明顯暗色斑點。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 1.15 (3H, s), 1.24 (3H, s), 1.69 (3H,s), 1.79 (3H, s) 是4個甲基信號為紫杉烷類化合物特征峰；2.24 (s, 3H), 2.39 (3H,s) 是2個乙酰基信號；1.88 (1H, m, 6β-H), 2.36 (2H, m, H2-14), 2.55 (1H, m, H-6α), 3.80 (1H, d,= 6.5 Hz, H-3), 4.20 (1H, d,= 8.2 Hz, H-20a), 4.31 (1H, d,= 8.3 Hz, H-20b), 4.40 (1H, dd,= 8.7, 7.8 Hz, H-7), 4.79 (1H, s, H-2′), 4.95 (1H, d,= 9.0 Hz, H-5), 5.67 (1H, d,= 6.6 Hz, H-2), 5.79 (1H, d,= 8.6 Hz, H-3′), 6.23 (1H, t,= 8.7 Hz, H-13), 6.27 (1H, s, H-10), 6.99 (1H, d,= 8.6 Hz, NH), 7.61 (2H, d,= 6.9 Hz, Ar-H-23), 7.74 (2H, d,= 7.2 Hz, Ar-H-24), 8.13 (2H, d,= 7.4 Hz, Ar-H-25)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 172.7 (C-1′), 73.2 (C-2′), 55.0 (C-3′), 167.0 (C-5′), 79.0 (C-1), 74.9 (C-2), 45.6 (C-3), 81.2 (C-4), 84.4 (C-5), 35.7 (C-6), 72.2 (C-7), 58.6 (C-8), 203.6 (C-9), 75.60 (C-10), 133.2 (C-11), 142.0 (C-12), 72.4 (C-13), 35.6 (C-14), 43.2 (C-15), 21.8 (C-16), 26.9 (C-17), 14.8 (C-18), 9.6 (C-19), 76.5 (C-20), 167.1 (C-21), 129.1 (C-22), 130.2 (C-23, 27), 128.7 (C-24, 26), 133.6 (C-25), 170.4 (C-28), 22.6 (C-29), 171.3 (C-30), 20.9 (C-31), 133.6 (C-32), 127.1 (C-33, 37), 128.8 (C-34, 36), 128.4 (C-35), 138.0 (C-38)。203.64是C-9位游離羧基的特征信號，170.4和171.3是乙酰基的碳信號，22.6和20.9是2個乙酰基上的甲基信號，21.8和26.9是2個角甲基信號，再與文獻報道的紫杉醇[8]對照，兩者基本相同，故確定化合物1為紫杉醇。

化合物2：白色針狀晶體（甲醇），紫外254 nm處有明顯暗紫色斑點。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 1.15 (3H, s), 1.26 (3H, s), 1.68 (3H, s), 1.80 (3H, s) 是紫杉烷類化合物特征性的4個甲基信號，2.25 (3H, s), 2.36 (3H, s) 這2個信號表示為乙?；儆诨衔?比較時發(fā)現(xiàn)再苯環(huán)少了一個氫信號，同時又增加2個裂分的甲基信號：1.73 (3H, d,= 6.1 Hz, CH3-4′′), 1.76 (3H, m, CH3-2′′), 1.88 (1H, m, H-6β), 2.24 (1H, m, H-14β), 2.34 (1H, m, H-14α), 2.55 (1H, m, H-6α), 3.79 (1H, d,= 6.5 Hz, H-3), 4.19, 4.30 (each 1H, d,= 8.4/8.2 Hz, 20-H2), 4.40 (1H, dd,= 13.2, 7.8 Hz, H-7), 4.71 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 4.94 (1H, d,= 9.2 Hz, H-5), 5.62 (1H, d,= 8.6 Hz, H-3′), 5.67 (1H, d,= 6.2 Hz, H-2), 6.21 (1H, t,= 8.7 Hz, H-13), 6.28 (1H, s, H-10), 6.44 (1H, d,= 6.9 Hz, H-3′′), 6.50 (1H, d,= 8.8 Hz, NH), 7.34 (1H, m, Ar-H), 7.41 (4H, d,= 2.9 Hz, Ar-H), 7.51 (2H, t,= 7.4 Hz, Ar-H), 7.62 (1H, t,= 6.6 Hz, Ar-H), 8.13 (2H, d,= 7.0 Hz, Ar-H)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 79.1 (C-1), 74.9 (C-2), 45.6 (C-3), 81.1 (C-4), 84.4 (C-5), 35.6 (C-6), 72.2 (C-7), 58.6 (C-8), 203.6 (C-9), 75.5 (C-10), 133.1 (C-11), 142.1 (C-12), 72.3 (C-13), 35.6 (C-14), 43.2 (C-15), 21.8 (C-16), 26.9 (C-17), 14.8 (C-18), 9.6 (C-19), 76.5 (C-20), 171.2 (C-21), 170.3 (C-22), 22.6 (C-23), 20.9 (C-24), 167.0 (C-25), 172.8 (C-1′), 73.4 (C-2′), 54.9 (C-3′), 12.5 (6′-CH3), 169.0 (C-5′), 138.1 (C-6′), 131.9 (C-7′), 14.0 (C-8′)。將以上數(shù)據(jù)與文獻報道[9]對照，二者基本一致，故確定化合物2為三尖杉寧堿。

化合物3：白色針狀結(jié)晶（甲醇），紫外254 nm處有明顯暗斑，5%硫酸乙醇溶液顯藍紫色1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 8.16 (2H, d,= 7.5 Hz, Ph-H), 7.61 (1H, t,= 7.4 Hz, Ph-H), 7.51 (2H, t,= 7.3 Hz, Ph-H), 6.14 (1H, d,= 10.3 Hz, H-10), 5.56～5.48 (1H, m, H-7), 5.40 (1H, s, H-2), 5.36 (1H, s, H-5), 5.31 (1H, s, H-13), 5.13 (1H, d,= 12.4 Hz, H-7), 4.68 (1H, s), 3.70 (1H, d,= 11.1 Hz, H-20a), 3.63 (1H, d,= 7.5 Hz, H-20b), 2.99 (1H, dd,= 18.5, 13.0 Hz, H-3), 2.74 (1H, d,= 19.5 Hz, H-6a), 2.48 (1H, d,= 12.6 Hz, H-6b), 2.14 (3H, s, CH3CO), 2.11 (3H, s, CH3CO), 2.02 (6H, s), 1.29 (3H, s, CH3), 1.26 (3H, s, CH3)；13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 204.76 (C-9), 170.98 (10-OAc C=O), 170.13 (4-OAc C=O), 84.20 (C-5), 80.13 (C-4), 79.65 (C-1), 76.89 (C-20), 75.92 (C-10), 74.85 (C- 2), 71.93 (C-7), 68.12 (C-13), 58.82 (C-8), 45.09 (C-3), 42.02 (C-15), 38.13 (C-14), 35.10 (C-6), 26.14 (C-17), 22.23 (4-OAc Me), 20.45 (10-OAc Me), 19.08 (C-16), 15.89 (C-18), 9.23 (C-19)。將以上數(shù)據(jù)與文獻[10]進行對照，二者基本一致，故確定化合物3為巴卡亭III。

化合物4：白色粉末狀固體（甲醇）。1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 具有特征信號0.88 (3H, s, 19-CH3),1.10 (3H, s, 16-CH3),1.63 (3H, s, 17-CH3),2.34 (3H, s, 18-CH3) 為紫杉烷類化合物特征甲基信號，1.7, 1.98, 2.03, 2.08 (3H, s) 為4個特征乙酰氧基質(zhì)子信號。其1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 信號歸屬為: 1.00 (1H, m, H-14α), 1.80 (1H, m, H-2), 1.89 (1H, m, H-1), 0.88 (3H, s, H-18), 2.72 (1H, m, H-15β), 3.03 (1H, d,= 3.2 Hz, H-4), 5.04 (1H, brs, H-20), 5.41 (1H, brs, H-20), 5.59 (1H, m, H-6), 5.68 (1H, dd,= 11.4, 2.1 Hz, H-8), 5.84 (1H, dd,= 8.4, 7.0 Hz, H-12), 5.96 (1H, d,= 11.4 Hz, H-10), 6.28 (1H, d,= 11.5 Hz, H-11), 6.56 (1H, d,= 16.4 Hz, H-2′), 7.37 (1H, m, H-7′), 7.42 (1H, m, H-6′), 7.47 (1H, m, H-5′), 7.79 (1H, d,= 16.1 Hz, H-3′), 1.10 (3H, s, H-16), 1.63 (3H, s, H-17), 1.72 (3H, s, 13-OAc), 1.94 (2H, m, H-7), 1.99 (3H, s, 10-OAc), 2.05 (3H, s, 8-OAc), 2.08 (3H, s, 7-OAc), 2.34 (3H, s, H-18)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 50.7 (C-1), 31.9 (C-2), 40.2 (C-3), 39.4 (C-4), 135.0 (C-5), 137.2 (C-6), 70.7 (C-7), 15.3 (C-8), 74.9 (C-9), 71.7 (C-10), 20.9 (C-11), 37.5 (C-12), 21.4 (C-13), 31.2 (C-14), 146.2 (C-15), 34.6 (C-17), 70.1 (C-18), 13.2 (C-19), 116.1 (C-21), 116.25 (C-22), 118.3 (C-24), 145.9 (C-25), 138.1 (C-26, 28), 134.1 (C-27), 129.0 (C-29, 31), 130.7 (C-30), 170.4 (C-34), 21.0 (C-35), 170.9 (C-38), 20.0 (C-39), 27.2 (C-40), 170.0 (C-42), 27.2 (C-43), 169.4 (C-46), 27.2 (C-47)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[11]，故鑒定化合物4為2-去乙酰氧基紫杉寧J（2-deacetoxytaxinine J)。

化合物5：白色粉末狀固體（甲醇）。其1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 特征信號0.81 (3H, s, 19-CH3), 1.51 (3H, s, 16-CH3), 1.63 (3H, s, 17-CH3), 2.28 (3H, s, 18-CH3),: 1.97, 2.01, 2.05 (Each 3H, s) 為紫杉烷類化合物特征信號。其1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 信號歸屬為: 0.81 (3H, s, H-19) 0.90 (3H, s, H-17) 1.51 (3H, s H-16) 1.97, 2.01, 2.05 (Each 3H, s, OAc), 2.28 (3H, s, H-18) 2.93 (1H, m,= 15.3, 11.5, 8.6 Hz, H-14β) 3.23 (1H, d,= 5.4 Hz, H-2) 4.34 (2H m, H-5, et H-13) 4.80 (1H, s, H-20) 5.13 (1H, s, H-20) 5.62 (1H, dd,= 12.0, 5.0 Hz, H-7) 5.77 (1H, d,= 11.0 Hz, H-9) 6.18 (1H, d,= 11.0 Hz, H-10)13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 68.51 (C-1), 35.8 (C-2), 38.8 (C-3), 37.20 (C-4), 134.8 (C-5), 150.1 (C-6), 12.53 (C-7), 70.0 (C-9), 73.5 (C-10), 46.7 (C-11), 26.9 (C-12), 39.6 (C-13), 26.1 (C-14), 16.8 (C-15), 72.7 (C-16), 35.7 (C-17), 142.2 (C-18), 112.5 (C-19), 165.4 (C-20), 32.51 (C-23), 170.0 (C-26), 21.51 (C-27), 170.4 (C-30), 21.16 (C-31), 170.0 (C-34), 21.0 (C-35) 。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[12]一致，故鑒定化合物5為2-去乙酰氧基-13-去乙酰去桂皮酰-紫杉寧J。

化合物6：白色透明晶體（甲醇）。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 1.76 (1H, m, H-1), 1.74 (1H, m, H-2α), 1.92 (1H, m, H-2β), 3.22 (1H, d,= 5.2 Hz, H-3), 4.33 (1H, d,= 3.5 Hz, H-5), 1.68 (1H, m, H-6β), 5.70 (1H, dd,= 11.5, 5.7 Hz, H-7), 5.84 (1H, d,= 11.3 Hz, H-9), 6.31 (1H, d,= 11.4 Hz, H-10), 5.76 (1H, dd,= 10.6, 5.5 Hz, H-13), 1.14 (1H, dd,= 15.5 Hz, H-14α), 2.80 (1H, ddd,= 15.4, 11.3, 8.6 Hz, H-14β), 1.60 (3H, s, H-16), 1.00 (3H, s, H-17), 2.23 (3H, s, H-18), 0.81 (3H, s, H-19), 2.06 (3H, s, CH3CO), 2.07 (3H, s, CH3CO), 2.08 (3H, s, CH3CO), 4.87 (1H, d,= 1.5 Hz, H-20β), 5.21 (1H, d,= 1.3 Hz, H-20α),13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 信號歸屬為: 39.6 (C-1), 26.9 (C-2), 35.50 (C-3), 151.4 (C-4), 73.3 (C-5), 36.2 (C-6), 69.7 (C-7), 46.7 (C-8), 76.7 (C-9), 72.3 (C-10), 136.0 (C-11), 137.7 (C-12), 70.0 (C-13), 32.3 (C-14), 38.9 (C-15), 26.2 (C-16), 32.2 (C-17), 15.9 (C-18), 12.5 (C-19), 112.6 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[13]，鑒定化合物6為2-去乙酰氧-5α-羥基紫杉寧J。

5 體外抗腫瘤活性評價

紫杉醇是目前公認的天然抗腫瘤藥物，其具有廣譜的抗癌作用。由于三尖杉寧堿和巴卡亭III與紫杉醇具有相同的母核結(jié)構，且具有構成活性的關鍵基團之一的四元環(huán)。因此，本研究選取三尖杉寧堿和巴卡亭III這2個化合物與紫杉醇做對照進行抗腫瘤活性研究，所有活性測試中紫杉醇作為陽性藥。目前研究可知，紫杉烷類化合物具有較高抗腫瘤選擇性及對多種腫瘤細胞尤其是對有抗藥性的人體腫瘤細胞有較高生物活性，主要用于卵巢癌、乳腺癌的治療，并對食道癌、膀胱癌、淋巴癌、前列腺癌、惡性黑色素癌及胃腸道癌療效顯著。因此本研究選擇肺癌NCI-H1299細胞、乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR、胃癌AGS細胞以及肝癌HepG2細胞進行抗腫瘤活性研究。

5.1 對不同人源性腫瘤細胞增殖的抑制作用

采用MTT法[14]，測試化合物1～3在不同質(zhì)量濃度（0、1、10、100 μg/mL）下對NCI-H1299細胞、乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR、AGS細胞以及肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用。使用多功能酶標儀，測定在450 nm處的吸光度（）值，按照公式計算半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果見表2。實驗結(jié)果顯示化合物1～3對不同人源性腫瘤細胞均具有良好的選擇一致性。

表2 化合物1～3的IC50

5.2 對不同人源性腫瘤細胞凋亡的促進作用

采用Annexin-V FITC/PI雙染法通過流式細胞術[15]，測試化合物1～3在不同質(zhì)量濃度下（0、10、100 μg/mL）對NCI-H1299細胞、乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR以及HepG2細胞凋亡的抑制作用。觀察記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖2～4。在不同腫瘤細胞中，化合物均促進細胞凋亡，與對照組相比，凋亡率隨著濃度的增加而上升。

與對照組比較，*P＜0.05; **0.05＜P＜0.01; ***P＜0.01，下同

圖3 化合物1～3誘導MCF-7/ADR細胞凋亡

圖4 化合物1～3誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡

5.3 對腫瘤細胞Caspase-cleaved 3表達的影響

采用蛋白質(zhì)印記法（Western blotting）[16]，測試化合物1～3在不同質(zhì)量濃度下（0、10、100 μg/mL）對NCI-H1299細胞、乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR以及HepG2細胞凋亡相關蛋白的影響。結(jié)果見圖5～7。Caspase-cleaved3蛋白表達水平增高且與化合物干預劑量呈一定正相關性，提示化合物促腫瘤細胞凋亡。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計。

圖5 紫杉醇誘導腫瘤細胞凋亡

圖6 三尖杉寧堿誘導腫瘤細胞凋亡

圖7 巴卡亭III誘導腫瘤細胞凋亡

6 討論

本課題通過分析東北紅豆杉、大連大學校園內(nèi)矮紫杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)完成對這些植物中候選TS基因預測，采用同源模建及分子對接初步驗證目標蛋白與底物GGPP的結(jié)合能力，根據(jù)結(jié)合能打分可知，矮紫杉中的的紫杉二烯合酶與東北紅豆杉非常相似，其活性位點幾乎無差異，從分子層面上推測矮紫杉具有代謝產(chǎn)生紫杉烷類化合物的能力。而后首次從矮紫杉中分離得到6個紫杉烷類化合物，分別鑒定為紫杉醇（1）、三尖杉寧堿（2）、巴卡亭III（3）、2-去乙酰氧基紫杉寧J（4）、2-去乙酰氧基-13-去乙酰去桂皮酰-紫杉寧J（5）、2-去乙酰氧-5α-羥基紫杉寧J（6）。并對3種化合物1～3進行抗腫瘤作用研究。

誘導腫瘤細胞凋亡是癌癥治療的一個主要的策略，本課題采用不同質(zhì)量濃度紫杉醇類化合物1～3（0、10、100 g/mL）刺激NCI-H1299、AGS、HepG2、MCF-7/ADR細胞。通過MTT檢測分離提取到的化合物對腫瘤細胞毒性的影響，結(jié)果顯示紫杉烷類化合物抑制細胞增殖，對腫瘤細胞具有毒性作用。此外，采用流式細胞儀發(fā)現(xiàn)通過紫杉烷類化合物均能在不同程度上促進腫瘤細胞凋亡。通過Western blotting檢測凋亡相關標志物的表達水平觀測結(jié)果顯示，化合物能夠提高Cleaved-caspase3蛋白表達水平，且呈濃度依賴性。從而可以推測紫杉烷類化合物誘導細胞凋亡可能是通過Cleaved-caspase3信號通路實現(xiàn)的。本研究內(nèi)容對尋找紅豆杉替代資源提供理論支持，具有重要意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Taxanes incv. Nana and its anti-tumor activities

LU Xuan, SUN Ye-qing, CHENG Zi-qi, FENG Bao-min

College of Life Science and Biotechnology, Dalian University, Dalian 116622, China

To study the anti-tumor activity of taxanes isolated fromvar and its anti-tumor activities, with a view to discovering alternative varieties of.High-throughput sequencing technology is used for transcriptome sequencing, and molecular docking was used to preliminarily predict that thevar has the ability to produce taxanes. The chemical constituents were isolated from the total alkaloids of the twigs and leaves ofby using silica gel, Sephadex LH-20, and HPLC chromatographic methods Furthermore, the cytotoxicity of some compounds against NCI-H1299 (human lung cancer cell line), MCF-7/ADR (human breast cancer drug-resistant cell line)，AGS (human gastric cancer cell line), and HepG2（human liver cancer cell line）were tested by MTT, Flow Cytometry and Western blot methods.At the molecular level, it was verified that thevar has the ability to metabolize and produce taxanes, and on this basis. Six taxanes were isolated from thevar, and they were identified as taxol (1), cephalomannine (2), baccatin III (3), 2-deacetoxytaxinine J (4), 2-deacetyloxy-13-deacetyldecinnamyl-taxinine J （5）, and 2-deacetoxy-5α-hydroxytaxinine J (6).The cultivarhas the ability to metabolize and produce taxanes, which can be used as an alternative resource forto a certain extent.

cv. Nana; taxol; cephalomannine; baccatin III; 2-deacetoxytaxinine J; 2-deacetyloxy-13- deacetyldecinnamyltaxinine J; 2-deacetoxy-5α-hydroxytaxinine J; resource replacement; molecular simulation; anti-tumor activity

R284.1

A

0253 - 2670(2021)17 - 5210 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.012

2021-07-03

遼寧省“百千萬人才工程”擇優(yōu)資助項目

盧 軒（1984—），男，山東青島人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事天然活性物質(zhì)的研究工作。Tel: 18042615621 E-mail: luxuan_232@163.com

馮寶民（1975—），男，吉林集安人，沈陽藥科大學1997屆天然藥物化學專業(yè)碩博連讀校友，教授，博士，碩士研究生導師；2010年入選教育部新世紀人才；2011年入選“遼寧省百千萬人才工程”百層次人選；2015年當選遼寧省特聘教授；2015年獲第十屆遼寧省青年科技獎。E-mail: fbmdlu@163.com

[責任編輯 時圣明]