袁小紅 龐克堅(jiān) 唐輝 張虹 管輝 魏灃 唐萍

中圖分類號(hào) R282;R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）16-1949-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.16.06

摘 要 目的：為完善蒙藥烏日格斯圖-阿日查（刺柏葉）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。方法：以不同采集地的10批烏日格斯圖-阿日查藥材為樣品，對(duì)其進(jìn)行性狀觀察和顯微鑒別;采用薄層色譜法（TLC）對(duì)樣品中的異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A和扁柏雙黃酮進(jìn)行定性鑒別;參照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則中的相關(guān)方法測(cè)定樣品中總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物、重金屬的含量;建立高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定樣品中上述5種成分的含量。結(jié)果：烏日格斯圖-阿日查粉末呈綠色或黃綠色，管胞呈多角形，緊密排列成縱行;氣孔為不等式;表皮細(xì)胞為近長(zhǎng)方形;厚壁細(xì)胞呈類長(zhǎng)方形，壁連珠狀增厚。TLC結(jié)果顯示，供試品在與上述5種成分對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。10批樣品中總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量分別為7.37%～11.18%、0.75%～2.98%、16.55%～26.42%，平均值分別為8.51%、1.27%、22.35%;鉛、砷、鎘、汞、銅含量分別為2.00～5.44、0.65～1.65、0.044～0.100、0.034～0.160、4.59～6.79 mg/kg，平均值分別為3.73、0.97、0.078、0.061、5.23 mg/kg。異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為4.98～20.02、49.99～199.96、19.94～99.96、9.99～40.00、20.20～159.98 μg/mL（r均大于0.999 7）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)的RSD均小于3.00%（n=6）;平均加樣回收率為100.62%～102.96%，RSD為1.21%～1.88%（n=6）。10批樣品中上述5種成分的平均含量分別為0.089～0.379、1.379～4.250、1.077～2.026、0.162～0.423、0.016 9～0.117 0 mg/g。結(jié)論：本研究建立了蒙藥烏日格斯圖-阿日查藥材的定性、定量分析方法，暫規(guī)定其總灰分不得超過10.22%，酸不溶性灰分不得超過1.53%，醇溶性浸出物不得低于17.88%，重金屬鉛不得超過5 mg/kg，砷不得超過2 mg/kg，鎘不得超過0.3 mg/kg，汞不得超過0.2 mg/kg，銅不得超過20 mg/kg。

關(guān)鍵詞 蒙藥;烏日格斯圖-阿日查;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);薄層色譜法;高效液相色譜法;槲皮苷;穗花杉雙黃酮;竹柏雙黃酮A

Improvement of Quality Standard for Mongolian Medicine Juniperus rigida

YUAN Xiaohong1，PANG Kejian2，TANG Hui1，ZHANG Hong3，GUAN Hui1，WEI Feng1，TANG Ping1（1. School of Pharmacy/Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization， the Ministry of Education， Shihezi University， Xinjiang Shihezi 832000， China; 2. Hetian Uygur Pharmaceutical Co.， Ltd.， Xinjiang Hetian 848200， China; 3. Dept. of Pharmacy， Mongolian Medical Hospital of Bortala Mongolian Autonomous Prefecture， Xinjiang Bole 833400， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To provide scientific evidence for improving the quality standard of Mongolian medicine Juniperus rigida. METHODS： Totally 10 batches of J. rigida from different places were taken as samples to observe their characters and identify them by microscope; TLC method was adopted to qualitatively identify isoquercitrin， quercitrin， amentoflavone，? podocarpusflavone A and hinokiflavone; the contents of total ash， acid-insoluble ash， ethanol-soluble extract and heavy metals were determined by related method stated in 2020 edition of Chinese Pharmacopeia （part Ⅳ）. The contents of above 5 components in samples were determined by HPLC. RESULTS： The powder of J. rigida was green or yellowish green， polygonal tracheids， closely arranged in longitudinal with unequal stomatal; epidermal cells were nearly rectangular; sclerenchyma cells were quasi rectangular and the wall beadedly thickening. Results of TLC showed that the spots of the same color were found in the corresponding positions of chromatogram for test sample and substance control. The contents of total ash， acid-insoluble ash and ethanol-soluble extract in 10 batches of samples were 7.37%-11.18%， 0.75%-2.98%， 16.55%-26.42%， respectively; average contents were 8.51%， 1.27%， 22.35%. The contents of lead， arsenic， cadmium， mercury and copper were 2.00-5.44， 0.65-1.65， 0.044-0.100， 0.034-0.160， 4.59-6.79 mg/kg， respectively; average contents were 3.73， 0.97， 0.078， 0.061， 5.23 mg/kg. The linear ranges of isoquercitrin， quercitrin， amentoflavone， podocarpus- flavone? A and hinokiflavone were 4.98-20.02， 49.99-199.96， 19.94-99.96， 9.99-40.00， 20.20-159.98 μg/mL （all r>0.999 7）; RSDs of precision， repeatability and stability （24 h） tests were all less than 3.00% （n=6）; the average recoveries were 100.62%-102.96%，RSDs were 1.21%-1.88% （n=6）. Average contents of the above-mentioned 5 compounds in 10 batches of samples were 0.089-0.379， 1.379-4.250， 1.077-2.026， 0.162-0.423， 0.016 9-0.117 0 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： The qualitative and quantitative analysis methods of Mongolian medicine? ? ?J. rigida are established. It is preliminarily proposed that the total ash content shall not exceed 10.22%， the acid-insoluble ash content shall not exceed 1.53%， ethanol-soluble extract content shall not be less than 17.88%， heavy metal lead should not exceed 5 mg/kg， arsenic should not exceed 2 mg/kg， cadmium should not exceed 0.3 mg/kg， mercury should not exceed 0.2 mg/kg， copper should not exceed 20 mg/kg.

KEYWORDS? ?Mongolian medicine; Juniperus rigida; Quality standard; TLC;HPLC;Quercitrin;Amentoflavone; Podocarpusflavone A

烏日格斯圖-阿日查（刺柏葉）為柏科植物杜松Juniperus rigida Sieb. et Zucc.的干燥嫩枝葉，又名崩松、棒兒松，為蒙醫(yī)臨床常用藥材，分布于我國(guó)黑龍江、吉林、新疆、內(nèi)蒙古、甘肅及寧夏等省區(qū)，常生于比較干燥的地方，藥用資源豐富[1-2]。據(jù)蒙醫(yī)藥有關(guān)書籍記載，烏日格斯圖-阿日查具有清腎熱、利尿、燥“協(xié)日烏素”、愈傷止血等功效[3-4]。

烏日格斯圖-阿日查作為蒙醫(yī)中的臨床常用藥材，是經(jīng)典名方“五味甘露浴”“清腎熱十味散”“吉祥安神丸”的主要成分之一，在腎病或泌尿系統(tǒng)疾病、婦科疾病、瘟病等方面應(yīng)用比較廣泛[5]。烏日格斯圖-阿日查中含有黃酮類、萜類、木脂素類和香豆素類等化合物[6-9]。有研究表明，黃酮類成分具有很強(qiáng)的抗炎活性[10]，其中雙黃酮具有很強(qiáng)的抗炎、抗病毒活性[11]。有研究證實(shí)，烏日格斯圖-阿日查中的異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮等黃酮類成分的藥理作用與該藥清腎熱、燥“協(xié)日烏素”等藥效相一致[2，6，8，10-11]，所以很有必要基于上述5種成分建立烏日格斯圖-阿日查的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

烏日格斯圖-阿日查收載于1998年版的《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》中，但此標(biāo)準(zhǔn)僅收錄了該藥材的外觀性狀、性味和功能主治等，缺乏其他鑒別項(xiàng)，也沒有基于藥效的化學(xué)成分含量測(cè)定。目前，有關(guān)烏日格斯圖-阿日查活性成分的含量測(cè)定已有部分文獻(xiàn)報(bào)道：崔鴻江等[12]采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)烏日格斯圖-阿日查中主要活性成分之一的槲皮苷進(jìn)行了含量測(cè)定研究。但該方法僅對(duì)單一成分進(jìn)行了定量分析，難以全面評(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量。

為了更好地控制蒙藥烏日格斯圖-阿日查的質(zhì)量，本研究在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》基礎(chǔ)上，對(duì)藥材進(jìn)行了顯微鑒別，對(duì)其中異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮等5種成分進(jìn)行薄層色譜（TLC）定性鑒別，同時(shí)增加了總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物、重金屬等檢查項(xiàng)，并建立了上述5種成分含量測(cè)定的HPLC法，旨在為完善蒙藥烏日格斯圖-阿日查的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Primo Star型數(shù)碼生物顯微鏡購(gòu)自德國(guó)ZEISS公司;YOKO-ZS型TLC成像儀購(gòu)自武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司;e2695型HPLC儀[含2998型光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器]購(gòu)自美國(guó)Waters公司;KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;BT125D型十萬分之一分析天平購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司;iCAP 630型電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;ETHOS UP型微波消解儀購(gòu)自意大利Milestone公司;XGY-1011A型原子熒光光度計(jì)購(gòu)自廊坊開元高技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 主要藥品與試劑

異槲皮苷（批號(hào)P25J9F65872，純度≥98%）、槲皮苷（批號(hào)Z15J11S115885，純度≥98%）、穗花杉雙黃酮（批號(hào)Y24J7K16726，純度≥98%）、竹柏雙黃酮A（批號(hào)Y09J8C28349，純度≥98%）、扁柏雙黃酮（批號(hào)R11A9F54295，純度≥98%）對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;G型硅膠板（批號(hào)20191109，規(guī)格100 mm×50 mm）購(gòu)自青島海洋化工有限公司;甲苯、硝酸銀、甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲酸、甲醇均購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，均為分析純;乙腈購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，為色譜純;鉛、鎘、砷、汞、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

10批烏日格斯圖-阿日查藥材（編號(hào)S1～S10）由本課題組自行采集或購(gòu)買所得，經(jīng)石河子大學(xué)楚生輝教授鑒定均為柏科植物杜松J. rigida Sieb. et Zucc.的干燥嫩枝葉，其具體來源信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 分別取異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮對(duì)照品各適量，精密稱定，加入甲醇溶解、稀釋，混勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.402、0.856、0.608、0.292、0.808 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別取異槲皮苷對(duì)照品貯備液0.155 mL、槲皮苷對(duì)照品貯備液0.730 mL、穗花杉雙黃酮對(duì)照品貯備液0.493 mL，竹柏雙黃酮A對(duì)照品貯備液0.495 mL，扁柏雙黃酮對(duì)照品貯備液0.198 mL，置于同一5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，制成質(zhì)量濃度分別為12.46、124.98、59.95、28.91、31.99 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液 取樣品粉末（過30目篩）0.5 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流處理1 h，取出，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液 取甲醇20 mL，置于100 mL圓底燒瓶中，除不放入藥材樣品外，其余按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，濾過，即得陰性對(duì)照溶液。

2.2 性狀

烏日格斯圖-阿日查藥材，氣芳香，有三葉輪生或兩葉對(duì)生。其葉呈三棱針形，長(zhǎng)約0.3～1.4 cm，寬約1 mm，表面淡黃綠色，腹面有一條深槽，背面有一明顯的縱脊，先端尖銳，葉基有關(guān)節(jié)。其枝長(zhǎng)短不等，質(zhì)韌，易折斷，直徑1～2 mm，葉脫落痕跡明顯可見，外表呈淺棕色或褐色，且粗糙、有縱皺，斷面呈白色，詳見圖1。

2.3 顯微鑒別

2.3.1 粉末顯微鑒別 樣品粉末（過30目篩）為綠色或黃綠色。顯微鏡下，表皮細(xì)胞呈近長(zhǎng)方形;管胞呈多角形，壁木化，緊密排列成縱行，內(nèi)可見細(xì)長(zhǎng)螺紋管胞;厚壁細(xì)胞為類長(zhǎng)方形，鈍圓，紋孔多，壁呈連珠狀增厚;氣孔形狀特異，為不等式，副衛(wèi)細(xì)胞2個(gè)，詳見圖2。

2.3.2 莖橫切面顯微鑒別 樣品莖橫切呈正方形，對(duì)角處向內(nèi)凹陷，周皮多脫落。顯微鏡下，表皮部為單列細(xì)胞，排列緊密整齊，壁稍厚且呈木栓化;皮層寬廣，約占橫切面的1/2，凹陷處皮層極狹窄;韌皮部有數(shù)列細(xì)胞，較小，排列整齊，射線寬1～2列細(xì)胞;木質(zhì)部管胞呈方形，大小均勻，木薄壁細(xì)胞排列較寬，射線寬1～2列細(xì)胞;中央髓部狹小，略呈線型，詳見圖3。

2.3.3 葉橫切面顯微鑒別 顯微鏡下，上/下表皮均為1列橫向延長(zhǎng)的細(xì)胞，下表皮細(xì)胞稍圓，外被角質(zhì)層;柵欄細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，2～3列，與海綿組織分化不明顯;維管束為外韌型，導(dǎo)管木化;下表皮中部微向內(nèi)凹，緊接凹陷部分有一圓形大油室，周圍分泌細(xì)胞排列成環(huán)，詳見圖3。

2.3.4 TLC鑒別 按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0502 薄層色譜法”相關(guān)要求[13]進(jìn)行操作，分別吸取“2.1”項(xiàng)下5種成分的對(duì)照品貯備液各5 μL和供試品溶液10 μL，點(diǎn)于同一G型硅膠板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（100 ∶ 17 ∶ 13 ∶ 5，V/V/V/V）為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5.5 ∶ 4.5 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，展開至前沿線，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁試液，105 ℃加熱5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，10批供試品在與異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖4。

2.4 檢查

2.4.1 總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定 按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2302灰分測(cè)定法”相關(guān)要求[13]進(jìn)行操作，測(cè)定10批烏日格斯圖-阿日查藥材的總灰分、酸不溶性灰分，每批樣品平行測(cè)定3次。結(jié)果，10批樣品的總灰分含量為7.37%～11.18%，平均值為8.51%;酸不溶性灰分含量為0.75%～2.98%，平均值為1.27%，詳見表2。以平均值上浮約20%為標(biāo)準(zhǔn)[14-16]，暫定烏日格斯圖-阿日查藥材中總灰分不得超過10.22%，酸不溶性灰分不得超過1.53%。

2.4.2 浸出物含量測(cè)定 按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2201浸出物測(cè)定法”相關(guān)要求[13]進(jìn)行操作，以50%乙醇為溶劑，采用熱浸法進(jìn)行提取，測(cè)定10批烏日格斯圖-阿日查藥材中醇溶性浸出物的含量，每批樣品平行測(cè)定3次。結(jié)果，10批樣品的醇溶性浸出物含量為16.55%～26.42%，平均值為22.35%，詳見表2。以平均值下浮約20%為標(biāo)準(zhǔn)[14-16]，暫定烏日格斯圖-阿日查藥材中醇溶性浸出物不得低于17.88%。

2.4.3 重金屬元素測(cè)定 按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2321鉛、鎘、砷、汞、銅測(cè)定法”項(xiàng)下“原子吸收分光光度法”和“ICP-MS法”相關(guān)要求[13]進(jìn)行操作，測(cè)定10批烏日格斯圖-阿日查藥材中重金屬鉛、鎘、砷、汞、銅的含量。取樣品粉末（過30目篩）約0.25 g，精密稱定，置微波消解罐中，加適量硝酸，于200 ℃下加熱至樣品完全溶解后，加入過氧化氫2 mL預(yù)消解，再置于微波消解儀內(nèi)消解（消解程序見表3）。消解結(jié)束后，消解液用水稀釋并定容至25 mL，搖勻，即得供試品溶液。同法制備不含樣品的空白溶液。先用原子熒光光度計(jì)測(cè)定汞含量，隨后用ICP-MS儀測(cè)定其他元素含量，每批樣品平行測(cè)定3次。原子熒光分光光度計(jì)工作條件參數(shù)如下：負(fù)高壓為300 V，總電流為30 mA，載氣流速為400 mL/min，屏蔽氣流速為1 000 mL/min，原子化氣高度為10 mm，讀數(shù)時(shí)間為10 s，延遲時(shí)間為1 s。ICP-MS儀工作條件參數(shù)如下：射頻功率為1 300 W，等離子體流速為15 L/min，輔助氣流速為0.70 L/min，載氣流速為0.86 L/min，霧室溫度為2 ℃，采樣深度為10 mm，采樣錐孔直徑為1.0 mm，截取錐孔直徑為0.45 mm。本方法的方法學(xué)考察結(jié)果均符合2020年版《中國(guó)藥典》（四部）的相關(guān)要求[13]。

結(jié)果，10批樣品中鉛含量為2.00～5.44 mg/kg，平均值為3.73 mg/kg;砷含量為0.65～1.65 mg/kg，平均值為0.97 mg/kg;鎘含量為0.044～0.100 mg/kg，平均值為0.078 mg/kg;汞含量為0.034～0.160 mg/kg，平均值為0.061 mg/kg;銅含量為4.59～6.79 mg/kg，平均值為5.23 mg/kg，詳見表4。參考文獻(xiàn)[17-19]相關(guān)規(guī)定，暫定烏日格斯圖-阿日查藥材中鉛不得超過5 mg/kg，砷不得超過2 mg/kg，鎘不得超過0.3 mg/kg，汞不得超過0.2 mg/kg，銅不得超過20 mg/kg。

2.5 5種黃酮類成分的含量測(cè)定

按照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0521高效液相色譜法”相關(guān)要求[13]進(jìn)行操作。

2.5.1 色譜條件 以ACE C18 PFP（250 mm×4.6 mm，5? μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，15%A→20%A;5～15 min，20%A→25%A;15～20 min，25%A→40%A;20～30 min，40%A→65%A;30～40 min，65%A→80%A）;流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為337 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為5 μL。

2.5.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，理論板數(shù)按槲皮苷計(jì)均不低于20 000，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，各成分的測(cè)定不受其他成分的干擾，詳見圖5。

2.5.3 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品貯備液，用甲醇稀釋成異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為4.98、7.48、9.97、12.46、14.95、20.02 μg/mL，槲皮苷質(zhì)量濃度分別為49.99、74.99、99.98、124.98、149.97、199.96 μg/mL，穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度分別為19.94、29.91、40.01、59.95、80.01、99.96 μg/mL，竹柏雙黃酮A質(zhì)量濃度分別為9.99、15.01、19.97、25.00、30.02、40.00 μg/mL，扁柏雙黃酮質(zhì)量濃度分別為20.20、39.60、59.79、79.99、119.58、159.98 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以5種成分的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表5。

2.5.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 μL，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮峰面積的RSD分別為0.65%、0.81%、1.27%、1.39%、0.30%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱取同一批樣品粉末（過30目篩，編號(hào)S6）6份，每份0.5 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算含量。結(jié)果，樣品中異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮含量的RSD分別為1.08%、0.62%、0.60%、0.43%、0.96%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（編號(hào)S6），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，供試品溶液中異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮峰面積的RSD分別為2.62%、1.92%、2.22%、2.62%、1.92%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的樣品粉末（過30目篩，編號(hào)S6）適量，共6份，精密稱定并加入與相應(yīng)成分等質(zhì)量的對(duì)照品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮的平均加樣回收率為100.62%～102.96%，RSD為1.21%～1.88%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度良好，詳見表6。

2.5.8 樣品含量測(cè)定 取10批樣品各0.5 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算5種成分的含量，每批樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果，10批樣品中異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮的平均含量分別為0.089～0.379、1.379～4.250、1.077～2.026、0.162～0.423、0.016 9～0.117 0 mg/g，詳見表7。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

在供試品的提取中，筆者對(duì)提取溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇）、料液比（1 ∶ 40、1 ∶ 20、1 ∶ 10、1 ∶ 5，? ? ? g/mL）、提取時(shí)間（0.5、1、2、3 h）等進(jìn)行了篩選，綜合考慮所得色譜峰的峰面積、分離度、峰形及操作方法的簡(jiǎn)便性等因素，最終確定以甲醇為提取溶劑，以料液比1 ∶ 40（g/mL）、加熱回流時(shí)間1 h作為提取條件。

3.2 TLC展開劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)前期選用不同展開系統(tǒng)對(duì)不同產(chǎn)地烏日格斯圖-阿日查藥材進(jìn)行了TLC鑒別，其中一次展開劑乙酸乙酯-甲醇-水（100 ∶ 17 ∶ 13，V/V/V）和乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（100 ∶ 17 ∶ 13 ∶ 5，V/V/V/V）的分離結(jié)果顯示，在展開劑中加入甲酸后斑點(diǎn)拖尾情況有所改善，故一次展開劑選用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（100 ∶ 17 ∶ 13 ∶ 5，V/V/V/V）。隨后，筆者考察了一次展開劑的展開高度（2、2.5、3 cm），結(jié)果顯示，當(dāng)展開高度為3 cm時(shí)，各斑點(diǎn)能較好地分離，故選擇一次展開劑的展開高度為3 cm。最后，筆者考察了二次展開劑甲苯-甲酸乙酯-甲酸（4.5 ∶ 4.5 ∶ 1，V/V/V）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶ 5 ∶ 1，V/V/V）、甲苯-甲酸乙酯-甲酸（4.5 ∶ 5.5 ∶ 1，V/V/V）的展開效果，結(jié)果顯示，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（5.5 ∶ 4.5 ∶ 1，V/V/V）為二次展開劑時(shí)各斑點(diǎn)的分離效果較好，故以其為二次展開劑。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者采用PDA檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)合2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中各成分的出峰時(shí)間[20]，并在比較供試品溶液在337、328 nm波長(zhǎng)下的色譜圖數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，在337 nm波長(zhǎng)下，所得色譜圖的基線均平穩(wěn)，異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮均有較強(qiáng)吸收，故選擇337 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 流動(dòng)相的選擇

在選擇流動(dòng)相時(shí)，筆者以各色譜峰分離度、出峰時(shí)間、峰形為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液的分離效果。結(jié)果顯示，以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，柱壓較高，峰形較差;以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，峰形仍較差;以乙腈-0.1%甲酸溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，柱壓較低，各色譜峰分離良好且基線平穩(wěn)，故選用乙腈-0.1%甲酸溶液為梯度洗脫流動(dòng)相。

3.5 含量測(cè)定

本研究通過含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，10批樣品中異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮的平均含量分別為0.089～0.379、1.379～4.250、1.077～2.026、0.162～0.423、0.016 9～0.117 0 mg/g。其中，新疆伊犁哈薩克自治州不同產(chǎn)地烏日格斯圖-阿日查藥材（編號(hào)S8、S10）中異槲皮苷含量差異較大，雖然在同省區(qū)，但不同縣之間氣候溫度環(huán)境存在差異，故藥材成分含量還可能與其不同的生長(zhǎng)環(huán)境等因素有關(guān)。

綜上所述，本研究建立了蒙藥烏日格斯圖-阿日查藥材的定性、定量分析方法，暫規(guī)定其總灰分不得超過10.22%，酸不溶性灰分不得超過1.53%，醇溶性浸出物不得低于17.88%，重金屬鉛不得超過5 mg/kg，砷不得超過2 mg/kg，鎘不得超過0.3 mg/kg，汞不得超過0.2 mg/kg，銅不得超過20 mg/kg。由于不同產(chǎn)地的烏日格斯圖-阿日查中異槲皮苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、竹柏雙黃酮A、扁柏雙黃酮等5種黃酮類成分的含量差異較大，故本研究未作含量規(guī)定。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 柳白乙拉.蒙藥正典[M].北京：民族出版社，2006：113.

[ 2 ] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第7卷[M].北京：科學(xué)出版社，1978：379-380.

[ 3 ] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：蒙藥分冊(cè)[S].呼和浩特：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，1998：23，169.

[ 4 ] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：蒙藥卷[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004：255.

[ 5 ] 包音胡.探討蒙醫(yī)五味甘露藥浴的臨床應(yīng)用[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（12）：152，159.

[ 6 ] MASHIMA T，OKIGAWA M，KAWANO N. On the bisflavones in the leaves of Juniperus rigida Sieb. et Zucc.[J]. J Pharm Soc Jpn，1970，90（4）：512.

[ 7 ] 武雪，宋平順，趙建邦.兩個(gè)不同產(chǎn)區(qū)藏藥刺柏葉中揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].中國(guó)藥師，2015，18（5）：778- 781.

[ 8 ] JEONG E J，SEO H，YANG H，et al. Anti-inflammatory phenolics isolated from Juniperus rigida leaves and twigs in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophage cells[J]. J Enzyme Inhib Med Chem，2012，27（6）：875- 879.

[ 9 ] WOO K W，CHOI S U，PARK J C，et al. A new lignan glycoside from Juniperus rigida[J]. Arch Pharmacal Res，2011，34（12）：2043-2049.

[10] 葉勇，覃妮，庾茜，等.壯藥戰(zhàn)骨總黃酮提取物經(jīng)皮給藥對(duì)大鼠/小鼠的抗炎、鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國(guó)藥房，2018，29（15）：2090-2094.

[11] MENEZES J C J M D S，DIEDERICH M F. Bioactivity of natural biflavonoids in metabolism-related disease and cancer therapies[J]. Pharmacol Res，2021，167：105525.

[12] 崔鴻江，巴德瑪，林燕.蒙藥材刺柏葉中槲皮苷的含量測(cè)定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（2）：221-223.

[13] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：59，61，114，232，234-236，480-483.

[14] 劉利琴，彭瀟，馬雪，等.貴州產(chǎn)紅孩兒藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究[J].中國(guó)藥房，2020，31（12）：1458-1462.

[15] 陳華林，徐俊，蔡曉洋，等.藏藥奧色折布的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2020，31（21）：2609-2614.

[16] 吳依靜，喜杰，鐘國(guó)躍，等.蒙藥地梢瓜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2020，31（18）：2230-2234.

[17] 孔繁越.中藥材重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)和農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)研究及標(biāo)準(zhǔn)制定相關(guān)建議[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[18] 劉蘭，張勇倉，鐘鏵，等.原子吸收分光光度法測(cè)定藏藥二十五味珊瑚丸中5種重金屬含量[J].中國(guó)藥房，2018，29（7）：973-976.

[19] 對(duì)外貿(mào)易經(jīng)濟(jì)合作部.中華人民共和國(guó)外經(jīng)貿(mào)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[J].中藥研究與信息，2001，3（8）：9-10.

[20] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2020年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：225.

（收稿日期：2021-04-02 修回日期：2021-07-14）

（編輯：鄒麗娟）