胡壽榮，畢紅玉，高燕平，游媛，任琦，付輝政

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.南昌市第一醫(yī)院，江西 南昌 330008；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004

毛子草為紫葳科角蒿屬（Incarvillea L.）兩頭毛I(xiàn)ncarvillea arguta（Royle）Royle的干燥全草，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，在東北、華北、西北等地也有分布。為苗族、彝族、傈僳族、納西族、藏族、普米族等民族習(xí)用草藥。具有祛風(fēng)除濕、消炎止痛、活血散瘀之功效，臨床上廣泛用于治療肝炎、結(jié)石等病，療效顯著［1-3］。貴州苗族地區(qū)用于防治膽石癥有較好療效，故又稱其為“結(jié)石草”；彝族民間稱為“瓦布友”，又名“肝炎草”“兩頭毛”“馬桶花”“毛子草”等。其化學(xué)成分主要有單萜生物堿、大環(huán)精胺、環(huán)烯醚萜苷、生物堿、酰胺、黃酮、苯丙素類等成分，在促進(jìn)細(xì)胞分化、消炎、抗菌、抗氧化、治療膽結(jié)石等方面具有較好療效［4-8］。毛子草現(xiàn)收載于《貴州中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）［9］，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定有性狀，鑒別（葉表面觀、莖橫切面、理化、對(duì)照藥材薄層鑒別），檢查（水分、總灰分、酸不溶性灰分）。在檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其薄層主斑點(diǎn)存在拖尾現(xiàn)象，水分、總灰分、酸不溶性灰分限度設(shè)置不合理，尚缺含量測(cè)定項(xiàng)?；诖?，收集了不同采收時(shí)間的19批次樣品，對(duì)毛子草薄層鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、含量測(cè)定等質(zhì)控指標(biāo)開展了系統(tǒng)的研究，為毛子草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂和提高提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

戴安UL TIMA TE3000 系列高效液相色譜儀：由色譜工作站、柱溫箱、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器5 個(gè)部分組成；電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。電子天平使用的是賽多利斯BS110S 十萬(wàn)分之一電子天平；乙腈為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水；其他試劑均為分析純。

齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：110709-201808）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；車前醚苷（批號(hào)：5928，純度≥98%）購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

毛子草藥材19批為本課題組收集，由江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國(guó)躍教授鑒定為毛子草［Incarvillea arguta（Royle）Royle］，標(biāo)本存放在江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

取本品適量，粉碎，過四號(hào)篩，稱取約0.5 g，置三角燒瓶中，加入乙酸乙酯溶劑15 mL，超聲15 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状? mL 使其溶解，溶解液作為供試品溶液。另外稱取齊墩果酸對(duì)照品適量，加甲醇適量使溶解，制成每1 mL 含1 mg的對(duì)照品溶液。按照2020年版《中國(guó)藥典》四部的薄層色譜方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將供試品溶液1 μL，對(duì)照品溶液5 μL 點(diǎn)在同一塊硅膠G 薄層板上。展開劑采用氯仿∶甲醇∶甲酸（40∶1∶0.1），用10%硫酸乙醇溶液作為顯色劑，噴完顯色劑后，將薄層板放在105 ℃烘箱中加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，放在365 nm的紫外燈光下檢視，結(jié)果：在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的位置上，供試品出現(xiàn)與其相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖1。

圖1 毛子草薄層色譜鑒別圖

2.2 總灰分、酸不溶性灰分、水分和水溶性浸出物的分析

總灰分、酸不溶性灰分的檢測(cè)采用2020年版《中國(guó)藥典》四部灰分測(cè)定法；水分的檢測(cè)采用2020年版《中國(guó)藥典》四部的烘干法進(jìn)行測(cè)定；水溶性浸出物的檢測(cè)采用2020年版《中國(guó)藥典》四部的熱浸法測(cè)定［10］。19批毛子草藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的分析結(jié)果見表1。

表1 毛子草藥材中灰分、水分和浸出物的檢測(cè)結(jié)果（%）

2.3 車前醚苷的HPLC 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件色譜柱：CAPCELL PAK型C18 柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相:10%乙腈水溶液；流速：1.0 mL/min；測(cè)定波長(zhǎng)：244 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。采用上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，毛子草中成分車前醚苷與其他成分的色譜峰分離度良好。色譜圖如圖2 所示。

圖2 車前醚苷（A）和毛子草藥材（B）的HPLC圖

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取車前醚苷對(duì)照品10 mg，放入50 mL 容量瓶中，用70%甲醇溶液進(jìn)行溶解，得到每1 mL 含40 μg的車前醚苷對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備取毛子草藥材（批號(hào)：2016-09-27）適量，粉碎，過四號(hào)篩，取約0.5 g，精密稱定，置三角燒瓶中，精密加入50 mL70%甲醇溶液，密塞，稱定重量，放在水浴上熱回流30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液對(duì)減少的重量進(jìn)行補(bǔ)充，搖勻，過濾，用移液管精密吸取過濾液1 mL，置10 mL 量瓶中，加70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.3.4 線性關(guān)系的考察精密稱取車前醚苷對(duì)照品2.19 mg，置50 mL 量瓶中，加70%甲醇溶液進(jìn)行溶解，并加溶劑至刻度，搖勻，得車前醚苷的對(duì)照品溶液，分別吸取1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、12 μL，采用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以車前醚苷對(duì)照品進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，回歸方程為A=36.291 0X+0.166 7（r=0.999 9）。車前醚苷在0.043 8～0.525 9 μg之間顯示良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn)精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下的供試品溶液10 μL，采用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)測(cè)定樣品6 次，記錄樣品的峰面積。結(jié)果車前醚苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6）為0.2%，表明所使用的儀器精密度良好。

2.3.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)選取同一批次過4 號(hào)篩的毛子草粉末6 份，每份約0.5 g，精密稱定，采用“2.3.3”項(xiàng)下的方法制作供試品溶液，應(yīng)用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行樣品分析，車前醚苷的平均含量為18.349 5 mg/g，RSD 為1.6%，表明所建立的方法重現(xiàn)性較好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一份供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h 采集樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果采集得到樣品的車前醚苷峰面積的RSD（n=6）為0.4%，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 回收率試驗(yàn)取已知含量過4 號(hào)篩的毛子草藥材粉末6 份，每份約0.25 g，每份精密加入含車前醚苷（0.087 6 mg/mL）的對(duì)照品溶液50 mL，采用“2.3.3”項(xiàng)下的制備方法制作供試品溶液，應(yīng)用“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行樣品分析，計(jì)算樣品回收率。結(jié)果6 個(gè)樣品車前醚苷的平均回收率為98.7%，RSD 為1.0%。

2.3.9 耐用性試驗(yàn)取同一批次過4 號(hào)篩的毛子草藥材粉末約0.5 g，精密稱定，按“2.3.3”項(xiàng)下的制備方法制作供試品溶液，選用CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）三種不同品牌的色譜柱按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)試樣品，結(jié)果三種不同品牌的色譜柱測(cè)定的樣品沒有明顯差別。

2.3.10 樣品測(cè)定對(duì)收集的19批次不同時(shí)間采收的毛子草藥材進(jìn)行粉碎，過四號(hào)篩，每批次樣品平行取2 份，然后采用“2.3.3”項(xiàng)下的制備方法制作供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)試樣品，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算19批毛子草藥材中車前醚苷的含量，測(cè)試結(jié)果見表2。

表2 毛子草中車前醚苷的測(cè)定結(jié)果（%）

3 討論

3.1 TLC 鑒別

毛子草現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)薄層鑒別采用毛子草對(duì)照藥材進(jìn)行對(duì)照，斑點(diǎn)存在拖尾現(xiàn)象，而且目前毛子草無法定對(duì)照藥材，標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行比較困難，通過對(duì)照品比對(duì)，確定毛子草對(duì)照藥材薄層鑒別主斑點(diǎn)為齊墩果酸，通過比較不同比例的石油醚（60～90 ℃）∶環(huán)己烷∶醋酸乙酯∶冰醋酸（5∶4∶2.5∶0.1；6∶4∶2.0∶0.1）和氯仿∶甲醇∶甲酸（40∶1∶0.1；30∶1∶0.1）等不同展開劑，結(jié)果表明采用氯仿∶甲醇∶甲酸（40∶1∶0.1）作為齊墩果酸的展開劑，其斑點(diǎn)比較圓整清晰，且能完全分開。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取車前醚苷對(duì)照品溶液在400～200 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜測(cè)定，結(jié)果車前醚苷在244 nm 波長(zhǎng)顯示最大吸收峰，并且244 nm 處的其他峰對(duì)車前醚苷峰無干擾，故選擇244 nm 作為車前醚苷含量測(cè)定的測(cè)試波長(zhǎng)。

3.3 提取方法的選擇

分別對(duì)甲醇加熱回流提取，甲醇超聲提取2種提取法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明采用加熱回流的提取方法，其提取效率大于采用超聲提取的方法。對(duì)提取時(shí)間（30 min，60 min，90 min）和甲醇濃度（50%，70%，100%）也進(jìn)行了比較，結(jié)果車前醚苷在30 min 即可提取完全，70%甲醇濃度提取效率高于其他比例。

3.4 色譜條件的優(yōu)化

通過比較乙腈與水溶液，甲醇與水溶液作為流動(dòng)相，以分離度為指標(biāo)，結(jié)果以10%乙腈水溶液，柱溫在30 ℃的條件下，毛子草藥材中車前醚苷與其他色譜峰分離度良好。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法建立了毛子草藥材中車前醚苷的含量測(cè)定方法，并采用TLC 法建立了毛子草藥材專屬性鑒別，同時(shí)對(duì)總灰分、酸不溶性灰分、水分、浸出物等理化指標(biāo)進(jìn)行了考察和檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。