余春輝，劉紅英

1.豐城市中醫(yī)院，江西 豐城 331100；2.江西領(lǐng)行藥物研究所有限公司，江西 樟樹 331200

槐仙顆粒是由豐城市中醫(yī)院中醫(yī)師以《太平惠民和劑局方》中的“槐角丸”為基礎(chǔ)方加減而來(lái)，該制劑由槐角、地榆、防風(fēng)、當(dāng)歸、黃芩、麩炒枳殼、仙鶴草七味中藥制成。其功能主治為清腸疏風(fēng)，涼血止血，潤(rùn)腸通便；用于腸風(fēng)便血，痔瘡腫痛，肛門瘙癢，便秘脫肛、肛裂等癥［1］。為了建立槐仙顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究用高效液相色譜法對(duì)制劑中黃芩的含量進(jìn)行測(cè)定并建立標(biāo)準(zhǔn)限度，為制劑報(bào)批備案提供確實(shí)可行的技術(shù)依據(jù)。

處方中黃芩主含黃酮類化合物，包括有黃芩素，黃芩新素，黃芩苷，漢黃芩素，漢黃芩甙等［2-9］。實(shí)驗(yàn)選擇方中主藥黃芩中的黃芩苷作為定量指標(biāo)控制，以有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT 輸液泵，SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-20A 檢測(cè)器，CTO-20A 柱溫箱，DGU-20A5R脫氣機(jī)。

1.2 試藥

甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110715-200212）；槐仙顆粒由醫(yī)院制劑室提供，規(guī)格：15 g/袋，10批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱拓譜C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫35 ℃。進(jìn)樣10 μL；理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算均大于2 500。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：取60 ℃減壓干燥4 h的黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率150 W，頻率40 KHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取1 mL，至10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，即得。

陰性樣品溶液的制備：按處方取除黃芩的其他藥材，依制法制成陰性樣品，再依供試品溶液制備方法制成黃芩陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1；結(jié)果顯示：黃芩苷對(duì)照品和制劑中的其他組分均能達(dá)到基線分離。

圖1 黃芩苷對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液HPLC圖譜

2.4 空白試驗(yàn)

精密吸取10 μL 陰性樣品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果陰性樣品無(wú)干擾，方法具專屬性。

2.5 線性關(guān)系的考察

精密稱取黃芩苷對(duì)照品24.1 mg 置25 mL 量瓶中搖勻并稀釋至刻度，精密量取3 mL 至50 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，得57.84 μg/mL。再分別精密吸取5 μL、10 μL、12 μL、15 μL、20 μL，2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定分析，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，黃芩苷對(duì)照品的量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（黃芩苷對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖）,計(jì)算得回歸方程：Y=4 000 000X-18 033，R2=1。結(jié)果表明黃芩苷在0.289 2 μg～1.156 8 μg 范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液（57.84 μg/mL）10 μL 重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，各對(duì)照品溶液的峰面積積分值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.63%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取槐仙顆粒樣品（批號(hào)：20200701），依據(jù)“2.2”方法配置成供試品溶液，在室溫放置，分別于0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣測(cè)定，供試品溶液中黃芩苷在放置8 h 內(nèi)的峰面積基本一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%，表明所制備的供試品溶液中黃芩苷在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取槐仙顆粒樣品（批號(hào)：20200701）6 份，依據(jù)“2.2”方法配置成供試品溶液，測(cè)定黃芩苷的含量，結(jié)果樣品中黃芩苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%，表明此法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的槐仙顆粒樣品（批號(hào)：20200701），精密稱取樣品約10 g，各6 份，分別定量加入黃芩苷對(duì)照品，依2.2 方法制備供試品溶液，測(cè)定黃芩苷含量。計(jì)算加樣加收率，結(jié)果平均回收率為99.09%，RSD 為1.84%,表明加樣回收率良好，見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定

取槐仙顆粒不同批次的樣品10批，依“2.2”方法制備供試品溶液，測(cè)定黃芩苷含量，計(jì)算每克顆粒含黃芩苷的量，見(jiàn)表2。

表2 10批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)藥典》2015年版一部黃芩藥材中規(guī)定的黃芩苷含量限度［10］，以及本品黃芩苷的轉(zhuǎn)化率，暫將本品每克含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計(jì)，不得少于1.6 mg。

3 討論

（1）為了保證所測(cè)成分的靈敏度，實(shí)驗(yàn)還對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行了選擇，取黃芩苷對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果對(duì)照品在277.84 nm 處有一較大的吸收峰，結(jié)合《中國(guó)藥典》2015年版一部黃芩藥材中黃芩苷含量測(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，故選擇280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。（2）為了確保各組分的分離及出峰時(shí)間，實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了選擇比較，實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）和甲醇-乙腈-0.2%磷酸（35∶15∶50）進(jìn)行了比較，結(jié)果流動(dòng)相甲醇-乙腈-0.2%磷酸（35∶15∶50）黃芩苷對(duì)照品出峰時(shí)間過(guò)早，峰形較差。采用甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相，黃芩苷與其他組分分離完全，結(jié)果滿意。（3）為了確保成分的充分提取，實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑（70%乙醇及甲醇）、不同提取方法（70%乙醇超聲及70%乙醇回流）的樣品制備方法，最終確定70%乙醇超聲方法。既節(jié)能、環(huán)保，又操作方便。（4）本品方中主藥為槐角、黃芩，分別對(duì)該二味藥進(jìn)行了大量研究，結(jié)果槐角苷含量較黃芩苷含量明顯偏低，且干擾較多，故不列入質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。依《中國(guó)藥典》2015年版一部黃芩藥材項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)選擇黃芩苷作為定量指標(biāo)控制，以有效地控制本品的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)證明，采用高效液相色譜法對(duì)本品中的黃芩苷進(jìn)行定量，方法簡(jiǎn)便、靈敏，重現(xiàn)性好。為院內(nèi)制劑槐仙顆粒的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。